Dettagliamo un metodo semplice per produrre filmati time-lapse ad alta risoluzione di sciami di Pseudomonas aeruginosa che rispondono a batteriofa (fago) e stress antibiotico utilizzando uno scanner di documenti piatti. Questa procedura è un metodo semplice e veloce per monitorare le dinamiche dello sciame e può essere adattata per studiare la motilità e la crescita di altre specie batteriche.
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Articolo metodologico
L'imaging time-lapse di sciami batterici e la risposta allo stress collettivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sciame è una forma di motilità superficiale osservata in molte specie batteriche tra cui Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli. Qui, le popolazioni dense di batteri si muovono su grandi distanze in comunità a forma di tendine nel corso delle ore. Lo sciame è sensibile a diversi fattori, tra cui umidità media, umidità e contenuto di nutrienti. Inoltre, la risposta collettiva allo stress, che si osserva in P. aeruginosa che sono stressati da antibiotici o batteriofagi (fago), respinge sciami dall'avvicinarsi all'area contenente lo stress. I metodi descritti di seguito riguardano il modo in cui controllare i fattori critici che influiscono sullo sciame. Introduciamo un metodo semplice per monitorare le dinamiche dello sciame e la risposta collettiva allo stress con alta risoluzione temporale utilizzando uno scanner di documenti piano e descriviamo come compilare ed eseguire un'analisi quantitativa degli sciami. Questo metodo semplice ed economico fornisce una quantificazione precisa e ben controllata dello sciame e può essere esteso ad altri tipi di saggi di crescita a base di lamiere e specie batteriche.
Introduzione
Lo sciame è una forma collettiva di motilità batterica coordinata che aumenta la resistenza agli antibiotici e la produzione di fattori di virulenza nell'host1,2,3. Questo comportamento multicellulare si verifica su superfici semi-solide che assomigliano a quelle degli strati mucose che coprono le membrane epiteliali nei polmoni4,5. I biosurfactants sono comunemente prodotti da popolazioni brulicanti per superare la tensione superficiale sulle superfici e la produzione di questi è regolata da complessi sistemi di segn....
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Protocollo
1. Preparazione piastre di agar sciame per P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Preparare 1 L di 5x M8 supporti minimi in una bottiglia di vetro aggiungendo 64 g di Na2HPO4s 7H2O, 15 g di KH2PO4e 2,5 g di NaCl in 500 mL di acqua a doppia distillazione (ddH2O). Regolare il volume finale a 1 L con ulteriori ddH2O. Autoclave per sterilizzare e conservare i supporti liquidi a temperatura ambiente.
- Preparare 100 mL di 1 M MgSO4 (solfato di magnesio) in una bottiglia di vetro aggiungendo 24,6 g di MgSO4x 7H2O in 50 mL ddH2
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Risultati
I passaggi per far crescere P. aeruginosa,stressare le cellule e immagine le piastre di agar brulicanti sono rappresentati nella Figura 1. Abbiamo inoculato una singola colonia di ceppo selvatico di P. aeruginosa UCBPP-PA14 da una piastra LB-agar in 2 mL di brodo LB durante la notte a 37 gradi centigradi e abbiamo individuato 5 l al centro della piastra di agar brulicante. L'imaging time-lapse di questa piastra rivela la crescita iniziale sotto forma di colonia al centro e poi la diffus.......
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Discussione
Questo protocollo si concentra sulla riduzione al minimo della variabilità nelle piastre di agar brulicanti e sulla fornitura di un metodo semplice e a basso costo per acquisire immagini time-lapse di P. aeruginosa brulicante e rispondendo allo stress. Questa procedura può essere estesa per l'immagine di altri sistemi batterici adattando la composizione dei media e le condizioni di crescita. Per P. aeruginosa, anche se M9 o FAB mezzo minimo può essere utilizzato per indurre sciami16
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. scritto e rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno progettato gli esperimenti. J.--L.B. ha eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH K22AI112816 e R21AI139968 ad A.S. e dall'Università della California. N.M.H-K. è stato supportato da Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella decisione di presentare i lavori per la pubblicazione. Non abbiamo interessi contrastanti da dichiarare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| Bacto agar, disidratato | BD Difco | 214010 | Per piastra LB-agar e piastra di agar sciamatura |
| Acidi Casamino | BD Difco | 223050 | Per mezzi di sciamatura |
| D-glucosio | Fisher Chemical | D16500 | Destrosio. Per terreni di sciamatura |
| Fosfomicina sale disodico | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Concentrazione di base: 200 mg/mL. Disciolto in ddH2O |
| Gentamycin solfato | Sigma-Aldrich | G1914 | Concentrazione di base: 3 mg/mL. Disciolto in ddH2O |
| Kanamicina solfato | Sigma-Aldrich | 60615 | Concentrazione di riserva: 100 mg/mL. Disciolto in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Per brodo LB e piastre LB-agar |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | 230391 | Per terreni di sciamatura |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | P0662 | Per 5 terreni M8 |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S9888 | Per 5 terreni |
| M8Sodio fosfato bibasico eptaidrato | Fisher Chemical | S373 | Per 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 ceppo |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Batteriofago |
| < strong>Forniture | |||
| alluminio | 3M | 150 Fine | Per coperchi neri |
| Tessuto nero | Joann | PRD7089 | Tessuto nero |
| Vernice spray nera | Krylon | 5592 Nero opaco | Per coperchi neri |
| Pallone Erlenmeyer | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Flaconi di vetro | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1.000 mL |
| Fascette da 8 pollici | Gardner Bender | E173770 | in tessuto nero opaco |
| (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | Piastre in polistirene da 100 mm x 15 mm |
| Bastoncini di legno | Fisher | 23-400-102 | Per striature e inoculazione di batteri |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | Per la sterilizzazione dei reagenti |
| Pipetta da 25 ml | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | Per pipettare 20 mL per piastre di agar sciamate |
| Deumidificatore | Frigidaire | FAD704DWD 70 pinte | Per mantenere l'umidità relativa della stanza a circa il 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software per l'analisi delle immagini |
| Incubatore | VWR | 89032-092 | Per la crescita di batteri a 37 ° C |
| Isotemp bagnomaria | Fisher | 15-462-21Q | Per fluidi di raffreddamento fino a 55 gradi C |
| Cappa a flusso laminare | The Baker Company | SG603A | Per l'essiccazione di piastre |
| Pipetta P-20 | Gilson | F123601 | Spotting su piastre di agar sciamate |
| Pipetta | Controller BrandTech | accu-jet | Per pipettare 20 mL per piastre di agar sciamate |
| Tamburo a rulli | New Brunswick | TC-7 | Per la crescita di batteri a 100 giri/min |
| Scanner | Epson | Scanner fotografico Epson Perfection V370 | per lastre ai fosfori |
| Software di automazione dello scanner | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Per 30 minuti di imaging interno |
| Software di acquisizione delle immagini dello scanner | Epson | v9.9.2.5US | Software per lastre ai fosfori |
Riferimenti
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
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Ristampe e permessi
