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Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

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DOI:

10.3791/60909

⸱

12 marzo 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

In questo articolo

Sommario

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

Abstract

La fibrosi cardiaca in risposta a lesioni è una risposta fisiologica alla guarigione delle ferite. Sono stati compiuti sforzi per studiare e colpire i sottotipi di fibroblasti che mitigano la fibrosi. Tuttavia, la ricerca sul fibroblasto è stata ostacolata a causa della mancanza di marcatori fibroblasti universalmente accettabili per identificare i fibroblasti quiescenti e attivati. I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea, che li rende difficili da isolare e caratterizzare. Il protocollo presentato descrive tre diversi metodi per arricchire i fibroblasti e i miofibroblasti dai cuori dei topi illesi e feriti. L'utilizzo di un protocollo standard e affidabile per isolare i fibroblasti consentirà lo studio dei loro ruoli nell'omeostasi e nella modulazione della fibrosi.

Introduzione

I fibroblasti cardiaci, cellule di origine mesenchymica, svolgono un ruolo significativo nel mantenimento della conduzione elettrica e delle forze meccaniche nel cuore oltre al mantenimento dell'architettura cardiaca durante l'omeostasi1. A seguito di lesioni, queste cellule vengono attivate, espanse e producono proteine a matrice extracellulare (ECM)2. Molti studi preclinici hanno rivelato i fibroblasti come regolatori cellulari critici che mantengono l'integrità strutturale di un cuore ferito3 così come le principali cellule efanti responsabili della produzione incontrollata e della deposizione delle proteine ECM, con conseguente formazione rigida di cicatrici e insufficienza cardiaca4. I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, il che rende difficile sezionare la loro funzione riparativa da proprietà maladattive pro-fibrotiche. Recentemente, è stata definita l'eterogeneità funzionale di due distinti sottotipi fibroblasti a seguito di lesioni miocardiche, indicando la possibilità di isolare diversi sottotipi di fibrolazione e studiare il loro ruolo nella guarigione delle ferite5.

Ottenere una popolazione fibroblasta pura è fondamentale per delineare il loro ruolo funzionale nella riparazione e nella fibrosi. Tuttavia, la presenza di più marcatori fibroblasti che riconoscono altri tipi di cellule rendono difficile isolare una popolazione fibroblasta sostanzialmente pura6. Diversi studi eleganti hanno escogitato modi intelligenti per isolare i fibroblasti cardiaci dal miocardio illeso e ferito. Il metodo più popolare e consolidato per arricchire i fibroblasti è attraverso l'adesione selettiva dopo la digestione del tessuto enzimatico7.

Inoltre, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di fibroblasti basati su antigeni della superficie cellulare è stato descritto con successo8. Nello studio, a seguito della digestione ezimatica, le cellule mesenchymal sono state ordinate come lignaggio-negativo (Lin: Ter119-CD45-CD41)e gp38-positivo (gp38)dal cuore del mouse. Lecellule gp38 sono state confermate come fibroblaste basate sulla loro co-espressione di col1-1 e di altri marcatori mesenchymici. Anche se la maggior parte della digestione tissutale è completata dopo aver sezionato il ventricolo in un piatto di Petri, un recente studio ha studiato l'uso di una perfusione diretta dell'enzima dell'ago sinistro del ventricolo sinistro per isolare i miociti e i non miociti che includono fibroblasti9. I fibroblasti sono stati poi isolati per adesione selettiva in questo caso.

