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Articolo metodologico

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

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DOI:

10.3791/60925

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2 marzo 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

In questo articolo

Sommario

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Abstract

La barriera ematoencefalica (BBB) è formata da unità neurovascolari (NKU) che proteggono il sistema nervoso centrale (SNC) da una serie di fattori presenti nel sangue che possono interrompere la delicata funzione cerebrale. Come tale, la BBB è un ostacolo importante per la fornitura di terapie al SNC. Sempre più prove suggeriscono che la BBB svolge un ruolo chiave nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche. Pertanto, vi è un'enorme necessità di un modello BBB in grado di prevedere la penetrazione di farmaci mirati al SNC e di chiarire il ruolo della BBB nella salute e nella malattia.

Recentemente abbiamo combinato tecnologie di cellule staminali pluripotenti (iPSC) organo-su chip e cellule staminali pluripotenti indotte per generare un chip BBB completamente personalizzato per l'uomo. Questa nuova piattaforma mostra proprietà cellulari, molecolari e fisiologiche che sono adatte per la previsione del trasporto di farmaci e molecole attraverso il BBB umano. Inoltre, utilizzando chip BBB specifici per il paziente, abbiamo generato modelli di malattia neurologica e dimostrato il potenziale per applicazioni di medicina predittiva personalizzata. Fornito qui è un protocollo dettagliato che dimostra come generare chip BBB derivati da iPSC, a partire dalla differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC (iBMEC) e con conseguente colture neurali miste contenenti progenitori neurali, neuroni differenziati e astrociti. Viene inoltre descritta una procedura per la semina di cellule nel chip dell'organo e la coltura dei chip BBB sotto flusso laminare controllato. Infine, vengono fornite descrizioni dettagliate delle analisi dei chip BBB, compresi i saggi di permeabilità paracellulare per la valutazione della permeabilità di farmaci e molecole, nonché metodi immunocitochimici per determinare la composizione dei tipi di cellule all'interno del chip.

Introduzione

Il BBB è una barriera altamente selettiva che separa il SNC dal sangue circolante. Protegge le funzioni cerebrali critiche da sostanze potenzialmente dirompenti, fattori, e xenobiotici, consentendo anche l'afflusso di sostanze nutritive e altri metaboliti necessari per mantenere l'omeostasi del cervello1. Il BBB è un NVU multicellulare in cui periciti, piedi finali astrociti e processi neuronali contattano direttamente le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC). Queste interazioni consentono ai BMEC di formare proprietà di barriera specializzate supportate da giunzioni strette e aderente2,3. La formazione di questa barriera limita il passaggio paracellulare delle molecole, ma contiene trasportatori polarizzati per trasportare attivamente le molecole nel SNC o di nuovo nel sangue1. A causa di queste proprietà di barriera uniche, la BBB costituisce un grande ostacolo alla consegna di biofarmaceutici nel cervello, e si stima che meno del 5% delle piccole molecole approvate dalla FDA possa raggiungere il CNS4.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la penetrazione BBB e i meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo di BBB5. Mentre i modelli animali rappresentano fedelmente il complesso ambiente multicellulare in vivo, le differenze di espressione e di attività dei trasportatori BBB, nonché la specificità del substrato tra le specie spesso precludono un'accurata estrapolazione dei dati sugli animali agli esseri umani6. Pertanto, i modelli a base umana sono fondamentali per studiare la BBB umana e per l'uso nello sviluppo di farmaci progettati per indirizzare il SNC. Questa necessità diventa ancora più evidente con la crescente dominanza dei farmaci biologici, specifici per l'uomo nel campo dello sviluppo farmaceutico. Sempre più prove suggeriscono che una BBB compromessa è associata a una serie di gravi disturbi del SNC, tra cui tumori cerebrali e malattie neurologiche7,8,9. I modelli umani che riflettono fedelmente queste malattie hanno il potenziale sia 1) identificare nuovi percorsi che potrebbero essere mirati per lo sviluppo di farmaci e 2) prevedere la penetrazione del SNC, riducendo così il tempo e le risorse negli studi preclinici e possibilmente diminuendo il tasso di fallimento negli studi clinici.

