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Articolo metodologico

L'imaging time-lapse di sciami batterici e la risposta allo stress collettivo

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DOI:

10.3791/60915

⸱

23 maggio 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

Dettagliamo un metodo semplice per produrre filmati time-lapse ad alta risoluzione di sciami di Pseudomonas aeruginosa che rispondono a batteriofa (fago) e stress antibiotico utilizzando uno scanner di documenti piatti. Questa procedura è un metodo semplice e veloce per monitorare le dinamiche dello sciame e può essere adattata per studiare la motilità e la crescita di altre specie batteriche.

Abstract

Lo sciame è una forma di motilità superficiale osservata in molte specie batteriche tra cui Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli. Qui, le popolazioni dense di batteri si muovono su grandi distanze in comunità a forma di tendine nel corso delle ore. Lo sciame è sensibile a diversi fattori, tra cui umidità media, umidità e contenuto di nutrienti. Inoltre, la risposta collettiva allo stress, che si osserva in P. aeruginosa che sono stressati da antibiotici o batteriofagi (fago), respinge sciami dall'avvicinarsi all'area contenente lo stress. I metodi descritti di seguito riguardano il modo in cui controllare i fattori critici che influiscono sullo sciame. Introduciamo un metodo semplice per monitorare le dinamiche dello sciame e la risposta collettiva allo stress con alta risoluzione temporale utilizzando uno scanner di documenti piano e descriviamo come compilare ed eseguire un'analisi quantitativa degli sciami. Questo metodo semplice ed economico fornisce una quantificazione precisa e ben controllata dello sciame e può essere esteso ad altri tipi di saggi di crescita a base di lamiere e specie batteriche.

Introduzione

Lo sciame è una forma collettiva di motilità batterica coordinata che aumenta la resistenza agli antibiotici e la produzione di fattori di virulenza nell'host1,2,3. Questo comportamento multicellulare si verifica su superfici semi-solide che assomigliano a quelle degli strati mucose che coprono le membrane epiteliali nei polmoni4,5. I biosurfactants sono comunemente prodotti da popolazioni brulicanti per superare la tensione superficiale sulle superfici e la produzione di questi è regolata da complessi sistemi di segnalazione cellulare, noti anche come quorum sensing6,7,8. Molte specie di batteri sono in grado di sciamare, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. I modelli brulicanti creati dai batteri sono diversi e sono influenzati dalle proprietà fisiche e chimiche dello strato superficiale tra cui la composizione dei nutrienti, porosità, e l'umidità13,14. Oltre alle proprietà della superficie, la temperatura di crescita e l'umidità ambiente influenzano diversi aspetti della dinamica dello sciame, tra cui il tasso di bruliè e modelli12,13,14,15. Le variabili di crescita che influenzano lo sciame creano sfide che influenzano la riproducibilità sperimentale e la capacità di interpretare i risultati. Qui, descriviamo un semplice metodo standardizzato per monitorare la dinamica degli sciami batterici attraverso l'imaging time-lapse. Il metodo descrive come controllare le condizioni di crescita critiche che influenzano in modo significativo la progressione dello sciame. Rispetto ai metodi tradizionali di analisi dello sciame, questo metodo di imaging time-lapse consente di monitorare la motilità di più sciami contemporaneamente durante lunghi periodi di tempo e ad alta risoluzione. Questi aspetti migliorano la profondità dei dati che possono essere ottenuti monitorando sciami e facilitano l'identificazione dei fattori che influenzano lo sciame.