Questo protocollo descrive l'isolamento e l'arricchimento dei fibroblasti utilizzando tre metodi. Il primo è un metodo già stabilito che prevede l'adesione selettiva dei fibroblasti a seguito della digestione enzimatica. Il secondo metodo viene utilizzato per isolare principalmente il muscolo alfa liscio indotto da lesioni che esprime miofibroblasti. Il terzo metodo prevede l'esaurimento magnetico sequenziale di una sospensione cellulare cardiaca di ematopoietiche ed endoteliale. In seguito all'esaurimento, i fibroblasti/miofibroblasti sono isolati in base alla presenza dell'antigene MEFSK4 utilizzando perline magnetiche. Recentemente, MEFSK4 è stato descritto come un antigene presente sui fibroblasti quiescenti e attivati, rendendolo un marcatore adatto per l'identificazione e l'isolamento del fibroblasto. Naturalmente, tutti i metodi qui descritti hanno limitazioni uniche. Si raccomanda quindi di verificare la purezza della popolazione di cellule isolate mediante analisi del flusso, immunostaining e PCR semi-quantitativo in tempo reale. Tuttavia, queste metodologie possono essere ampliate, e ulteriori marcatori possono essere aggiunti al fine di escludere altre popolazioni contaminate prima di utilizzare le popolazioni di fibroblasti e miofibromi per esperimenti cruciali.

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Protocollo

Questo studio sostiene rigorosamente le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health. Il Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee ha approvato il protocollo (numero di protocollo: M1600076-01).