I modelli in vitro sono stati ampiamente implementati per studiare le interazioni tra BMEC e altre cellule della NVU e condurre schermi per potenziali farmaci permeabili BBB10. Per ricreare gli aspetti chiave della BBB umana, i modelli in vitro devono mostrare proprietà fisiologicamente rilevanti (cioè bassa permeabilità paracellulare e resistenza elettrica transetthelial fisiologica [TEER] attraverso il monostrato endoteliale). Inoltre, il profilo molecolare di un sistema in vitro deve includere l'espressione di sistemi di trasporto funzionali rappresentativi. Tipicamente, i modelli in vitro sono composti da cellule endoteliali co-coltivate su una membrana semipermeabile con combinazioni di altre cellule NVU per migliorare le proprietà BBB11. Questo approccio consente una valutazione semplice e relativamente rapida della funzionalità della barriera e della permeabilità delle molecole. Tali modelli BBB a base cellulare possono essere stabiliti con fonti cellulari animali o umane, comprese le cellule isolate da escissioni chirurgiche o linee BMEC immortalate.

Recentemente, sono stati introdotti protocolli per differenziare le cellule pluripotenti umane in BMEC come fonte interessante per i modelli BBB umani in vitro12,13. I BMEC derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono altamente scalabili, dimostrano le caratteristiche morfologiche e funzionali cruciali della BBB umana e portano la genetica del paziente. Nella coltura, gli iBMEC formano un monostrato che esprime marcatori di giunzione stretti e display in complessi di giunzione stretti simili a in vivo. Queste cellule esprimono anche marcatori BBB, tra cui il trasportatore di glucosio BBB, il trasportatore di glucosio 1 (GLUT1). È importante sottolineare che, e a differenza di altre fonti di cellule alternative per i BMEC umani, gli iBMETC acquisiscono proprietà di barriera con valori alti come quelli misurati in vivo14, polarizzano lungo l'asse basolaterale ed esprimono pompe efflux funzionali. Inoltre, l'uso di iPSC da vari soggetti sia 1) accoglie con favore l'opportunità di testare gli aspetti della BBB in modo medico personalizzato e 2) fornisce una fonte flessibile per la generazione di ulteriori tipi di cella della NVU. Generare queste cellule da una fonte di cellule isogeniche per creare chip BBB personalizzati aiuterebbe anche a comprendere le differenze inter individuali nelle risposte dei farmaci, che è una delle principali cause di resistenza o risposta compromessa al trattamento osservata negli studi clinici.

L'uso di iBMEC come monostrati in un piatto o su un inserto transwell semi permeabile rappresenta un approccio potente per la modellazione BBB. Questi sistemi tendono ad essere robusti, riproducibili ed economici. Inoltre, le analisi funzionali come TEER e la permeabilità sono relativamente semplici da eseguire. Tuttavia, i sistemi bidimensionali (2D) non riescono a ricapitolare la natura 3D del tessuto in vivo, e non hanno le forze fisiologiche di stress da taglio fornite dalle cellule del sangue e del sangue circolanti. Questo limita la capacità dell'endotelio vascolare in questi modelli di sviluppare e mantenere proprietà e funzioni BBB intrinseche.

I sistemi microingegneririvestiti allineati da cellule viventi sono stati implementati per modellare varie funzionalità degli organi in un concetto chiamato organ-on-chips. Ricreando l'architettura multicellulare in vivo, le interfacce dei tessuti, i microambienti fisiochimici e la perfusione vascolare, queste piattaforme microingegnerizzate generano livelli di funzionalità dei tessuti e degli organi non possibili con sistemi di coltura 2D convenzionali. Consentono inoltre l'alta risoluzione, l'imaging in tempo reale e l'analisi di profili biochimici, genetici e metabolici simili alle cellule viventi nel contesto del tessuto in vivo e dell'organo. Tuttavia, una sfida particolare dell'organo su chip è che la progettazione, la fabbricazione e l'applicazione di questi chip microingegnerizzati richiede competenze ingegneristiche specializzate che di solito mancano nei laboratori accademici biologicamente orientati.