Lo sciame in P. aeruginosa è facilitato attraverso la produzione e il rilascio di rhamnolipids e 3-(3-idrossi-idrossinoyloxy)accomodanti nell'area circostante6,16. L'introduzione dello stress da concentrazioni subletali di antibiotici o infezioni da virus del fago influisce sull'organizzazione di sciami. In particolare, queste sollecitazioni inducono P. aeruginosa a rilasciare la molecola di rilevamento quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, noto anche come il segnale di quinolone Pseudomonas (PQS)17,18. Nei test sciami che contengono due popolazioni di sciami, il PQS prodotto dalla popolazione indotta dallo stress respinge gli sciami non trattati dall'entrare nell'area contenente lo stress (Figura 1). Questa risposta collettiva allo stress costituisce un sistema di segnalazione di comunicazione di pericolo che avverte P. aeruginosa sulle minacce vicine18,19. Gli effetti dello stress su P. aeruginosa, l'attivazione della risposta collettiva allo stress, e la repulsione degli sciami possono essere visualizzati utilizzando il metodo di imaging time-lapse descritto qui. Il protocollo qui descritto spiega come: (1) preparare piastre di agar per brulicare, (2) cultura P. aeruginosa per due tipi di analisi (saggi tradizionali sciami o saggi collettivi di risposta allo stress) (Figura 1), (3) acquisire immagini time-lapse e (4) utilizzare ImageJ per compilare e analizzare le immagini.

In breve, P. aeruginosa da una coltura durante la notte è avvistato nel mezzo di una piastra di agar brulicante mentre P. aeruginosa che sono infettati da fago o trattati con antibiotici sono avvistati nelle posizioni satellitari. La progressione dello sciame di P. aeruginosa è monitorata su uno scanner piano piano del documento di consumo che viene collocato in un'incubatrice regolata dall'umidità di 37 gradi centigradi. Lo scanner è controllato da un software che esegue automaticamente la scansione delle piastre a intervalli regolari durante il periodo di crescita dello sciame, in genere 16-20 h. Questo metodo produce video time-lapse simultanei fino a sei piastre brulicanti di 10 cm. Le immagini vengono compilate in filmati e la repulsione di sciami da parte di popolazioni indotte da stress è quantificata utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile. Si fa particolare attenzione a garantire la coerenza e la riproducibilità tra i diversi esperimenti di brulicante.

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Protocollo

1. Preparazione piastre di agar sciame per P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging

  1. Preparare 1 L di 5x M8 supporti minimi in una bottiglia di vetro aggiungendo 64 g di Na2HPO4s 7H2O, 15 g di KH2PO4e 2,5 g di NaCl in 500 mL di acqua a doppia distillazione (ddH2O). Regolare il volume finale a 1 L con ulteriori ddH2O. Autoclave per sterilizzare e conservare i supporti liquidi a temperatura ambiente.
  2. Preparare 100 mL di 1 M MgSO4 (solfato di magnesio) in una bottiglia di vetro aggiungendo 24,6 g di MgSO4x 7H2O in 50 mL ddH2O. Regolare il volume finale a 100 mL con ulteriori ddH2O. Autoclave da sterilizzare. Conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare 100 mL di acidi casamino del 20% in una bottiglia di vetro aggiungendo 20 g di acidi di casamino in 50 mL ddH2O. Regolare il volume finale a 100 mL con ulteriori ddH2O. Autoclave per sterilizzare. Conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare 100 mL di glucosio del 20% in una bottiglia di vetro aggiungendo 20 g di glucosio in 50 mL ddH2O. Regolare il volume finale a 100 mL con ulteriori ddH2O. Sterilizzare per filtrazione con filtro 0,22 m. Conservare a temperatura ambiente.
  5. Per fare 10 piastre di agar sciante, aggiungere 1 g di agar in 100 mL di ddH2O e regolare il volume finale a 160 mL con ulteriori ddH2O in un flacone Erlenmeyer da 250 ml. Sterilizzare autoclaving.
    1. Subito dopo l'autoclaving, mettere la soluzione agar in un bagno d'acqua di 55 gradi per 15 min.
    2. Togliere la soluzione agar dal bagno d'acqua e aggiungere 40 mL di 5x M8 supporto minimo, 200 L di 1 M MgSO4, 2 mL di 20% glucosio, e 5 mL di 20% acidi casamino15. Procedere al passaggio 1.6 immediatamente dopo la miscelazione.
      NOTA: Le concentrazioni finali sono dello 0,5% agar, 1 mM MgSO4, 0,2% di glucosio e 0,5% degli acidi casamino.
  6. Utilizzando una pipetta da 25 mL per un volume costante, aggiungere 20 mL della soluzione di agar brulicante per piatto Petri di 10 cm di diametro.
    NOTA: Un volume fisso della soluzione agar è importante, in quanto il volume influisce sul tempo di essiccazione e sul contenuto di umidità dell'agar. Evitare le bolle quando si effettuano le piastre di agar brulicanti.
  7. Lasciare solidificare l'agar mettendo le piastre di agar brulicanti in un'unica pila con coperchi per 1 h sulla panca a temperatura ambiente. Accendere il deumidificatore per diminuire l'umidità relativa della stanza al 40-50% 1 h prima del passaggio successivo.
  8. Asciugare le piastre di agar brulicanti per altri 30 min con i coperchi spenti in una cappa di flusso laminare a 300 ft3/ min con un'umidità relativa del 40-50% a temperatura ambiente. Asciugare l'interno dei coperchi posizionandoli a faccia in su nel cappuccio del flusso laminare. Conservare le piastre di agar brulicanti a 4 gradi centigradi per un massimo di 24 ore.
  9. Preparare i coperchi neri da 10 cm per l'imaging levigando l'interno del coperchio con carta vetrata. Mettere i coperchi all'interno di una scatola di imballaggio e posizionare la scatola di imballaggio sotto una cappa chimica. Spruzzare all'interno dei coperchi con vernice spray nera. Lasciare asciugare i coperchi.
    NOTA: I coperchi neri possono essere riutilizzati per ulteriori esperimenti. È importante che i coperchi siano verniciati in modo che non riflettano la luce durante la scansione.