1. Dissezione del cuore

  1. Preparazione della soluzione
    1. Buffer KHB
      1. Utilizzando una barra di agitazione, sciogliere lentamente 9,4 g di polvere tampone Krebs-Henseleit (KHB) in 900 mL di acqua DDI.
        NOTA: Buffer precipiterà se mescolato troppo rapidamente o per troppo tempo. Il buffer KHB deve essere freddo durante l'isolamento del fibroblasto.
      2. Aggiungere 2,9 mM CaCl2 e 24 mM NaHCO3. Regolare il pH a 7,2–7,3 e diluire fino a un volume di 1 L con dH2O.
      3. Utilizzando un filtro sterile (0,22 m), conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane. Tenere sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi per tutta la durata dell'isolamento.
    2. Cocktail per la digestione di collagene
      1. Preparare il cocktail di digestione il giorno dell'isolamento del fibroblasto. Determinare il volume appropriato del cocktail di digestione in base al numero di cuori; 5 mL di cocktail per 1 cuore.
      2. Preparare la miscela di collagena (vedere Tabella dei materiali)e DNase I secondo le istruzioni del produttore.
      3. Per 20 mL di cocktail di digestione totale, aggiungere 17,5 l'una di DNase I, 180 l una di 1 M HEPES e 500 l di collagenasi in un tubo conico vuoto da 50 mL.
      4. Aggiungere un volume sufficiente di Hank's Balanced Salt solution (HBSS) con Ca2 e Mg2 per ottenere un volume totale di 20 mL.
    3. Buffer di lisi a i globuli rossi (RBC)
      1. Determinare il volume totale necessario in base al numero di cuori (5 mL/cuore). Diluire il buffer di lisi 10x RBC a 1x utilizzando dH2O.
    4. Supporti fibroblasti: 10% FBS in DMEM F-12
      1. Aggiungi 10% FBS a DMEM-F12 con L-glutamine e HEPES. Aggiungere 10 U/mL penicillina/streptomicina, 2,5 g/mL antifungini e 2,5 g/mL micoplasma profilati (vedere Tabella dei materiali). Conservare a 4 gradi centigradi.
  2. Dissezione cardiaca
    1. Preparare un 6 pozzo sul ghiaccio con 2 mL di KHB freddo per conservare i cuori durante la dissezione. Utilizzare forbici e pinze chirurgiche autoclalate.
    2. I topi eutanasi a 12 settimane di età o più anziani da sovradosaggio di isoflurane, e seguono con lussazione cervicale.
    3. In alternativa, per l'isolamento fibroblasto attivato, indurre l'infarto miocardico in topi di 12 settimane da legatura coronaria10. Eutanasia i topi 8-10 giorni dopo l'infortunio.
    4. Spruzzare il corpo con il 70% di etanolo e orientarsi in modo che il lato ventrale sia rivolto verso lo sperimentatore. Bloccare o bloccare le appendici per evitare interferenze.
    5. Tagliare la pelle addominale e il muscolo aperto, ma evitare di perforare il fegato. Tagliare verticalmente verso lo sterno e aprire con cura il torace evitando il piercing del cuore. Continuare a tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore.
    6. Usando le pinze, sollevare delicatamente il cuore dal torace, tagliando via qualsiasi tessuto polmonare o in eccesso attaccato all'esterno del cuore. Rimuovere il ventricolo e mettere in un pozzo di 6 ben placcato con KHB freddo. Continuate a sezionare i cuori in questo modo fino a quando tutti i campioni sono stati isolati.
  3. Dissociazione enzimatica del cuore
    1. Utilizzando pinze, ripetutamente spremere e agitare il cuore in KHB per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire il cuore in una piastra pulita sterile 10 cm2. Utilizzando una singola lama di bordo, macinare rapidamente il cuore in piccoli pezzi.
    2. Aggiungere 1 mL di cocktail per la digestione di collagenasi e continuare a maciare fino a quando i pezzi sono abbastanza piccoli da essere trasferiti con una micropipetta da 1 mL. Trasferire i pezzi in un tubo conico da 50 mL con una micropipetta da 1 mL. Lavare il piatto 2x con 2 mL di cocktail di digestione di collagenae.
      NOTA: Tagliare una parte della punta della pipetta può aiutare a raccogliere pezzi di cuore più grandi che altrimenti potrebbero rimanere bloccati nella punta della pipetta.
    3. Incubare tubo conico a 37 gradi centigradi per 30 min con dondolo o agitazione. Tubo sicuro in base alle esigenze. Risospendere 10x con un pipet da 5 mL fino a quando il contenuto non è omogeneo e incubare il tubo conico a 37 gradi centigradi per 15 min con rotazione o agitazione.
    4. Risospendere 10x con un pipet da 10 mL fino a quando non è omogeneo. Prime un colino cellulare da 40 m bagnando il filtro con 1-2 mL di tampone KHB sopra un nuovo tubo conico da 50 mL. Aggiungere 25 mL di buffer KHB alla sospensione della digestione, alla sospensione e filtrare attraverso un colino cellulare di 40 m innescato. Modificare il filtro in base alle esigenze.
      NOTA: con il rallentamento della filtrazione, la filtrazione del tubo o l'utilizzo di una micropipetta da 1 mL per estrarre le sospensioni dalla parte inferiore del filtro può aiutare la sospensione cellulare a passare attraverso un colino cellulare parzialmente bloccato da 40 m.
    5. Centrifuga a 400 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet nel buffer di lisi RBC 1x (5 mL/cuore). Incubare per 2 min a temperatura ambiente (RT).
    6. Centrifuga a 400 x g e RT per 10 min. Rimuovere il supernatante e poi lavare ripartendo il pellet in 1 mL di buffer KHB.
    7. Aggiungere 9 mL di tamponi KHB e filtrare con il colino da 40 m innescato in un nuovo tubo conico da 50 mL. Centrifuga a 400 x g e RT per 10 min.
    8. Rimuovere il supernatante, risospensione in 1 mL di supporti fibroblasti o PBS, e determinare il numero di cellulare. I fibroblasti possono essere isolati con i tre diversi metodi descritti di seguito.

