Articolo metodologico

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

DOI:

10.3791/60912

⸱

9 febbraio 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull'agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l'eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all'interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di ogni anello mielina si attacca all'assone formando il dominio paranodale che è cruciale per le proprietà isolanti della mielina1,3. Tra i paranodi ci sono piccole lacune non mielinated chiamate nodi di Ranvier. Questi nodi sono ricchi di canali di sodio legati alla tensione (Nav), permettendo la rigenerazione e la rapida propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria4. Questa interazione stretta consente anche il supporto energetico assonale attraverso l'assorbimento neuronale di lattato da OLs5,6.

La maturazione delle cellule di lignaggio oligodendrogliale e il processo di mielinazione sono strettamente regolati dalle loro interazioni con i neuroni7. Infatti, OL e OPC, chiamati anche cellule NG2, esprimono una serie di recettori per i neurotrasmettitori, e possono ricevere input da neuroni eccitatori e inibitori, permettendo loro di percepire l'attività neuronale che può innescare la loro proliferazione e/o differenziazione nelle cellule mielinanti2. A sua volta, gli OPC/OL secernono microvescicoli e proteine nello spazio extracellulare che da solo o sinergicamente mediano le funzioni neuromodative e neuroprotettive8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le molteplici modalità di interazione tra cellule lignee e neuroni oligodendrocliali devono ancora essere completamente decifrati.

Inoltre, in diverse condizioni patologiche del SNC, gli OL sono principalmente colpiti, disturbando così la loro interazione con i neuroni. Ad esempio, nella sclerosi multipla (MS), la disfunzione neurologica è causata dalla demielinazione focale nel SNC, secondaria alla perdita di OLs che può portare a danni assonali e relativo accumulo di disabilità. La remielinazione può avvenire, anche se in misura insufficiente nella maggior parte dei casi13. I progressi compiuti nell'ultimo decennio, dovuti allo sviluppo di immunoterapie, hanno ridotto il tasso di ricaduta, ma la promozione della remielinazione rimane fino ad oggi un bisogno insoddisfatto. Come tale, una migliore comprensione del ruolo, delle funzioni e delle influenze di OLs è di particolare interesse per lo sviluppo di nuove terapie per un ampio spettro di condizioni del SNC.

Qui, descriviamo i metodi di purificazione e cultura oLs. Ciò consente un esame preciso dei meccanismi intrinseci che regolano il loro sviluppo e la biologia. Inoltre, tali colture OLaltamente arricchite permettono la produzione di un mezzo condizionato dagli oligodendrociti (OCM), che può essere aggiunto alle colture neuronali purificate per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti di OL sulla fisiologia e la connettività neuronali. Inoltre, descriviamo come implementare un sistema di cocoltura in vitro in cui gli oligodendrociti purificati e i neuroni sono combinati insieme, permettendo di affrontare i meccanismi che regolano (rielinazione.

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Protocollo

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La cura e l'uso dei ratti in questo esperimento sono conformi alle politiche e agli orientamenti istituzionali (UPMC, INSERM e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio della Comunità europea). Il seguente protocollo è stabilito per una lettiera standard di 12 cuccioli.

1. Preparazione dei flaconi (5 min)

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno prima della dissezione in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Rivestire i flaconi 150 cm2 (T150) con tappo filtrante (1 flacone per 2 cuccioli) utilizzando 5 mL di polietilenimina (PEI, 100 mg/L, vedere protocollo nel file supplementare 1).
  2. Conservare i flaconi a 4 gradi durante la notte.
  3. Risciacquare i flaconi rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile il giorno della dissezione.

2. Preparazione dei supporti (10 min)

NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Preparare 500 mL di mezzo di coltura, costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% del siero di vitello fetale (FCS) e penicillina-streptomycin (100 IU/mL).
  2. Preparare 20,6 mL del mezzo di digestione enzimatica in un tubo da 50 mL, composto da 20 mL di DMEM, 200 l di DNase (50 g/mL), 200 lofe di papaina (30 U/mL) e 200 l di L-cisteine (0,24 mg/mL).
  3. Filtrare-sterilizzare il supporto utilizzando un filtro 0,22 m.
  4. Tenere il supporto nella cappa del flusso laminare a temperatura ambiente (RT) fino alla dissezione.