2. Crescita di P. aeruginosa e condizioni di placcatura

  1. Preparare 400 mL di brodo di lisogenità (LB) aggiungendo 10 g di miscela di polvere LB-Miller in 400 mL ddH2O. Per piatti 2% LB-agar Petri, aggiungere altri 8 g di agar. Autoclave per sterilizzare.
  2. Versare 20 mL di mezzo Fuso LB-agar in piatti Petri di 10 cm di diametro e lasciarli solidificare a temperatura ambiente durante la notte. Conservare i supporti liquidi a temperatura ambiente e le piastre di agar a 4 gradi centigradi.
  3. Streak P. aeruginosa su un piatto LB-agar Petri da un brodo congelato conservato a -80 gradi centigradi con anelli sterili o bastoncini di legno. Incubare il piatto Petri capovolto per una notte a 37 gradi centigradi. Conservare la piastra LB-agar a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
  4. Scegli una singola colonia dal piatto Petri con un anello sterile o un bastone di legno, inocularla in mezzo da 2 mL lB e incuba la coltura fino alla saturazione durante la notte (16-18 h) a 37 gradi centigradi in un rullo set a 100 giri.
  5. Pipet 5 - L of overnight culture from step 2.4 utilizzando un pipet P20 e individuare al centro della piastra di agar brulicante avvicinandosi alla punta del tubo con un angolo (10-45) 2,5 cm sopra l'area di puntamento, pipetting verso il basso fino alla prima fermata, e toccando l'agar con solo lagocciadi liquido ( Figura 1B).
    1. Evitare di toccare l'agar con la punta pipet in quanto danneggia l'agar. Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente tra diverse piastre di agar brulicanti (Supplementary Figure S1).
    2. Per i saggi tradizionali brulicanti, utilizzare solo il punto centrale e andare al passaggio 2.8. Per i saggi di risposta collettiva allo stress continuano a fare 2,6 (per l'infezione da fago) o al passo 2,7 (per lo stress antibiotico).
  6. Per l'infezione da fago, mescolare 30 ll della cultura notturna di P. aeruginosa dal passo 2,4 con 6 l di 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. Procedere immediatamente al passaggio successivo.
    1. Tubo 6 - L l della P. aeruginosa-phage miscela dal passo 2.6 utilizzando un pipet P20 e individuare in 6 posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico di 2,8 cm di raggio che è centrato alla parabola Petri avvicinandosi alla punta del tubo in un angolo (10 a 45) 2,5 cm sopra l'area di avvistamento, pipetting fino alla prima fermata, e toccando l'agar con solo il liquido).C
    2. Evitare di toccare l'agar con la punta pipet in quanto danneggia l'agar. Utilizzare un modello di placcatura per coerenza (Supplementary Figure S1). Procedere al passaggio 2.8.
  7. Per i trattamenti antibiotici, mescolare 30 - coltura durante la notte P. aeruginosa dal passo 2,4 con 6 -L di 3 mg/mL di gentamycina, 10 l un di 100 mg/mL di kanamicina o 7,5 . Procedere immediatamente al passaggio successivo.
    1. Pipet 6 - L di antibiotico trattato P. aeruginosa dal passo 2,7 utilizzando una pipetta P20 e spot in 6 posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico raggio di 2,8 cm intorno al centro del piatto avvicinandosi alla punta del tubo ad un angolo (10 a 45) 2,5 cm sopra l'area di avvistamento, pipettingverso fino alla prima fermata e toccando l'agar con solo lagocciadi liquido).
    2. Evitare di toccare l'agar con la punta pipet in quanto danneggia l'agar. Utilizzare un modello di placcatura per coerenza (Supplementary Figure S1). Procedere al passaggio 2.8.
  8. Sostituire i coperchi chiari dei pali di Petri con coperchi neri realizzati al punto 1.9 (Figura 2A).
  9. Posizionare le piastre di agar brulicanti su uno scanner in un'incubatrice posta a 37 gradi centigradi con un bagno d'acqua di 10 L per mantenere l'umidità al 75% (Figura 1E, Figura 2B).
    AVVISO: Non disturbare le cellule maculate sulle piastre di agar brulicanti. Tenere le piastre rivolte in alto in ogni momento.