2. Isolamento dei fibroblasti dalla sospensione a cella singola

  1. Isolamento fibroblasto: placcatura differenziale (Figura 1)
    1. Preparare una piastra di 6 pozzetti aggiungendo 2 mL di supporti fibroblasti per pozzo e vorticoso la piastra per coprire il fondo del pozzo.
    2. Risospendere le cellule in 1 mL di supporti per cuore. Piastra 1 mL di sospensione cellulare per pozzo tale che un cuore (teoricamente) viene placcato per bene. Ad esempio, sei cuori sarebbero stati risospesi in 6 mL di supporti, quindi placcati in sei pozzetti con 1 mL di sospensione cellulare per pozzo.
    3. Piastra a swirl per distribuire uniformemente le cellule. Aggiungere un ulteriore supporto da 1–2 mL per pozzo per un volume totale fino a 5 mL per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 4 h.
    4. I fibroblasti saranno separati dall'adesione selettiva dopo 4 h. Rimuovere le cellule non attaccate e morte rimuovendo i supporti. Lavare le cellule attaccate con 2 mL di PBS e aggiungere supporti fibroblasti sterili da 2 a 4 mL per ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi fino a confluente. Cambia i media ogni 2-4 giorni.
  2. Isolamento fibroblasto: FACS utilizzando un modello di topo di reporter GFP (Figura 1)
    1. BUFFER FACS
      1. Preparare 15 mL del siero bovino fetale 5% (FBS) in dPBS senza Ca2 e Mg2. Conservare sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
    2. Soluzione di blocco FC
      1. Preparare il blocco 0,5 di FC (cd16/CD32 antito-topo purificato) in 25 - L di FACS (1:50 didiluizione). Per ogni campione sono necessari 25 l-L di soluzione di blocco FC. Conservare sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
    3. Preparazione del campione e colorazione degli anticorpi
      NOTA: Le diluizioni anticorpali possono essere preparate in anticipo, ma ciò può rischiare l'esposizione alla luce o alla temperatura.
      1. Preparare 7AAD o Ghost tinrito viola 510 che è 2 volte la diluizione richiesta nel buffer FACS. Vedere tabella 1 per gli anticorpi e le diluizioni.
      2. Risospendere 500.000 cellule appena isolate in una soluzione di blocco 25 -L per evitare il legame non specifico della regione anticorpale FC a un recettore FC. Incubare per 5 min a RT.
      3. Aggiungere l'anticorpo 7AAD o Ghost dye violet 510 al volume finale di 25 -L di sospensione cellulare. Incubare per 30-60 min sul ghiaccio al buio.
      4. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 500 x g per 5 min a 4oC.
      5. Risospendere il pellet nel volume di campione di citometria di flusso raccomandato di TAC buffer (300 ) e trasferire al tubo di citometria di flusso.
    4. Ordinamento delle celle attivato dalla fluorescenza (FACS)
      N.B.: I topi dei reporter GFP-SMA sono stati un contributo del Dr. Ivo Kalajzic11. Questo topo esprime GFP sotto il promotore di cellule muscolari lisce alfa. SMA è stato utilizzato come marcatore di fibroblasti attivati (miofibroblasti)12.
      1. Per l'isolamento fibroblasto attivato (SMA che esprime miofibroblasto), indurre l'infarto miocardico in 12 polpe GFP-zMA di 12 settimane per legatura coronarica. Sacrificare i topi 8-10 giorni dopo l'infortunio.
      2. In seguito alla sospensione di una singola cellula dai cuori dei topi feriti, smista i fibroblastisMA-ve per la proteina fluorescente verde (GFP). Utilizzare fibroblasti non levighi non macchiati per impostare il segnale di fondo nel canale GFP post-com-com-com-compenso.
      3. Gate perle cellule GFP dal vivo, gating per 7AAD-ve/GFP-ve cellule o Ghost dye viola 510-ve/GFPcellule ve e ordinare GFP esprimendo sMA-ve miofibroblasti. Raccogliere le cellule in supporti fibroblasti.
  3. Isolamento fibroblasto: isolamento magnetico dei fibroblasti basato sul perline (Figura 1)
    1. Buffer di equilibratione