Recentemente abbiamo combinato tecnologie iPSC e organ-on-chip per generare un modello di chip BBB personalizzato15,16. Al fine di superare le sfide tecnologiche descritte, il Chip-S1 disponibile in commercio viene utilizzato insieme al modulo di coltura, uno strumento progettato per automatizzare la manutenzione dei chip in modo semplice e robusto (Emulate Inc.). Il chip BBB ricrea le interazioni tra cellule neurali ed endoteliali e raggiunge valori TEER fisiologicamente rilevanti, che vengono misurati da chip di organo su misura con elettrodi d'oro integrati17. Inoltre, il chip BBB mostra una bassa permeabilità paracellulare, risponde a segnali infiammatori a livello di organo, esprime pompe di flusso di efflusso attive e mostra il trasporto predittivo di biomarcatori solubili e biofarmaceutici. In particolare, i chip BBB generati da diversi individui catturano le differenze funzionali attese tra individui sani e pazienti con malattie neurologiche15.

Il protocollo descritto di seguito descrive un metodo affidabile, efficiente e riproducibile per la generazione di chip BBB basati su iPSC umani in condizioni di flusso dinamico. Vengono fornite indicazioni sul tipo di analisi dei saggi e degli endpoint che possono essere eseguite direttamente nel chip BBB o dagli effluenti di campionamento. Così, il protocollo dimostra lo spettro delle tecniche che possono essere applicate per la valutazione delle proprietà biologiche e funzionali e delle risposte in un modello rilevante per l'uomo.

Qui viene fornita una breve descrizione del chip BBB basato su iPSC. Gli iPSC umani sono inizialmente differenziati e propagati nei flaconi di coltura dei tessuti come aggregati a fluttuazione libera di progenitori neurali, indicati nelle sfere ez. Il canale superiore del Chip-S116,18,19 è seminato con sfere E sfere ez dissociate che formano il "lato cerebrale" del chip, in quanto le cellule si differenziano per 7 giorni in una coltura mista di cellule progenitrici neurali (iNPC), iAstrociti e iNeuron. Gli iPSC umani sono anche differenziati nelle piastre di coltura dei tessuti in iBMEC. Il canale inferiore del chip viene seminato con iBMEC per formare il "lato sangue" mentre si sviluppano per formare un tubo endoteliale (Figura 1). La membrana rivestita a matrice extracellulare porosa (ECM) che separa i canali superiore e inferiore 1) consente la formazione di interazioni tra cellule e cellule tra i canali e 2) consente all'utente di eseguire saggi permeabilità e celle di immagine in entrambi i canali utilizzando un microscopio luminoso convenzionale.

