Articolo metodologico

Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

DOI:

10.3791/60888

⸱

3 aprile 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia che è semplice e accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato. Questo metodo utilizza stencil personalizzati tagliati al laser per micropattern proteine a matrice extracellulare in una forma di interesse per la modulazione delle morfologie cellulari. La procedura per la micropatterning è dimostrata utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le tecniche di micromodellazione sono state ampiamente utilizzate nella biologia cellulare per studiare gli effetti del controllo della forma e delle dimensioni delle cellule sulla determinazione del destino cellulare a risoluzione cellulare singola. Le attuali tecniche di micromodellazione a singola cellula all'avanguardia coinvolgono la litografia morbida e la stampa a microcontatto, che è una tecnologia potente, ma richiede competenze ingegneristiche addestrate e il supporto di alcune strutture nella microfabbricazione. Queste limitazioni richiedono una tecnica più accessibile. Qui, descriviamo un semplice metodo alternativo senza litografia: modellazione a cella singola basata su stencil. Forniamo procedure passo-passo tra cui la progettazione di stencil, la fabbricazione di idrogel poliacrilammide, l'incorporazione di proteine basate su stencil e la placcatura e la coltura cellulare. Questo semplice metodo può essere utilizzato per creare una matrice di ben 2.000 celle. Dimostriamo il modello di cardiomiociti derivati da singole cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) con forme cellulari distinte, da un quadrato 1:1 a un rettangolo adulto 7:1 cardiomiocito-come. Questo patterning a cella singola basato su stencil è privo di litografia, tecnicamente robusto, conveniente, poco costoso e, soprattutto, accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'avvento degli hiPSC e il successivo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione diretta in diversi tipi di cellule hanno permesso di studiare lo sviluppo e la malattia a livello molecolare e specifico del paziente, in particolare utilizzando cardiomiociti iPSC derivati dal paziente (iPSC-CMs) per modellare cardiomiopatie1,2. Tuttavia, una delle principali limitazioni allo studio dello sviluppo e della fisiologia utilizzando il sistema iPSC e altri modelli in vitro è l'assenza di un microambiente strutturato. In situ, le cellule sono soggette ai vincoli della matrice extracellulare (ECM), così come le cellule vicine. La particolare composizione biochimica e la rigidità di questi microambienti dettano la distribuzione spaziale delle cellule e i fattori disponibili per l'adesione cellulare. Questo, a sua volta, influenza le vie di segnalazione intracellulare, l'espressione genica e la determinazione del destino cellulare. Ad esempio, iPSC-CM micromodellato in una forma di asta simile a un adulto ha una capacità contrattile significativamente migliore, flusso di calcio, organizzazione mitocondriale, elettrofisiologia e formazione trasversa-tubulo3. Pertanto, le proprietà del microambiente sono parte integrante della regolazione delle funzioni cellulari.

Le precedenti tecniche di micromodellazione si basavano fortemente sulla fotolitografia (Figura 1A). In questa tecnica, uno strato di polimero fotosensibile, o fotoresist, viene filato su un substrato piatto dalla soluzione per formare una pellicola sottile di circa 1 m di spessore. Successivamente, la luce ultravioletta (UV) viene applicata al fotoresist attraverso una maschera contenente il modello desiderato. L'esposizione alla luce ultravioletta (UV) altera chimicamente il fotoresist modificandone la solubilità nella rispettiva soluzione per sviluppatori, trasferendo il modello desiderato dalla maschera al substrato. Molti metodi di micropatterning incorporano la fotolitografia, in quanto conferisce il nanometro al controllo a livello di micrometro sulla progettazione dei modelli cellulari. Tuttavia, la rotazione del fotoresist è altamente sensibile alle impurità, perché le particelle di polvere più piccole interromperanno la diffusione della soluzione in una pellicola sottile. La fotolitografia deve pertanto essere effettuata in strutture non contaminate, che sono costose da mantenere e richiedono particolari competenze da utilizzare. Inoltre, le sostanze chimiche utilizzate nella fotolitografia sono spesso tossiche per le cellule e possono denaturare importanti biomolecole. Pertanto, la fotolitografia pone notevoli ostacoli alla fabbricazione di micromodelli per pratiche applicazioni biologiche.