      NOTA: Preparare sempre il buffer aggiornato per gli isolamenti.
      1. Preparare lo 0,5% DI BSA e 2 mM EDTA in PBS. Degas il buffer mescolando la soluzione mentre si collega un vuoto al coperchio del contenitore.
        NOTA: La mescolatura rimuove il gas in eccesso dalla soluzione che viene poi rimossa attraverso il vuoto in modo che le bolle non intasino la colonna di separazione al momento dell'uso.
    2. Etichettatura magnetica: CD45- cellule ematopoietiche
      1. Centrifugare le cellule isolate dai cuori dei topi a 500 x g per 5 min, quindi rimuovere il supernatante.
      2. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone equilibrato. Contare le cellule usando un emocitometro.
      3. Centrifugare la sospensione cellulare come sopra e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 90 equilibration buffer per 1 x 107 cellule totali. Aggiungete 10 l di CD45, perline magnetiche per 1 x 107 celle totali. Mescolare bene e incubare per almeno 15 min a 4 gradi centigradi.
      4. Lavare le cellule aggiungendo 2 buffer di equilibratione mL per 1 x 107 cellule totali, quindi centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
      5. Rimuovere supernatante, contare le cellule utilizzando un emocitometro e respendere fino a 1 x 107 cellule totali in 2 mL di buffer equilibration. Se sono presenti più di 107 celle, scalare il buffer in modo lineare. Passare le celle attraverso un filtro di 40 m per evitare che le aggregazioni di celle intaschino la matrice della colonna di separazione.
    3. Separazione magnetica: CD45- cellule ematopoietiche
      1. Posizionare la colonna di separazione nel campo magnetico di un separatore equilibrato adatto e colonna di equilibrate con almeno 3 mL di PBS.
      2. Raccogliere le celle senza etichetta nel flowthrough (FT) e lavare la colonna 3x con 3 mL di buffer equilibration. Raccogliere gli washes con FT. Rimuovere la colonna dal separatore. Posizionare la colonna su un tubo conico da 15 mL.
      3. Svuotare le cellule CD45 etichettate magneticamente con il CD45, con la pipettatura di 5 mL equilibrati del tampone sulla colonna e immergendo saldamente le cellule con uno stantuffo fornito con la colonna.
      4. Centrifuga eluente e FT / frazioni di lavaggio a 500 x g. Contare le cellule usando un emocitometro.
    4. Etichettatura e separazione magnetica: CD31- cellule endoteliali
      1. Ripetere il protocollo per il CD45, etichettatura magnetica e separazione (sezioni 2.3.2–2.3.3), ad eccezione di CD31- perline magnetiche per incubare con la FT e lavare le porzioni dall'isolamento+ CD45.
    5. Etichettatura e separazione magnetica: MEFSK4- fibroblasti
      1. Ripetere il protocollo per CD45- etichettatura magnetica utilizzando l'anticorpo MEFSK4 anti-alimentatore-APC al posto dei perline magnetiche. Centrifugare le porzioni FT e Lavaggio dal CD31- isolamento a 500 s g per 5 min, quindi rimuovere supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone equilibrato e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
      2. Aggiungete 10 l di anti-alimentatore-APC MEFSK4 per 1 x 107 cellule. Incubare per almeno 15 min a 4 gradi centigradi.
      3. Lavare le cellule legate all'anticorpo MEFSK4 aggiungendo 5 mL di buffer equilibration per 1 x 107 cellule totali, quindi centrifugare a 500 x g per 5 min.
      4. Rimuovere supernatante e resuspend in perline anti-APC, utilizzando lo stesso volume di anti-alimentatore-APC MEFSK4 utilizzato. Incubare sul ghiaccio per 15 min a 4 gradi centigradi.
      5. Centrifuga a 500 x g per 10 min. Rimuovere supernatante, remettere in 2 mL di buffer per 1 x 107 cellule totali, e procedere con la separazione magnetica come descritto in precedenza (sezione 2.3.3). I fibroblasti MEFSK4-ve/ CD45-ve/CD31-ve possono essere utilizzati per analisi di purezza e altre applicazioni a valle.