3. Preparazione per la dissezione (10 min)

NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Preparare 100 mL di salina tampone di fosfato senza calcio e magnesio (PBS; 1x). Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
  2. Preparare 50 mL di soluzione 1x PBS ghiacciata integrata con 750 - L del 45% di glucosio. Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
  3. Riempire un piatto Petri da 100 mm con 1x PBS per strumenti di pulizia e tre piatti Petri da 60 mm con PBS-glucosio ghiacciato per la raccolta dei tessuti. Mettere i piatti di Petri sul ghiaccio fino alla dissezione.

4. Dissezione

NOTA: La dissezione viene eseguita da cuccioli di ratto Wistar maschi e femmine al giorno postnatale (P) 2.

  1. Al fine di fornire un ambiente sterile, assicurarsi di pulire il banco con 100% etanolo. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con 100% etanolo.
  2. Spruzzare delicatamente il collo del cucciolo con il 70% di etanolo.
  3. Utilizzare grandi forbici chirurgiche per decapitare l'animale e posizionare la testa in una parabola Petri da 100 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato.
  4. Utilizzare pinze curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana del cervello.
  5. Utilizzare pinze per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana.
  6. Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa. Mettere il cervello in una teglia Petri da 60 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato sul ghiaccio.
  7. Osservando sotto uno steromicroscopio, utilizzare pinze sottili per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali.
  8. Utilizzare le pinze sottili per separare i due emisferi cerebrali. Utilizzare le pinze sottili per staccare le meningi. Mettere le cortice cerebrali in una piastra di petri da 60 mm sul ghiaccio.
    NOTA: PBS ghiacciato è fondamentale per la corretta rimozione delle meningi.

5. Dissociazione dei tessuti

NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Utilizzare un bisturi affilato per tritare finemente le cortice cerebrali. Trasferire il tessuto macinato in un tubo da 50 mL contenente un mezzo di digestione enzimatica.
  2. Incubare per 30 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
  3. Utilizzare una micropipetta p1000 per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatica assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo da 50 mL.
  4. Utilizzare una micropipetta p1000 per aggiungere 1 mL di DMEM-10% FCS e triturare delicatamente il tessuto.
  5. Utilizzare un filtro da 70 m e un pistone di una siringa da 1 mL per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 mL.
    NOTA: Si può risciacquare il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria più volte con DMEM-10% FCS.
  6. Riempire il tubo da 50 mL con DMEM-10%FCS. Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere cellulare con 2 mL di DMEM-10%FCS.
  7. Triturare delicatamente il pellet cellulare con una micropipetta p1000 e poi con una micropipetta p200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di DMEM-10%FCS.
    NOTA: Due cervelli: un T150 e 5 mL di DMEM-10%FCS.
  8. Piastra 5 mL della sospensione cellulare su un T150 ad una densità di 1 x 105 celle / cm2. Aggiungere 20 mL di dMEM-10%FCS caldo a ogni T150. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.
  9. Rinnovare metà del mezzo di coltura dopo 6 giorni in vitro (DIV) con caldo DMEM-10%FCS.

6. Preparazione agitazione

  1. Eseguire la preparazione agitazione il giorno prima di agitare in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
  2. Rinnovare metà del mezzo di coltura aggiungendo fresco mezzo di coltura calda nel pallone e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.

7. Scuotere

  1. Cappotto tre piatti Petri da 100 mm con PEI. Conservarli a 4 gradi durante la notte.
  2. Coprire il tappo delle fiasche con pellicola paraffina e mettere i flaconi in un sacchetto di plastica. Agitare flaconi contenenti cellule gliali durante la notte a 250 giri/min a 37 gradi centigradi.
    NOTA: La prima agitazione viene eseguita a 8 DIV e si può eseguire fino a tre diversi agitazioni (vedere Figura 1 per la temporizzazione).