Nel 1994, Whitesides e colleghi4 hanno superato alcune delle sfide associate alla fotolitografia aprendo la strada a una raccolta di tecniche chiamate litografia morbida. Nella litografia morbida, una superficie microstrutturata realizzata con polidimetilsiloxane (PDMS), un materiale trasparente, simile alla gomma, viene utilizzata per generare un modello di proteine ECM4. Le tecniche litografiche morbide comuni includono la stampa a microcontatto e la modellazione microfluidica. Nella stampa a microcontatto, attualmente il metodo litografico morbido più diffuso, un timbro PDMS rivestito con proteine ECM trasferisce il materiale su una superficie alle aree contattate dal francobollo (Figura 1B). Nel patterning microfluidico, le microstrutture sono progettate su una superficie PDMS in modo che quando il timbro viene premuto su un substrato, viene creata una rete di microcanali, attraverso i quali i fluidi possono essere consegnati alle aree desiderate (Figura 1C)5. La litografia soft offre diversi vantaggi rispetto alla fotolitografia. Una volta che un wafer master è microfabbricato, i francobolli PDMS possono essere facilmente replicati senza ulteriore impiego di strutture per camere pulite. Inoltre, l'assenza di solventi organici nel processo di litografia morbida consente l'utilizzo di materiali polimerici come il polistirolo, tipicamente utilizzato nella coltura cellulare. Infine, la micropatterning con metodi litografici morbidi non è limitata alle superfici piatte. Così, la litografia morbida aumenta l'accessibilità e la funzionalità della fabbricazione di micropattern rispetto alla fotolitografia6. Tuttavia, la litografia morbida presenta svantaggi significativi. Ad esempio, una fase iniziale di incisione, utilizzando la fotolitografia, è ancora necessaria per microfabbricare il timbro. Inoltre, la micromodellazione con un timbro PDMS è soggetta a variazioni nella qualità del trasferimento di proteine sul substrato6. Evitare queste discrepanze richiede ottimizzazione e consistenza nella pressione applicata al timbro PDMS durante il trasferimento di proteine, altrimenti la deformazione e la distorsione delle dimensioni delle feature degli stampi PDMS possono verificarsi6. C'è anche una grande preoccupazione di utilizzare ripetutamente il PDMS a causa dell'assorbimento di piccole molecole7.

Per evitare l'uso di fotolitografia morbida e timbri PDMS, descriviamo un metodo di micropatterning a singola cellula basato su stencil e litografia che supera molti degli ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. In questo metodo, un idrogel di poliacrilammide viene utilizzato come substrato per l'incorporazione di proteine ECM a base di stencil, consentendo la placcatura selettiva di singoli hiPSC-CM. Questa tecnica è altamente compatibile con i materiali polimerici utilizzati nelle classiche condizioni di coltura cellulare. Inoltre, con una corretta pulizia e manutenzione, gli stencil sono riutilizzabili e resistenti alla degradazione e all'assorbimento delle proteine durante il processo di microfabbricazione. Infine, il processo di modellazione è tecnicamente robusto, economico, personalizzabile e accessibile a coloro che non hanno competenze di bioingegneria specializzate. Questa tecnica di micropatterning basato su stencil è stata ampiamente utilizzata nelle nostre recenti pubblicazioni modellando varie cardiomiopatie8,9,10.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabbricazione di stencil a base di poliimide a modello negativo

  1. Generare un pattern (Figura 2A) in formato .dxf utilizzando software di progettazione assistita da computer (ad esempio, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
    1. Generare un cerchio (diametro 22 mm) per delineare il bordo dello stencil.
    2. Disegnare una forma piena di pieni o il motivo desiderato.
    3. Includere una lettera chirale (ad esempio, R) per contrassegnare il lato anteriore degli stencil.
      NOTA: Ad esempio, viene generata una matrice di quadrati e rettangoli per pattern iPSC-CMs a livelli a cella singola e a coppia di celle. I file di progettazione sono disponibili (vedere File supplementari). Il limite di risoluzione della microfabbricazione è di 10 m.
  2. Inviare il progetto a un'azienda di microfabbricazione per pellicola in poliimide tagliata al laser e stampi fabbricati (Figura 2B,C).

2. Preparazione di aliquote sulfo-SANPAH

NOTA: Il protocollo viene modificato da Fischer etal.