3. Analisi della purezza e della funzionalità della popolazione fibroblasta isolata

  1. Analisi della purezza della popolazione FACS: analisi delle cellule SMA-GFP (Figura 2)
    1. Risospendere le cellule appena isolate in una soluzione di blocco da 25 litri di Fc per evitare il legame non specifico degli anticorpi. Incubare per 5 min a RT.
    2. Opzionale: aggiungere 25 L di 7AAD o Ghost dye violet 510 alla sospensione cellulare. Incubare per 30-60 min sul ghiaccio al buio.
    3. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 500 x g per 5 min.
    4. Risospendere il pellet in 50 l di buffer FACS. Aggiungere gli anticorpi CD31-PE, CD45-APC e AN2/NG2 direttamente alla sospensione cellulare. Incubare per 15 min sul ghiaccio (Tabella 1).
    5. Lavare con la risospensione in buffer FACS da 1 mL. Centrifuga a 400 x g per 5 min.
    6. Aggiungere l'anticorpo secondario AlexaFluor 405 anti-ratto anti-tono alle cellule etichettate con anticorpo primario non coniugato. Incubare per 30 min sul ghiaccio.
    7. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 400 x g per 5 min.
    8. Risospendere il pellet nel volume di campione di citometria di flusso raccomandato di TAC buffer (300 ) e trasferire in un tubo di citometria di flusso etichettato per l'analisi del flusso.
      NOTA: L'analisi FACS per caratterizzare l'espressione dell'antigene MEFSK4 sui fibroblasti isolati è descritta nella sezione 3.3.
  2. Analisi della purezza della fibroblasta: immunofluorescenza (Figura 3A)
    1. Semina 30.000 fibroblasti primari (P0-P1) per bene su copricapi posizionati in una piastra e coltura di 24 pozzetti fino all'80% di confluente. Oppure concentrare le+ celle (30.000 cellule per pozzo) su un coverslip di cytospin a 400 x g (un metodo utilizzato per depositare le cellule direttamente e uniformemente su un coperchio in una piastra di 24 pozzetti).
    2. Fissare le cellule con acetone freddo per 15 min.
    3. Bloccare i vetrini nel siero di capra del 10%. Incubare vetrini con anticorpi primari durante la notte (Tabella 2).
    4. Lavare le vetrine 3x in PBS. Incubare anticorpi secondari per 2 h (Tabella 2).
    5. Controstain diapositive, e montare con una goccia di DAPI in supporto di montaggio a dissolvenza lenta.
  3. Analisi della purezza della popolazione FACS: sondaggio MEFSK4 (Figura 3B)
    1. Risospendere le cellule appena isolate in una soluzione di blocco 25 -L per evitare il legame non specifico degli anticorpi. Incubare per 5 min a RT.
    2. Opzionale: aggiungere 25 L di 7AAD o Ghost dye violet 510 alla sospensione cellulare. Incubare per 30-60 min sul ghiaccio al buio.
    3. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 500 x g per 5 min.
    4. Risospendere il pellet in 50 l di buffer FACS. Aggiungere l'anticorpo MEFSK4 direttamente alla sospensione cellulare. Incubare per 15 min sul ghiaccio (Tabella 1).
    5. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 400 x g per 5 min.
    6. Aggiungere il ratto IgG-APC alle cellule (Tabella 1). Incubare per 30 min sul ghiaccio.
    7. Lavare con la ripresa in 1 mL di tampone FACS. Centrifuga a 400 x g per 5 min.
    8. Risospendere il pellet nel volume di campione di citometria di flusso raccomandato di TAC buffer (300 ) e trasferire al tubo di citometria di flusso per l'analisi del flusso.
