Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Sommario

La drosophila è un modello sperimentale ampiamente utilizzato adatto per lo screening di farmaci con potenziali applicazioni per la terapia del cancro. Qui, descriviamo l'uso di fenotipi di colore degli occhi variati della Drosophila come metodo per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina.

Abstract

La drosophila è un organismo modello eccellente che può essere utilizzato per vagliare composti che potrebbero essere utili per la terapia del cancro. Il metodo qui descritto è un metodo in vivo conveniente per identificare composti che promuovono l'eterocromatina utilizzando la Drosophila. Ceppo DX1 della Drosophila, con un fenotipo di colore degli occhi variegato che riflette le estensioni della formazione di etecromatina, fornendo così uno strumento per uno schermo farmaco che promuove l'eteocromatina. In questo metodo di screening, la varianza degli occhi viene quantificata in base alla superficie della pigmentazione rossa che occupa parti dell'occhio e viene valutata su una scala da 1 a 5. Il metodo di screening è semplice e sensibile e consente di testare composti in vivo. Lo screening farmacologico con questo metodo fornisce un modo rapido ed economico per identificare farmaci che promuovono l'eteocromatina che potrebbero avere effetti benefici nelle terapie contro il cancro. Identificare composti che promuovono la formazione di eteocromatica potrebbe anche portare alla scoperta di meccanismi epigenetici dello sviluppo del cancro.

Introduzione

L'eterocromatina è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nell'espressione genica, nella regolazione della segregazione cromosomica durante la divisione cellulare e nella protezione contro l'instabilità del^{genoma 1}. L'eterocromatina è stata considerata un regolatore di repressione genica e per proteggere l'integrità cromosomica durante la mitosi cellulare^2,3. È associato con la di- e tri-metilazione di istone H3 lisina 9 (H3K9me) durante l'impegno di lignaggio^4,5. Inoltre, il reclutamento di proteine del cromodominio Heterochromatin Protein 1 (HP1) è anche considerato associato all'eterocromatica e alla repressione epigenetica dell'espressione genica⁶. Queste proteine sono componenti essenziali e marcatori della formazione di eterocromatica.

Poiché l'instabilità genomica consente alle cellule di acquisire alterazioni genetiche che promuovono la carcinogenesi, l'eterocromatina sta diventando sempre più riconosciuta nello sviluppo del cancro e può essere mirata per il trattamento del cancro^7,8. Attualmente, non ci sono farmaci che sono ben consolidati nell'assistere la formazione di eterocromatina. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce ma efficiente per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina. Lo screening viene fatto trattando la Drosophila con una libreria di farmaci di piccole molecole. Questo metodo sfrutta un fenotipo del colore degli occhi variegato nel ceppodi Drosophila DX1che è influenzato dai livelli di eteromatina. Le mosche DX1 contengono una matrice di tandem di sette transgenie P[lac-w], che hanno l'espressione/depressione variegata a seconda dell'eteocromaticizzazione, quindi, l'entità della varietà nel colore degli occhi riflette il livello di eteocromatica. In particolare, l'aumento dell'eteocromatica potrebbe essere rilevato dall'aumento della proporzione di colore degli occhi variegato (occhio bianco). Al contrario, la diminuzione dell'eterocromatina sarebbe rilevata dall'aumento della proporzione dell'espressione transgenica P[lac-w] (occhio rosso)^9,10,11,12.

Pertanto, approfittiamo di questo sistema transgene di Drosophila che produce un fenotipo del colore degli occhi variegato poiché la sua espressione è direttamente correlata alla quantità di etecromatina presente. Dopo la scoperta di composti che sono sospettati di promuovere la formazione di etecromatina, possiamo confermare questo sospetto utilizzando altri metodi come macchia occidentale. Queste sostanze che promuovono l'eteocromatina possono essere ulteriormente sviluppate per gli studi clinici in pazienti in futuro.

Protocollo

1. Preparazione della biblioteca di farmaci

1. Identificare e preparare una libreria di farmaci da vagliare utilizzando un solvente appropriato ad una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mM in DMSO).
   NOTA: Un esempio specifico per una biblioteca di farmaci è l'Oncologia Set III dal National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). I composti in questo set sono forniti come 20 a 10 mM in 100% DMSO in due piastre U-bottom PP 96-well e conservate a -20 gradi centigradi. Le mappe NCI Plate, e i dati chimici di base di ogni farmaco potrebbero essere trovati presso i seguenti siti web:
   Numero di targa NCI 4740
   Targa numero targa 4741