  1. Utilizzare una scatola di stoccaggio di campioni di cartone resistente all'umidità (ad esempio, 100 pozzetto, 10 x 10 spazi per tubi centrifuga, dimensioni: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Etichettarlo come "nome/data/sulfo-SANPAH 40/ricostituito con 1.200 L di PBS".
  2. Etichettare 50 tubi di microcentrifuga (polipropilene, 1,5 mL) con una 'S' sul coperchio.
  3. Prendere 4 mL di anidro, solforo dimetilo extra secco (DMSO) e filtrare sterile la soluzione utilizzando un'unità di filtro della membrana (dimensione del poro : 0,22 m) in un tubo conico sterile da 15 mL.
  4. Preparare un bagno di azoto liquido e coprire con il coperchio per ridurre al minimo l'evaporazione dell'azoto liquido.
  5. Sciogliere 50 mg di sulfo-SANPAH in 2 mL del DMSO filtrato.
  6. Vorticare bene per sciogliere completamente il sulfo-SANPAH nel DMSO.
  7. Distribuire 40 aliquote della soluzione sulfo-SANPAH in tubi sterili da 1,5 mL.
  8. Trasferire i tubi nella scatola.
  9. Congelare i tubi in azoto liquido per 5 min.
  10. Conservare gli aliquote a -80 gradi centigradi.
    NOTA: Gli aliquote possono essere utilizzati per un massimo di 6 mesi senza una diminuzione dell'efficienza. La concentrazione di stock sulfo-SANPAH è di 25 mg/mL o 50,77 mM.

3. Sterilizzazione degli strumenti

  1. Autoclave due pinze, 24 bicchieri coverlips (22 x 22 mm, no. 1 o n. 1.5), una lama del rasoio e tre salviette assorbenti senza lafo.
    NOTA: Per realizzare 12 costrutti di idrogel, sono necessari 24 coperchi di vetro. Dovrebbero essere presenti due coverlips per costrutto. Si consiglia di preparare alcuni coverlips di ricambio.
  2. Mettere due pezzi di pellicola di paraffina (4 x 4 pollici) in una scatola di plastica resistente all'etanolo (ad esempio, una scatola di punta di 1.000 zL) e sterilizzarli in etanolo fresco del 70% per almeno 15 min.

4. Preparazione della soluzione precursore di idrogel di poliacrilammide

NOTA: il protocollo viene modificato da Lee etal.

  1. Sciogliere 125 mg di methacritillat aminoethyl (AEM) in 36,25 mL di acqua deionizzata in un tubo di centrifugazione in polipropilene da 50 mL mediante vortice.
  2. Per preparare 50 mL di 10 kPa polyacrylamide precursore (8–0,15–15 mM), mescolare 10 mL di 40% soluzione acrilamide, 3,75 mL di 2% soluzione bis-acrilamide e 36,25 mL della soluzione AEM preparata nel passaggio 4.1 in un nuovo tubo in polipropelica da 50 mL.
    NOTA: La concentrazione finale della soluzione precursore è 8% acrilammide, 0.15% bis-acrilamide, e 15 mM AEM, che è stato misurato per avere 10 kPa rigidità dalla microscopia a forza atomica. Secondo le applicazioni tissutali di interesse, la rigidità dell'idrogel può essere alterata cambiando il rapporto tra il 40% di acrilammide e la soluzione del 2% di bis-acrilamide. Ad esempio, 8% soluzione acrilammide–0.08% bis-acrilamide produce 3 kPa idrogel; 8% soluzione di acrilammide–0.48% bis-acrilammide produce 38 kPa idrogels; 8% soluzione di acrilammide-0.48% bis-acrilammide produce 60 kPa idrogel. Si consiglia di confermare la rigidità degli idrogel riforniti dalle soluzioni precursori con rapporti alterati.

5. Preparazione della soluzione fotoinitiata

  1. Per 1 mL di soluzione fotoinitiatora del 5%, sciogliere 50 mg di 2-idrossie-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone polvere in 700 l una di 100% etanolo in un tubo di centrifuga di polipropilene da 1,5 ml con coperchio.
    NOTA: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone non è solubile in acqua. Assicurarsi di sciogliere completamente la polvere in etanolo vortice.
  2. Dopo aver completamente sciolto il 2-idrossi-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-2-methylpropiophenone in etanolo mediante vortice, aggiungere 300 l di salina con buffer fosfato (PBS) per un volume finale di 1 mL.
    NOTA: La concentrazione finale di 2-idrossi-4'-(2-idrossitorossi)-2-metilpropiophenone soluzione è 5%. La soluzione fotoinititore del 5% sventata è buona per 4 settimane a 4 gradi centigradi.