  4. Analisi della purezza del fibroblasto: rtPCR semi-quantitativo in tempo reale (Figura 3C)
    1. Isolamento dell'RNA e PCR semiquantitativo in tempo reale
    2. Dopo l'arricchimento dei fibroblasti, isolare l'RNA utilizzando un kit di isolamento rna (vedere Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del produttore.
    3. Completare la sintesi del DNA del primo filamento utilizzando un kit di sintesi cDNA (vedere Tabella dei materiali),seguendo le istruzioni del produttore.
    4. Eseguire PCR5semiquantitativa in tempo reale .
  5. Analisi della funzionalità fibroblasta: analisi della contrattilità del gel di collagene (Figura 4)
    1. Soluzione di collagene
      1. Preparare 20 mM HEPES e 44 mM NaHCO3 in DMEM. Aggiungere 1,67 mg di collagene di ratto di tipo 1 per 1 mL di DMEM con HEPES e NaHCO3.
    2. DMEM con supplemento TGF
      1. Preparare 10% FBS in DMEM integrato con antibiotici e anti-fungini. Aggiungere il TGF a una concentrazione finale di 1 ng/mL.
    3. Miscela di cellule/collagene e placcatura
      1. Preparare la sospensione cellulare (P3-P5) e determinare il volume necessario per ottenere 3,3 x 105 celle.
      2. Aggiungere il volume delle sospensioni con 3,3 x 105 celle alla soluzione di collagene sufficiente per ottenere 1 mL di volume totale.
        NOTA: la concentrazione di tipo 1 di collagene di ratto dovrebbe essere 1,5 mg/mL.
      3. In una piastra di 48 pozzetti, semi 300 l di miscela di collagene cellulare per pozzo (1 x 105 cellule/bene). Incubare a 37 gradi centigradi per 15-20 min fino a geldare.
      4. Utilizzare un ago da 30 G per aiutare a separare il gel dalle pareti del pozzo. Aggiungete in ogni pozzo 600 l di TGF e FBS. Piastre di immagini su uno scanner riflettente a 24 h e 48 h.
        NOTA: tutti gli esperimenti di immunofluorescenza sono stati eseguiti su una macchina a citometria di flusso dotata di tre laser (405 nm, 488 nm e 640 nm). I dati sono stati acquisiti utilizzando un software di acquisizione dei dati di flusso (Tabella dei materiali). Un'ulteriore analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software di analisi dei dati di flusso. AlexaFluor 405 e Ghost Dye Violet 510 sono stati entusiasti con il laser da 405 nm e raccolti utilizzando rispettivamente un filtro 450/50 BP e 525/50 BP. GFP e PE sono stati entusiasti del laser da 488 nm e raccolti utilizzando i filtri 530/30 BP e 575/26 BP, rispettivamente. APC o AlexaFluor 647 è stato entusiasmato dal laser da 640 nm e raccolto utilizzando un filtro a 670/14 BP. Tutti gli esperimenti di selezione delle cellule sono stati eseguiti su una macchina di citometria di flusso (Tabella dei materiali) dotata di quattro laser (405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm). 7-AAD è stato entusiasta di utilizzare il laser 561 nm e raccolto con un filtro 670/14 BP. GFP e Ghost Dye Violet 510 sono stati raccolti utilizzando le stesse combinazioni laser/filtro descritte sopra. Tutti gli esperimenti di selezione hanno utilizzato un ugello da 100 mpuz con una configurazione di pressione di 17 psima per una maggiore vitalità a valle delle cellule bersaglio.