8. Raccolta e coltura di cellule di lignaggio OL

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Il giorno dopo aver tremato, preparare Bottenstein-Sato (BS) medio secondo la tabella 1.
  2. Risciacquare i piatti Petri rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile.
  3. Il supernatante dei flaconi di raccolta contiene principalmente cellule di lignaggio OL, ma anche alcune cellule microgliali e la piastra su piatti Petri da 100 mm non rivestiti.
    NOTA: Questa fase consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto.
  4. Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
  5. Riempire ogni pallone T150 con 25 mL di mezzo di coltura calda appena preparato e incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 fino al secondo scuotimento.
  6. Trasferire il supernatante dai piatti Petri in nuovi piatti Petri non rivestiti da 100 mm per consentire l'adesione delle cellule microgliali residue.
  7. Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
  8. Rimuovere il supernatante, che contiene celle di lignaggio OL non aderenti, e trasferirlo in tubi da 50 mL (supernatante da 2 piatti Petri per un tubo da 50 mL). Scartare piatti Petri placcati con microglia.
  9. Centrifugare il supernatante per 5 min a 423 x g. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere il pellet cellulare con 1 mL di mezzo BS. Mettere in comune tutti i pellet in un tubo comune da 50 mL e regolare il volume a 10 mL con mezzo BS.
  10. Determinare le cellule di conteggio della densità delle cellule al microscopio.
    NOTA: È necessario ottenere una densità di cella compresa tra 3 x 105/mL e 5 x 105/mL.
  11. Aggiungere 20 mL di BS se la densità cellulare è maggiore o uguale a 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 30 mL, oppure aggiungere solo 10 mL di BS se la densità cellulare è minore di 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 20 mL.
  12. Piatto due o tre pre-rivestito 100 mm Petri piatti con 10 mL di sospensione cellulare. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.
  13. Eliminare i detriti dai piatti Petri rinfrescando tutto il BS medio 2 h più tardi.
    NOTA: Esaminare la coltura al microscopio prima e dopo la compensazione per verificare la densità cellulare e l'efficienza della rimozione dei detriti.
  14. Incubare per 2 giorni in mezzo BS in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
    NOTA: Esaminare la coltura al microscopio. La confluenza dovrebbe essere dal 70% all'80%.

9. Produzione OCM

NOTA: Eseguire questi passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Preparare NB-B27basso medio secondo la tabella 2.
  2. Renew coltur medium con 10 mL di medio caldo NB-B27low. Incubare per 2 giorni in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
  3. Raccogliere l'OCM, cioè, supernatali contenenti fattori secreti OL. Filtra-sterilizzare OCM utilizzando un filtro da 0,22 m.
    NOTA: Conservare OCM a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.

10. Aggiunta OCM

NOTA: I passi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. L'OCM può essere aggiunto alle colture neuronali ippocampali purificate preparate secondo il seguente protocollo14e ottenute aggiungendo, 24 h dopo l'isolamento, gli agenti anti-mitotici uridina e 5- fluorodeoxyuridina (5 M) per 36 h.

  1. A 3 DIV, rimuovere tutto il mezzo di coltura del neurone contenente agenti anti-mitotici e aggiungere 500 - L di OCM caldo fresco.
  2. Rinnovare metà del mezzo ogni 3 giorni con NB-B27 caldo appena fatto.
    NOTA: Tali impostazioni cultura possono essere mantenute fino a 21 DIV.

11. Aggiunta di OL alla coltura neuronaca ippocampale purificata

NOTA: eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Gli OL possono essere aggiunti alle colture ippocampali purificate ottenute nello stesso modo descritto in precedenza.