6. Preparazione della soluzione proteica della matrice della membrana del seminterrato

NOTA: La matrice della membrana del seminterrato (Tabella dei materiali) è un materiale sensibile alla temperatura. Assicurati di lavorare sul ghiaccio con punte e tubi di pipetta refrigerate e soluzioni ghiacciate. Un nuovo stock di matrice della membrana del seminterrato dovrebbe essere scongelato lentamente sul ghiaccio a 4 gradi durante la notte.

  1. Preparare 200 l di soluzione di proteina a matrice di membrana seminterrato per costrutto di idrogel. Per 12 costrutti, sono necessari 2,4 mL di soluzione proteica a matrice di membrana seminterrato. Preparare il 10% di soluzione extra (ad esempio, 2,6 mL).
  2. Per ogni nuova soluzione proteica a matrice di membrana del seminterrato, ottimizzare il rapporto di diluizione. Per la prima volta, prova i rapporti di diluizione di 1:10, 1:20, 1:40 per trovare il rapporto di diluizione che produce le migliori qualità per il patterning cellulare.
    NOTA: Se la soluzione proteica della matrice della membrana del seminterrato è troppo viscosa, formerà un gel sopra lo stencil, ed è più probabile che si stacci quando si rimuove lo stencil. Se la soluzione proteica è troppo fluida, penetrerà attraverso i fori di pattern degli stencil, che si tradurrà in patterning di scarsa qualità.
  3. Soluzione di stock proteico a matrice a membrana seminterrato diluito sul ghiaccio con supporti Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) del freddo-freddo o 1x PBS al rapporto di diluizione ottimizzato sopra riportato. Ad esempio, diluire 120 l della soluzione stock in 2,4 mL di supporti DMEM/F12 (1:20) e continuare a inseguire il ghiaccio per un uso successivo.

7. Fabbricazione idrogel

  1. Collocare una lampada da banco UV (365 nm, 4 mW/cm2)in un cofano di sicurezza biologico.
  2. Posizionare le pellicole di paraffina sterilizzate dal punto 3.2 e asciugarle completamente in condizioni sterili. Se le pellicole di paraffina non sono completamente asciutte, utilizzare un sistema di aspirazione a vuoto per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Posizionare sei coverlips autoclaved dal punto 3.1 su ogni pellicola di paraffina utilizzando le pinze autoclaved.
  3. Preparare la soluzione precursore della poliacrilammide cross-link UV diluindo il 5% della soluzione fotoinititore (passaggio 5.2) con la soluzione precursore della poliacrilammide (passaggio 4.2) in un tubo di centrifugazione in polipropilene da 50 mL. Per 5 mL di soluzione precursore della poliacrilammide UV-crosscollegabile, aggiungere 50 -L di 5% di soluzione fotoinitificatore a 5 mL di soluzione precursore della poliacrilammide.
  4. Filtrare la soluzione precursore dal passaggio 7.3 utilizzando un'unità filtro da 50 mL con una dimensione dei pori di 0,22 m per la sterilizzazione.
    NOTA: Prepara sempre la soluzione precursore fresca.
  5. Distribuire 200 -L della soluzione precursore della poliacrilammide dal passo 7.4 su ogni coperchio di copertura di vetro 22 x 22 mm nella parabola Petri girata in paraffina e coprire con cura con un altro coperchio di vetro da 22 x 22 mm sulla parte superiore al sandwich la soluzione tra (Figura 3A).
    NOTA: la pellicola di paraffina viene utilizzata per evitare fuoriuscite e per limitare la soluzione precursore tra i copricopertine.
  6. Posizionare il piatto Petri contenente il coperchio dal punto 7.5 sotto la lampada da banco UV e fotopolimerizzare gli idrogel poliacrilamina per 5 min (Figura 3B).
    NOTA: Se la superficie non è bianca, l'assorbimento UV della superficie riduce l'efficienza fotocrosslinking. La copertura del white paper sulla superficie non bianca è importante per ridurre al minimo la perdita di intensità UV. Per proteggersi dalle radiazioni UV, coprire la lampada con un foglio di alluminio e indossare occhiali di protezione UV.
  7. Staccare con attenzione una copertura scivolare fuori dall'altra utilizzando una lama di rasoio con un'azione di leva (Figura 3C).
    NOTA: L'idrogel di solito si attacca al coperchio superiore. Prestare particolare attenzione quando si stacca il coperchio dall'idrogel morbido, perché è probabile che si rompa.
  8. Riempire un serbatoio di polipropilene usa e getta con PBS. Trasferire i compositi idrogel-coverslip in un serbatoio contenente PBS per sciacquare gli idrogel in PBS per 5 min. Dopo il risciacquo, riporre il costrutto idrogel sulla pellicola di paraffina nella parabola Petri.