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Risultati

Schema di gating di flusso che dimostra l'isolamento del miofibroblasto usando i topi dei reporter sMA-GFP
I cuori illesi non mostravano gFP rilevabili: cellule nel modello di topo del reporter SMA-GFP; quindi, sono stati utilizzati per stabilire un cancello per il segnale di fondo del canale GFP post-compensazione (Figura 2). Lecellule sono state ordinate in base alla presenza di espressione GFP dal ventricolo sinistro ferito 10 giorni dopo l'MI. Un...

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Discussione

I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, identificato da diversi indicatori. I marcatori proteici che sono stati utilizzati per identificare i fibroblasti sono il recettore del dominio discoidina 2 (DDR2), la fibronectina, la vimentina, il collagene I e III e Thy115,16,17,18,19,20. Mentre la vimentina è stata utili...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vogliono ringraziare il Dr. Ivo Kalajzic per i topi sMA-GFP. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (NIH) con il Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sotto Il numero R21EB019509 (P.P.Y.) e lo Scientist Development Grant dell'American Heart Association sotto il numero 17SDG3630187 (S.S.). Le analisi della citometria di flusso sono state eseguite presso il VUMC Flow Cytometry Shared Resource, supportato dal Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e dal Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
Acetone
Antimicotico (Amfotericina B-solubilizzata; SigmaAldrichA9528
Albumina di siero bovino (BSA)Sigma9048-46-8
Cloruro
Citrato Tampone
Miscela di collagenasi (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI acqua
deionizzata
DMEM-F12 con L-Glutammina e tecnologie HEPESLife11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS) di Dulbecco senza Ca2+ e Mg2+Gibco13190-144
70% Bloccante FC dell'etanolo
(purificato anti-topo CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Siero fetale bovino (FBS)Life technologies16000044
10% di siero
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca2+ e Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Polvere tamponeSigmaK3753
Mycoplasma profilattico (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific 15140122
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
10x tampone per lisi dei globuli rossiMiltenyi130-094-183
Mezzidi montaggio a lenta dissolvenza
Sodio azide
Bicarbonato
TGFβ
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Tipo 1 Collagene
Antibodies
7AAD (stock: soluzione da 1 mg/mL in DMSO)Sonde molecolariA1310diluizione = 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864diluizione = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373diluizione = 1:200; RRID = AB_394819
diluizione CD31BD Biosciences553370= 1:250; RRID = AB_394816
diluizione 553076 CD45BD Biosciences= 1:250; RRID = AB_394606
COL 1&alfa; 1MD Bioproducts203002diluizione = 1:1000; RRID =
Colorante fantasma viola 510 (Formulazione: 1 uL/test in DMSO)Diluizione Tonbo Biosciences13-0870= 1:1000; RRID =
Capra anti-topo Alexa Fluor 488Sonde molecolariA11029diluizione = 1:200; RRID = AB_138404
Capra anti-coniglio-Cy3Southern Biotech4050-02diluizione = 1:200; RRID = AB_2795952
Capra anti-coniglio-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152diluizione = 1:200; RRID = AB_2307443
Capra anti-ratto Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11006diluizione = 1:200; RRID = AB_2534074
Capra anti-ratto Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247diluizione = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinaSanta CruzSC67233diluizione = 1:100; RRID = AB_2166650
diluizione VimentinSigma AldrichV2258= 1:200; RRID = AB_261856
&alfa;-actina muscolare liscia (&alfa;SMA)Diluizione Sigma AldrichA2547= 1:1000; RRID = AB_476701
Proteina specifica dei fibroblasti 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274diluizione = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Perle magneticheMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Perle magneticheMiltenyi Biotec130-087-418
Celle anti-alimentatore-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900diluizione = 1:100; RRID = AB_2660619
perline anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
Rat IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034diluizione = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405Abcamab175670diluizione = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455diluizione = 1:11; RRID = AB_2651235
Altri materiali
0,22 µ m FilterThermo Scientific723-2520
Piatto per colture cellulari da 10 cm2Corning430167
10 mL PipetFisherbrand13-678-11E
40 µ m Filtro cellulareFisherbrand22363547
5 mL PipetFisherbrand13-678-11D
Provetta conica da 50 mLFalcon352070
Piastra a 6 pozzettiCorning3506
Provette per citometria a flussoFalcon352058
Forcipe
Rocker
Lama a lama singolaPAL62-0177
chirurgiche
GFP-α SMA Reporter Topi Separatore
MACS Campo
MACS Colonna di
Vetrini coprioggetti
Qaigen Rneasy Mini KitQaigen74104
Kit di isolamento totale micro acquoso Ambion RN1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitBioRad1708891
Piastra
30G Ago
3 Macchina per citometria a flusso laser (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Flusso laser Macchina per citometria (BD FACSAria III)BD Biosciences Software per l'acquisizione dei dati di
flusso (BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences Software per l'analisi dei dati di
flusso (FlowJo Software)BD Biosciences
di calcioAcqua di capradi sodio di RattoForbici magneticoseparazionea 48 pozzetti

Riferimenti

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

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