3. Acquisizione di immagini con scanner

  1. Diminuire l'illuminazione ambientale dei piatti Petri collegando il tessuto opaco nero a un rack 40-60 cm sopra lo scanner di documenti piano. Fissarlo con zipcravatta( Figura 2B).
  2. Lo scanner sarà controllato utilizzando un software di scansione e un software di script automatico.
    1. Nel software di scansione, selezionare Modalità Home (Figura 3A). Acquisire immagini a colori selezionando Colore in Tipo immagine. Per impostare la qualità dell'immagine, selezionare Altro in Destinazione e regolare la Risoluzione su 300 dpi. Mantenere le dimensioni standard per le immagini selezionando Originale per Dimensioni di destinazione. Lasciare tutte le opzioni in Regolazioni immagine deselezionate per la qualità dell'immagine standard.
      NOTA: Dimensione destinazione è impostata su Originale per impostazione predefinita. Per selezionare altre opzioni per Dimensioni di destinazione, fare clic su Anteprima prima.
  3. Impostare il percorso di salvataggio delle immagini facendo clic sull'icona della cartella a destra di Scansione per aprire Impostazioni salvataggio file (Figura 3A).
    1. Selezionare la destinazione della cartella per il salvataggio delle immagini selezionando Altro in Posizione e fare clic su Sfoglia. Scegliere una cartella in cui salvare le immagini.
    2. Assegnare un nome alle immagini nella casella di testo Prefisso. Impostare Numero iniziale 001 per iniziare la sequenza di denominazione per le immagini. Impostare il formato di file su JPEG scegliendo JPEG (.jpg) per Tipo in Formato immagine e fare clic su Opzioni da regolare per Dettagli. Impostare la qualità del formato immagine impostando Livello di compressione su 16, Codifica su Standard e selezionare Incorpora profilo ICC. Fare clic su OK per chiudere la finestra(Figura 3B).
    3. Lasciare deselezionata la prima opzione ("Sovrascrivi tutti i file con lo stesso nome") e selezionare le 3 opzioni successive ("Mostra questa finestra di dialogo prima della scansione successiva", "Apri cartella immagine dopo la scansione" e "Mostra finestra di dialogo Aggiungi pagina dopo la scansione"). Fare clic su OK per chiudere la finestra
    4. Controllare la qualità dell'immagine facendo clic su Anteprima. Viene visualizzata la finestra di anteprima e l'icona Scansione diventa funzionale (Figura 3C).
  4. Utilizzare il software di scripting per automatizzare l'acquisizione dell'immagine. Lo script fornito fa clic su Scansione nella finestra Scansione e su OK nella finestra Impostazioni salvataggio file a intervalli di 30 min.
    1. Importare lo script facendo clic su Attività Importare e selezionare sia Single_scan.tsk che Idle_scanning.tsk (file TSK forniti come file supplementari 1 e 2). Vedere La figura 3D.
      NOTA: Single_scan.tsk fa clic sul pulsante Scansione nella finestra Scansione e su OK nella finestra Impostazioni salvataggio file. Idle_scanning.tsk attiva Single_scan.tsk ogni 30 min. È possibile modificare la frequenza di scansione modificando l'attivazione di Idle_scanning.tsk.
    2. Abilitare la scansione automatica a intervalli di 30 minuti selezionando sia la scansione inattiva (importata) che la scansione singola (importata),facendo clic con il pulsante destro del mouse su Idle scanning (imported)e facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su Abilitato (Figura 3D, Figura supplementare S2).
      NOTA: la scansione automatica viene eseguita fino a quando l'utente non interrompe manualmente lo script. Per interrompere lo script, selezionare Idle scanning (imported), fare clic con il pulsante destro del mouse su Idle scanning (imported)e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Abilitato. Il segno di spunta verrà rimosso.