8. coniugazione proteica

  1. Preparare un secchio di ghiaccio e precool PBS.
    NOTA: Per sei idrogel, sono necessari 1.200 l di PBS freddo.
  2. Estrarre il sulfo-SANPAH aliquota (1 fiala e 6 gel).
    NOTA: se necessario, la quantità di sulfo-SANPAH utilizzata può essere ridotta dopo l'ottimizzazione.
  3. Aggiungere 1.200 l di PBS freddo in una fiala di solfi-SANPAH e mescolare con la pipista su e giù.
  4. Distribuisci 200 - L di sulfo-SANPAH sulla pellicola di paraffina nella parabola di Petri e copri con il composito idrogel-coverslip con idrogel che contatta il sulfo-SANPAH (Figura 3D).
    NOTA: Sulfo-SANPAH è molto suscettibile all'acqua a causa dell'idrolisi. Appena scongelato da -80 gradi centigradi prima dell'uso. Non riutilizzare o ricongelare gli avanzi.
  5. Esporre l'idrogel alla lampada UV a 365 nm, 4 mW/cm2 per 5 min per attivare sulfo-SANPAH.
    NOTA: dopo l'esposizione, il sulfo-SANPAH cambierà da arancione a marrone (Figura 3E). Se l'idrogel diventa marrone, indica la corretta attivazione del gruppo fenile azide di sulfo-SANPAH e l'incorporazione di sulfo-SANPAH sull'idrogel. Procedere direttamente con i passaggi da 8,6 a 8,9 entro un massimo di 10 min, perché l'attività di sulfo-SANPAH diminuirà.
  6. Rifornire un serbatoio di polipropilene usa e getta con PBS fresco. Dopo l'attivazione di sulfo-SANPAH, trasferire gli idrogel attivati e sciacquare rapidamente gli idrogel in un serbatoio PBS per rimuovere il solfo-SANPAH non associato.
    NOTA: Un lavaggio lungo può comportare una bassa efficienza di coniugazione proteica.
  7. Dopo un rapido risciacquo, posizionare le coperture attaccate all'idrogel sulla pellicola di paraffina nei piatti Petri e tamponare con cura gli idrogel con salviette sterili senza lamino.
    NOTA: Il PBS rimanente sulla parte superiore dell'idrogel si tradurrà in perdite della soluzione di proteina matrice di membrana seminterrato attraverso lo stencil, e l'essiccazione troppo estesa porterà alla rottura dell'idrogel al momento della rimozione dello stencil a causa di un'aderenza troppo elevata allo stencil.
  8. Posizionare lo stencil sopra gli idrogel e dab con salviette autoclaved senza laminetta per garantire una tenuta stretta tra lo stencil e l'idrogel (Figura 3F).
  9. Eroga con cura 200 - L della soluzione dissoluta della proteina a matrice della membrana del seminterrato preparata dal passo 6.3 (Figura 3G) in cima. Lasciare per una notte nell'incubatrice (37 gradi centigradi).
    NOTA: Quando il contatto stencil-idrogel è stretto e la concentrazione di soluzione proteica matrice della membrana seminterrato è ottimale, la soluzione proteica matrice della membrana seminterrato sarà sequestrato e rimanere in cima allo stencil (Figura 3H). Il tempo di incubazione può essere ridotto al momento dell'ottimizzazione. Teoricamente, può essere ridotto a 30 min-2 h.
  10. Il giorno successivo, trasferire gli idrogel su una piastra 6 e immergerli completamente in PBS.
    NOTA: Si consiglia di staccare lo stencil con immersione PBS sopra il coperchio per evitare strappi e attacchi dell'idrogel allo stencil.
  11. Rimuovere con attenzione lo stencil utilizzando una pinzetta autoclaved senza strappare l'idrogel. Risospendere bene con DMEM, restituire gli idrogel a motivi geometrici all'incubatrice e lasciarli durante la notte per verificare eventuali contaminazioni.
  12. Se il supporto rimane chiaro, gli idrogel sono pronti per essere utilizzati per la placcatura cellulare. Ottimizzare la densità di placcatura cellulare e il tempo di incubazione per consentire l'adesione delle cellule per le rispettive applicazioni.
    NOTA: Per la modellazione a cella singola di hiPSC-CMs, seme e incubazione durante la notte. I seguenti numeri di cella sono consigliati per il seeding: 30.000, 60.000 e 90.000 celle/bene. Semina di troppe cellule porta a più di una cella per modello. Si raccomanda un colino cellulare per filtrare le cellule non singole prima della semina cellulare.
  13. Il giorno dopo, osservare l'attaccamento e la diffusione delle cellule, e cambiare i media per sbarazzarsi di cellule staccate.