  1. Preparare il mezzo di cocoltura secondo la tabella 3.
  2. Recuperare la cultura OL a 70% a 80% confluenza. Risciacquare con 2 mL di caldo 1x PBS.
  3. Per staccare le cellule, aggiungere 2 mL di 0,25% di prova in un piatto Petri da 100 mm.
  4. Incubare per 5 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
  5. Aggiungere 2 mL di DMEM-10% FCS per bloccare la reazione enzimatica. Raccogliere il super-atali contenente cellule di lignaggio OL.
  6. Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il supernatante e riattendere il pellet cellulare in mezzo di co-coltura caldo per ottenere una concentrazione di 1,25 x 105 cellule / mL.
  7. Aggiungere OL alla coltura di neuroni ippocampali purificati rimuovendo 200 gradi l di coltura neuronale medio e aggiungendo 200 l di sospensione cellulare per pozzo (2,5 x 104 cellule/pozzo) di una piastra di 24 pozzetti.
  8. Aggiorna metà del mezzo di co-cultura ogni 2-3 giorni.
    NOTA: le coculture possono essere mantenute fino a 24 DIV.

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Risultati

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In questo protocollo, le cellule di lignaggio OL vengono purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso gli astrociti e microglia. La purezza e l'esame fenotipica delle colture OL possono essere valutati immunostaining con marcatori gliali15. L'analisi dell'espressione di diversi marcatori ha indicato che le colture OL erano per lo più pre-OL con il 90% diO4 - cellule, 85% - 7% NG2, cellule, e 4.7% - 2,1% di PLP- cellule, men...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l'oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un'elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzando co...

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Dichiarazioni

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Nessuno degli autori ha interessi contraddittori o interessi contrastanti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Integratore di 5-fluorodesossiuridinaSigmaF0503
B27ThermoFisher17504044
Soluzione di D-(+)-glucosioSigmaG8769
DNasi (desossiribonucleasi I)WorthingtonLS002139
Eagle modificato di Dulbecco MediumThermoFisher31966021
etanolo 100% Sigma32221-M
Etanolo 70%VWR Chemicals83801.360
Siero fetale di vitelloThermoFisher10082147
L-cisteinaSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher21103049
PapainaWorthingtonLS003126
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher15140122
Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesioThermoFisherA1285601
Polietilenimmina (PEI)SigmaP3143
Tetraborato decaidratoSigmaB9876
TripsinaSigmaSigma
UridinaSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin umanoSigmaT1147
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinaSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
Putrescina dicloridratoSigmaP5780
Selenito di sodioSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico)SigmaT6397
T4 ( L-tiroxina)SigmaT1775
Terreni di co-coltura
apo-transferrina umanaSigmaT1147
B27 integratoreThermoFisher17504044
BiotinaSigmaB4639
BSA (Albumina sierica bovina)SigmaA4161
CeruloplasminaSigma239799
Eagle modificato di Dulbecco MediumThermoFisher31966021
IdrocortisoneSigmaH4001
InsulinaSigmaI5500
N-acetil-L-cisteinaSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
PutrescinSigmaP5780
CNTF umano ricombinanteSigma450-13
Selenito di sodioSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico)SigmaT6397
Vitamina B12SigmaV6629
Tools
0.22 µ m filtroSartorius514-7010
siringa da 1 mlTerumo1611127
Piastra di Petri da 100 mmDutscher193100
Tubo da 15 mlCorning Life Science734-1867
Tubo da 50 mlCorning Life Science734-1869
Piastra di Petri da 60 mmDutscher067003
70 micro; m filtroMiltenyi Biotec130-095-823
Microscopio binoculareOlympusSZX7
Pinze curveStrumenti per le scienze11152-10
Pinze per le scienze finiStrumenti per le scienze91150-20
Forbici chirurgiche grandiStrumenti per le scienze14008-14
BisturiSwann-morton233-5528
AgitatoreInfors HT
Piccole forbici chirurgicheFine Science Tools91460-11
Cucchiaio chirurgico piccoloBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 pallone con tappo filtranteDutscher190151
Animal
P2 Wistar ratJanvierRjHAn:WI

Riferimenti

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