4. Compilazione di immagini time-lapse e misurazione della repulsione dello sciame

  1. Eseguire l'editing di filmati e l'analisi delle immagini utilizzando ImageJ.
  2. Importare tutte le immagini digitalizzate in ImageJ facendo clic su File Proprietà Import . Sequenza immagine e selezionare le immagini. Nella finestra Opzioni sequenza, selezionate Converti in RGB per mantenere le immagini a colori. Il numero di immagini indica il numero di immagini selezionate.
  3. Keep Inizio immagine a 1 per iniziare dalla prima immagine della cartella e Ridimensiona le immagini al 100% per risparmiare le dimensioni originali delle immagini. Lasciare l'opzione Usa pila virtuale deselezionata. Fare clic su OK e attendere il caricamento delle immagini (Figura 4A).
  4. Impostare il livello di compressione video su 100 facendo clic su Modifica Proprietà Options (Opzioni) . Ingresso/Uscita... e regolare la qualità JPEG a 100.
  5. Salvare il file come file .avi facendo clic su File Proprietà Save As AVI. Regolare la compressione in formato JPEG e frequenza fotogrammi a 5 fps(Figura 4B). Salvare il time-lapse .avi nella cartella desiderata.
  6. Per quantificare le distanze di repulsione dello sciame, aprire un'immagine verso la fine del periodo brulicante in ImageJ. Fare clic su File Aprire e selezionare l'immagine. Regolare la scala facendo clic su Analizza Impostare Scala e impostare Distanza in pixel su 118, Distanza nota su 1, Proporzioni pixel a 1,0 e Unità di lunghezza su cm (Figura 4C). Lasciare globale deselezionato. Fare clic su OK per chiudere la finestra.
  7. Fare clic sull'icona Dritto e misurare dal centro della colonia nella posizione satellitare fino al bordo della popolazione brulicante. Selezionare Analizza . Misurare per fare in modo che venga visualizzata una nuova finestra con le misure (Lunghezza)(Figura 4D).
    NOTA: utilizzare il tasto "-" per ingrandire e "-" per eseguire lo zoom indietro.

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Risultati

I passaggi per far crescere P. aeruginosa,stressare le cellule e immagine le piastre di agar brulicanti sono rappresentati nella Figura 1. Abbiamo inoculato una singola colonia di ceppo selvatico di P. aeruginosa UCBPP-PA14 da una piastra LB-agar in 2 mL di brodo LB durante la notte a 37 gradi centigradi e abbiamo individuato 5 l al centro della piastra di agar brulicante. L'imaging time-lapse di questa piastra rivela la crescita iniziale sotto forma di colonia al centro e poi la diffus...