2. Schermo per farmaci che promuovono l'eteocromatina che promuovono l'uso della Drosophila

1. Drosophila Strategia di allevamento (Figura 1A)
   1. Giorno 1: Croce tre w¹¹¹⁸/Y; Le mosche maschili DX1/CyO e tre o più mosche vergini w¹¹¹⁸ mosche femmine in una fiala alimentare da 25 mm x 95 mm con 9 mL di supporti alimentari standard della Drosophila (ricetta Bloomington). Impostare tre fiale di replica per ogni farmaco e un controllo per lo schermo.
      NOTA: le mosche DX1 sono state gentilmente fornite da James Birchler (Università del Missouri)^9,13.
   2. Giorno 2 e Giorno 3: Lasciare le mosche a deporre le uova per 2 giorni a temperatura ambiente (22 gradi centigradi).
   3. Giorno 4: Utilizzare una breve raffica di CO₂ gas per anetizzare le mosche genitore e smaltire le mosche genitore in un "obitorio di mosca" (una bottiglia contenente 70% alcol).
2. Farmaci per mangimi alla Drosophila per lo screening.
   1. Diluire ogni composto di droga dal brodo originale (20 -L a 10 mM in 100% DMSO in piastre a 96 pozze A Lut U) a una concentrazione finale di 10 M con 33% DMSO in acqua. Utilizzare 33% DMSO in acqua senza alcun farmaco come il controllo.
      NOTA: Alcuni farmaci sono scarsamente solubili in acqua e sono stati sciolti in DMSO. 100% DMSO è tossico per le mosche. Il 33% è tollerabile.
   2. Giorno 4: Pipette 60 - L di una soluzione di 10 M di droga o controllo sulla parte superiore del cibo a mosca. A questo punto, assicurarsi che le mosche genitore siano state rimosse e ci siano uova di mosca e larve di prima stella striscianti sul cibo.
   3. Giorno 6: Ripetere la depipazione di 60 -L della stessa soluzione di 10 -M di droga alla fiala alimentare.
      NOTA: Poiché i farmaci sono stati aggiunti al cibo a mosca, il cibo di superficie superiore contiene quasi 10 m di concentrazione e il cibo di fondo potrebbe non essere completamente penetrato. Tutte le mosche depongono le uova sulla parte superiore del cibo e mangiano il cibo di superficie superiore.
3. Osservare e segnare i cambiamenti di colore degli occhi.
   1. Due giorni dopo l'emergere delle mosche di F1 (circa il giorno 14), esaminare le mosche. Utilizzare una breve raffica di CO₂ per anetizzare le mosche F1 e rimuovere le mosche dalla loro fiala su un porose tampone di dissezione con CO₂ sorseggiando da sotto una carta da filtro.
   2. Ispezionare le mosche su questo cuscinetto al microscopio di dissezione. Esaminare l'intera mosca e identificare tutti w¹¹¹⁸/Y; DX1 / ozofozigous maschi per la loro mancanza del fenotipo dell'ala ricci dominante CyO.
   3. Segnare il colore degli occhi di ciascuno dei w¹¹¹⁸/Y; DX1 / z maschio eterozigoto vola su una scala da 1 a 5(Figura 1B). La percentuale di colore degli occhi bianchi è stata valutata come segue:
      1. <5% di superficie totale dell'occhio rosso sparso
      2. 6% - 25% macchie rosse occhio totale superficie
      3. 26% - 50% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      4. 51% - 75% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      5. >75% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      NOTA: In alternativa, omogeneizzare le testine delle fari in metanolo al 100% e utilizzare uno spettrometro per misurare la pigmentazione degli occhi a OD 450 nm. Selezionare solo i maschi perché PEV è più prognouced nei maschi DX1. Segna più di 10 maschi in ogni fiala.
   4. Calcolare l'indice di colore medio di tutti i maschi da ogni fiala segnata. Eseguire triplicati per ogni composto (Figura 1C).
      NOTA: Poiché il colore degli occhi varia a seconda dell'età, questo è un passo sensibile al tempo. Il colore degli occhi deve essere calcolato alla stessa età – 2 giorni di età. Di solito >10 mosche dovrebbero essere segnati in ogni fiala.
   5. Per confermare che i composti effettivamente promuovono la formazione di eterocromatica, utilizzare una tecnica diversa come il gonfiore occidentale per convalidare (Figura 1G).

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per vagliare composti che promuovono la formazione di etecromatina nella Drosophila, che è un sistema in vivo efficiente e a basso costo per lo sviluppo di farmaci (Figura 1). Abbiamo proiettato una libreria di farmaci di piccole molecole, Oncologia Set III, che è composto da 97 farmaci oncologici autorizzati FDA, utilizzando il ceppo DX1 di Drosophila melanogaster (Figura 1B

Discussione

L'eteocromatica è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'espressione genica. Sta diventando sempre più riconosciuto nel cancro e può servire come potenziale bersaglio per la terapia del cancro^15,16,17,18. Composti di piccole molecole sono comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci a causa di vantaggi nella produzione, conservazione, e metabolismo n...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Le mosche Drosophila		DX1 strain	DX1 sono state gentilmente fornite da James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media	UCSD fly kitchen
Metotrexato	NCI drug library
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Ethyl alcool	Sigma	E7023-500ML