9. Pulizia degli stencil usati

  1. Per rimuovere le proteine a matrice residua sugli stencil usati, immergi gli stencil in soluzione enzimatica (Tabella dei materiali) per 10 min a 37 gradi centigradi.
    NOTA: L'enzima deve essere selezionato a seconda delle proteine della matrice utilizzate. Per la soluzione proteica matrice ricca di collagene, utilizzare collagenae. Un 10-15 min ultrasonicazione in soluzione enzimatica è anche raccomandato.
  2. Aspirare la soluzione e ricostituire con 10% candeggina. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
  3. Risciacquare 3x con PBS.
  4. Conservare nel 70% di etanolo a 4 gradi centigradi fino all'uso.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stata dimostrata la fabbricazione di stencil contenenti una matrice di quadrati o rettangoli (Figura 4A). Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto isole di proteine a matrice modellata (Figura 4B e Figura 5A) e celle (Figura 4C). La concentrazione di soluzione proteica a matrice non ottimale ha portato a patterning non ottimale (Figura 5B). È fondamentale utilizzare i...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo di micropatterning basato su stencil privo di litografia che consente un patterning efficace delle cellule aderenti. In questo protocollo, dimostriamo la modellazione di hiPSC-CMs in diversi rapporti lunghezza-larghezza micropatternndo le isole proteiche della matrice della membrana seminterrato su idrogel di policritilmide con rigidità dei tessuti fisiologicamente o patologicamente rilevanti o substrati elastomeri a base di silicio. Questo metodo è relativamente semplice e altamente accessibile a t...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dello Stanford Child Health Research Institute (CHRI) e del National Institute of Health (1F32HL142205-01) a S.L, il NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), l'American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), lo Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, e la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , premi del National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) e Il Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, l'American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) a H.Y, e il fellowbergership Hengst a T.S. Ringraziamo il Dr. Andrew Olsen di Stanford Neuroscience Microscopy Service per il supporto dell'imaging confocale dell'hiPSC-CM micromodellato. Ringraziamo H.Y. per la prima progettazione di stencil, la fabbricazione, micropatterning a singola cellula di iPSC-CM sulla coverslip rivestita di idrogel in poliacrilamina e l'imaging confocale preliminare della struttura sarcomeda degli iPSC-CM a singola cellula.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Amminoetil metacrilato cloridrato (polvere)Sigma-Aldrich516155
Soluzione di acrilammide 40% (soluzione)Sigma-AldrichA-4058-100mL
Lampada UV da banco 365 nmUVPUVP 95-0042-07, XX-15L
Piastra di coltura BioFlexFLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NCPiastra a 6 pozzetti con substrato di elastomero siliconico
Soluzione di bis-acrilammide 2% (soluzione)Sigma-AldrichM1533-25mL
Corning copri occhiali quadrati, n. 2, W & L 22 mm & tempi; 22 mmSigmaCLS285522
Irgacure (2-Idrossi-4′-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone) (polvere)Sigma-Aldrich410896
MatrigelCorning356231proteica della matrice della membrana basale
Metilsolfossido, 99,7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS OrganicsAcros Organics326881000
Filtro Millex (13 mm) unità con membrana DuraporeMilliporeSLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0,22 & micro; m)Fisher ScientificSCGP00525
StencilPotomacdesign
Sulfo-SANPAHThermoFisher Scientific22589
TrypLE Select 10xThermoFisher ScientificA1217702Enzima utilizzato per la pulizia degli stencil
soluzione personalizzato

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  4. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
  5. Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
  6. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  7. Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
  8. Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  9. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  10. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  11. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  12. Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
  13. Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
  14. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Micropatterning basato su stencilTecnica priva di litografiaPatterning di singole celluleIdrogel di poliacrilammideAttivazione con Sulfo SANPAHMatrice della membrana basaleDifferenziamento dei cardiomiocitiCellule derivate da hiPSCControllo della forma cellulareScreening ad alta produttivit

Articoli correlati