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Discussione

Questo protocollo si concentra sulla riduzione al minimo della variabilità nelle piastre di agar brulicanti e sulla fornitura di un metodo semplice e a basso costo per acquisire immagini time-lapse di P. aeruginosa brulicante e rispondendo allo stress. Questa procedura può essere estesa per l'immagine di altri sistemi batterici adattando la composizione dei media e le condizioni di crescita. Per P. aeruginosa, anche se M9 o FAB mezzo minimo può essere utilizzato per indurre sciami16

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. scritto e rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno progettato gli esperimenti. J.--L.B. ha eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH K22AI112816 e R21AI139968 ad A.S. e dall'Università della California. N.M.H-K. è stato supportato da Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella decisione di presentare i lavori per la pubblicazione. Non abbiamo interessi contrastanti da dichiarare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
Bacto agar, disidratatoBD Difco214010Per piastra LB-agar e piastra di agar sciamatura
Acidi CasaminoBD Difco223050Per mezzi di sciamatura
D-glucosioFisher ChemicalD16500Destrosio. Per terreni di sciamatura
Fosfomicina sale disodicoTokyo Chemical IndustryF0889Concentrazione di base: 200 mg/mL. Disciolto in ddH2O
Gentamycin solfatoSigma-AldrichG1914Concentrazione di base: 3 mg/mL. Disciolto in ddH2O
Kanamicina solfatoSigma-Aldrich60615Concentrazione di riserva: 100 mg/mL. Disciolto in ddH2O
LB-MillerBD Difco244620Per brodo LB e piastre LB-agar
Solfato di magnesio eptaidratoSigma-Aldrich230391Per terreni di sciamatura
Fosfato di potassio monobasicoSigma-AldrichP0662Per 5 terreni M8
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888Per 5 terreni
M8Sodio fosfato bibasico eptaidratoFisher ChemicalS373Per 5x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labAFS27E.118PA14 ceppo
DMS3virO'Toole labDMS3vir20Batteriofago
< strong>Forniture
alluminio3M150 FinePer coperchi neri
Tessuto neroJoannPRD7089Tessuto nero
Vernice spray neraKrylon5592 Nero opacoPer coperchi neri
Pallone ErlenmeyerKimax26500250 mL
Flaconi di vetroPyrex13951L250 mL, 500 mL, 1.000 mL
Fascette da 8 polliciGardner BenderE173770in tessuto nero opaco
(100 mm x 15 mm)FisherFB0875712Piastre in polistirene da 100 mm x 15 mm
Bastoncini di legnoFisher23-400-102Per striature e inoculazione di batteri
Equipment
AutoclaveMarket Forge IndustriesSTM-EPer la sterilizzazione dei reagenti
Pipetta da 25 mlUSA Scientific, Inc.1072-5410Per pipettare 20 mL per piastre di agar sciamate
DeumidificatoreFrigidaireFAD704DWD 70 pintePer mantenere l'umidità relativa della stanza a circa il 45%
ImageJNIHv1.52aSoftware per l'analisi delle immagini
IncubatoreVWR89032-092Per la crescita di batteri a 37 ° C
Isotemp bagnomariaFisher15-462-21QPer fluidi di raffreddamento fino a 55 gradi C
Cappa a flusso laminareThe Baker CompanySG603APer l'essiccazione di piastre
Pipetta P-20GilsonF123601Spotting su piastre di agar sciamate
PipettaController BrandTechaccu-jetPer pipettare 20 mL per piastre di agar sciamate
Tamburo a rulliNew BrunswickTC-7Per la crescita di batteri a 100 giri/min
ScannerEpsonScanner fotografico Epson Perfection V370per lastre ai fosfori
Software di automazione dello scannerRoboTask Litev7.0.1.932Per 30 minuti di imaging interno
Software di acquisizione delle immagini dello scannerEpsonv9.9.2.5USSoftware per lastre ai fosfori
Carta vetrata all'ossido di Per il fissaggio di piastre di Petri

Riferimenti

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