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Protocollo

1. Generazione di cellule progenitrici neurali derivate da iPSC (iNPC)

  1. Produrre sfere E z da colonie iPSC come descritto di seguito e come pubblicato in precedenza20,21,22.
    1. Coltura colonie iPSC alla confluenza su membrana seminterrato rivestito 6 lastre di pozzo (0,5 mg/piastra) in mTESR1 o altri supporti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
    2. Rimuovere il mezzo iPSC e sostituire con 2 mL del mezzo a sfera ES [ESM; DMEM:F12 7:3 integrato con 100 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF), 100 ng/mL fattore di crescita epidermica, 5 eparina g/mL e 2% integratore B27].
    3. Raschiare bene il fondo di ogni confluente con la parte posteriore di una punta sterile da 1000 pipetta o di un raschietto cellulare.
    4. Raccogliere tutte le cellule e posizionare in un accessorio ultra-basso T25 flask per consentire la formazione spontanea di sfere galleggianti libere. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
    5. Alimentare le sfere ogni 2-3 giorni quando il mezzo diventa giallo sostituendo metà del mezzo con ESM fresco. Ciò consente alle sfere di rimanere in un mezzo condizionato, che è molto importante per la loro crescita e manutenzione.
      1. Appoggia il pallone su un rack di tubi e lascia che le sfere si stabilizzino per gravità per 1-2 min fino all'angolo del pallone.
      2. Una volta sistemato, aspirare metà del supernatante con una pipetta sierologica da 5 mL o 10 mL e sostituirla con ESM fresca e preriscaldata.
    6. Passaggio delle sfere E z settimanalmente tagliando le sfere a 200 m di diametri come descritto in precedenza23,20,21. Le sfere dell'Ez possono essere mantenute per un massimo di 25 passaggi e sono ideali se utilizzate tra i passaggi 8-25.
  2. Preparare la sospensione a singola cella degli iNPC:
    1. Per indurre la differenziazione neurale, dissociare la sfera e-sfera in singole cellule.
    2. Raccogliere le sfere 3-4 giorni dopo il taglio da un pallone T75 e trasferirlo in un conico di 15 mL, quindi lasciarlo riposare per 2 min o fino a quando tutte le sfere sono stabilite in basso.
    3. Rimuovere lentamente ESM con una pipetta da 5 mL senza interrompere le sfere stabilite. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione (vedere Tabella dei materiali)e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi.
    4. Swirl la soluzione di dissociazione e sfere dopo 5 min di incubazione per garantire che tutte le sfere stabilite sono trattati.
    5. Rimuovere lentamente la soluzione di dissociazione. Aggiungere 1 mL di supporto di differenziazione neurale [NDM; DMEM: F12 con 2% B27 meno vitamina A, supplemento 1% N2, e fattore neurotrofico derivato dal cervello umano (hBDNF, 20 ng/mL)].
    6. Triturare le sfere in singole celle con pipetta utilizzando una pipetta da 1 mL seguita da una pipetta da 200,l, fino a quando tutte le sfere non si sono dissociate. Evitare la formazione di bolle durante la procedura di triturazione.
    7. Contare le cellule dissociate usando un emocitometro e diluire le cellule ad una densità finale di 1 x 106 cellule / mL. È possibile modificare la densità a seconda dell'applicazione.
      NOTA: densità più elevate (fino a 6 x 106 celle/mL) sono raccomandate per colture a breve termine fino a 3 giorni e densità inferiori sono raccomandate per applicazioni a lungo termine fino a 3 settimane.
      NOTA: Le cellule sono ora pronte per il seme nel canale superiore del chip per formare il "lato cervello".

2. Differenziazione degli iPSC in iBMETCs

  1. Passaggio iPSCs da un singolo pozzo confluente di un 6 pozzo a un rapporto 1:6 in una piastra rivestita a matrice a matrice a membrana del 6 pozzo. Lasciate che le cellule aderiscano per 24 h. Modificare iPSC medio al giorno.
  2. Contare le cellule ogni giorno utilizzando un emocitometro.
  3. Quando le cellule raggiungono una densità di 1,5–3,0 x 105 celle/pozzo, sostituire il mezzo iPSC con 3 mL di mezzo non condizionato senza bFGF [DMEM:F12 1:1, con la sostituzione del siero da foratura del 10% (KOSR), l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), lo 0,5% di integratore di glutammina (Tabella dei materiali) e 100M-mertoo. Sostituire media giornaliera per 6 giorni24.
  4. Al giorno 6, sostituire il mezzo con il mezzo di cellule endoteliali (EC) medio [medio endoteliale senza siero (hESFM) integrato con 1% di siero bovino a base di piastriniche, 20 ng/mL bFGF e 10 M di acido retinoico all-trans retinoico (RA)]. Lasciare mezzo per 2 giorni.
  5. Rimuovere il mezzo EC e aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione per pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 35 min.
    NOTA: Mentre questo è considerato un lungo tempo di incubazione nella soluzione di dissociazione utilizzata qui, gli iBMEC possono sopportare questo trattamento con redditività cellulare superiore al 90%.
  6. Staccare le cellule dal pozzo pipetting delicatamente la sospensione cellulare e raccogliendo tutte le cellule in un tubo conico 15 mL.
    NOTA: Evitare il pipettaggio duro. Se le cellule non si staccano facilmente, incubare per ulteriori 5 min.
  7. Aggiungere 1 volume di mezzo EC nel conico di 15 mL per inattivare Accutase, centrifugare a 200 x g per 5 min, rimuovere il mezzo e sostituire con 1 mL di mezzo EC (senza bFGF e RA).
  8. Contare le celle utilizzando un emocitometro e regolare la densità cellulare a 14–20 x 106 celle/mL.
    NOTA: Le cellule sono ora pronte per essere semiate nel canale inferiore del chip per formare il "lato sangue".

