La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.
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Articolo metodologico
Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
La barriera ematoencefalica (BBB) è formata da unità neurovascolari (NKU) che proteggono il sistema nervoso centrale (SNC) da una serie di fattori presenti nel sangue che possono interrompere la delicata funzione cerebrale. Come tale, la BBB è un ostacolo importante per la fornitura di terapie al SNC. Sempre più prove suggeriscono che la BBB svolge un ruolo chiave nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche. Pertanto, vi è un'enorme necessità di un modello BBB in grado di prevedere la penetrazione di farmaci mirati al SNC e di chiarire il ruolo della BBB nella salute e nella malattia.
Recentemente abbiamo combinato tecnologie di cellule staminali pluripotenti (iPSC) organo-su chip e cellule staminali pluripotenti indotte per generare un chip BBB completamente personalizzato per l'uomo. Questa nuova piattaforma mostra proprietà cellulari, molecolari e fisiologiche che sono adatte per la previsione del trasporto di farmaci e molecole attraverso il BBB umano. Inoltre, utilizzando chip BBB specifici per il paziente, abbiamo generato modelli di malattia neurologica e dimostrato il potenziale per applicazioni di medicina predittiva personalizzata. Fornito qui è un protocollo dettagliato che dimostra come generare chip BBB derivati da iPSC, a partire dalla differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC (iBMEC) e con conseguente colture neurali miste contenenti progenitori neurali, neuroni differenziati e astrociti. Viene inoltre descritta una procedura per la semina di cellule nel chip dell'organo e la coltura dei chip BBB sotto flusso laminare controllato. Infine, vengono fornite descrizioni dettagliate delle analisi dei chip BBB, compresi i saggi di permeabilità paracellulare per la valutazione della permeabilità di farmaci e molecole, nonché metodi immunocitochimici per determinare la composizione dei tipi di cellule all'interno del chip.
Introduzione
Il BBB è una barriera altamente selettiva che separa il SNC dal sangue circolante. Protegge le funzioni cerebrali critiche da sostanze potenzialmente dirompenti, fattori, e xenobiotici, consentendo anche l'afflusso di sostanze nutritive e altri metaboliti necessari per mantenere l'omeostasi del cervello1. Il BBB è un NVU multicellulare in cui periciti, piedi finali astrociti e processi neuronali contattano direttamente le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC). Queste interazioni consentono ai BMEC di formare proprietà di barriera specializzate supportate da giunzioni strette e aderente2,
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Protocollo
1. Generazione di cellule progenitrici neurali derivate da iPSC (iNPC)
- Produrre sfere E z da colonie iPSC come descritto di seguito e come pubblicato in precedenza20,21,22.
- Coltura colonie iPSC alla confluenza su membrana seminterrato rivestito 6 lastre di pozzo (0,5 mg/piastra) in mTESR1 o altri supporti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
- Rimuovere il mezzo iPSC e sostituire con 2 mL del mezzo a sfera ES [ESM; DMEM:F12 7:3 integrato con 100 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF), 100 ng/mL fattore di crescita....
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Risultati
Figura 6A,B,C rappresenta un chip BBB seminato con sfere ez sul canale superiore "lato cervello" e iBMETsul canale inferiore "lato sangue". Gli iBMEC sono stati prima di edte e hanno permesso di attaccarsi durante la notte, dopo di che sono state seminate le sfere dell'EZ. I trucioli sono stati poi coltivati in condizioni statiche con sostituzione giornaliera dei media per sette giorni. Il chip BBB è stato poi fissato utilizzando il 4% di PFA a RT per 10 min e lavato 3x con .......
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Discussione
La combinazione della tecnologia organ-on-chip e delle cellule derivate da iPSC nell'NVU promette una modellazione accurata della BBB umana. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'applicazione semplice e robusta del chip BBB basato su iPSC recentemente pubblicato16. Una panoramica e la temporizzazione del paradigma di seeding è illustrato nella Figura 3. Per ottenere e mantenere funzioni di barriera adatte alla modellazione BBB, la generazione di un monostrato .......
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Dichiarazioni
Cedars-Sinai possiede una partecipazione di minoranza in Emulate, la società che produce i chip di organi microfluidici dello studio. Un ufficiale di Cedars-Sinai fa anche parte del Consiglio di Amministrazione di Emulate. Emuleto non ha fornito alcun sostegno finanziario per questa ricerca. Cedars-Sinai e Emulate hanno brevetti depositati relativi a questo lavoro.
Ringraziamenti
Ringraziamo la dott.ssa Soshana Svendsen per l'editing critico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Israel Science Foundation 1621/18, dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST), da Israele 3-15647, dalla borsa di studio California Institute for Regenerative Medicine ID DISC1-08800, dalla Sherman Family Foundation, dalla NIH-NINDS grant 1UG3NS105703 e dalla sovvenzione 18-SI-389 della ALS Association. AH è stata finanziata dalla Wallenberg Foundation (numero di sovvenzione 2015.0178).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Soluzione di dissociazione |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific 31330038 | ||
| Siero d'asino | Sigma | D9663 | |
| Emulare Reagente 1 (ER-1) | Emulare Inc | ER-1 | |
| Emulare Reagente 2 (ER-2) | Emulare Inc | ER-2 | |
| Fibronectina | Sigma | F1141 | |
| Glial Proteina acida fibrillare (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Integratore di glutammina |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Matrice a membrana basale |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Siero bovino plasmaderivato povero di piastrine (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Acido retinoico (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Unità di filtro superiore per provette da centrifuga sterile | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Anticorpo monoclonale | Invitrogen | 33-9100 | |
| β III-tubulina (Tuj1&alfa;) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoetanolo | Life Technologies | 31350010 |
Riferimenti
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V.
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Ristampe e permessi