3. Microfabbricazione del chip dell'organo

  1. Utilizzare un chip d'organo per il modello di chip BBB e la sua produzione come fatto in precedenza16,18,19. L'alto chip per organo di canale (vedi Tabella dei materiali)è fabbricato da un elastomer polidimetilsiloxana altamente flessibile (PDMS) che contiene due canali di microscala sovrapposti e paralleli separati da una membrana porosa flessibile. Le dimensioni dei microcanali superiore e inferiore sono rispettivamente 1 mm x 1 mm e 1,0 mm x 0,2 mm. I due canali sono separati da una membrana porosa flessibile di 50 m di spessore, contenente pori di 7 m di diametro con spaziatura di 40 m. La superficie della membrana porosa che separa i canali è di 0,171 cm2.

4. Preparazione del truciolo

  1. I chip dell'organo sono forniti preconfezionati all'interno del supporto chip, eliminando la necessità di disturbare o distorcere l'allineamento del chip durante la manipolazione. Inoltre, il supporto chip si connette in modo sicuro a un modulo portatile ("Pod") che funge da interfaccia tra il modulo di coltura e il chip.
    1. Spruzzare l'imballaggio dei trucioli con il 70% di etanolo e portare nell'armadio della biosicurezza (BSC).
    2. Aprire la confezione e stendere il chip dell'organo in una parabola Petri sterile. Gestire il supporto chip solo dai lati per evitare il contatto diretto con il chip.
    3. Assicurarsi che la scheda del supporto sia rivolta verso destra (Figura 2) e quando si utilizzano più chip, allinearli tutti nello stesso orientamento.
    4. Etichettare ogni chip nella scheda carrier (la preparazione completa del chip e il flusso di lavoro sono illustrati nella Figura 3).

5. Attivazione della superficie e rivestimento ECM

  1. Preparazione della soluzione di attivazione della superficie
    1. Il reagente emulato 1 (ER-1), fornito in una fiala contenente 5 mg, è sensibile alla luce. Preparare la soluzione ED-1 fresca immediatamente prima dell'uso. L'integrità er-1 è fondamentale per la preparazione dei chip.
    2. Spegnere la luce nel BSC durante la movimentazione ER-1.
      NOTA: ER-1 è un irritante per gli occhi e deve essere maneggiato nella BSC con guanti e protezione degli occhi adeguati.
    3. Lasciare che i reagenti ER-1 ed ER-2 eclichino a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
    4. Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendo un tubo conico sterile vuoto da 15 mL con lamina.
    5. Nel BSC, toccare brevemente la fiala ER-1 per sistemare la polvere nella parte inferiore.
    6. Aggiungere 1 mL di buffer ER-2 alla fiala e trasferire immediatamente il suo contenuto nella parte inferiore del tubo conico avvolto da 15 mL. Non pipette da mescolare. Il colore della soluzione trasferita al tubo conico sarà rosso.
    7. Ripetere il passaggio 5.1.6 3x. All'ultimo tratto, tappi la fiala ER-1 e invertire per raccogliere la polvere rimanente dal coperchio, quindi trasferire la soluzione al tubo conico; questo porterà il volume totale a 4 mL di soluzione ER-1.
    8. Aggiungere 6 mL di soluzione ER-2 alla soluzione 4 mL di ER-1 nel tubo conico da 15 mL ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL. L'ER-1 deve essere completamente disciolto all'interno della soluzione ER-2.
  2. Attivazione di surface
    1. L'utilizzo di una pipetta P200 e di una sterile punta filtrata a 200 caratteri, occupa 200 l di miscela ER-1.
    2. Posizionare la pipetta nell'ingresso inferiore e spingere 20 - L di miscela ER-1 attraverso il canale inferiore fino a quando la miscela inizia a fluire dalla presa del canale inferiore.
    3. Aggiungere circa 50 l di miscela ER-1 e posizionarla nell'ingresso del canale superiore. Spingere la miscela attraverso il canale superiore fino a quando non inizia a fluire fuori dalla presa del canale superiore.
    4. Rimuovere tutta la miscela ER-1 in eccesso dalla superficie del chip per aspirazione delicata. Assicurarsi che la miscela ER-1 venga rimossa solo dalla superficie del chip e non dai canali.
    5. Verificare che i canali siano privi di bolle d'aria prima dell'attivazione ultravioletta (UV). Se vengono rilevate bolle d'aria, rimuovere le bolle lavando il canale con la miscela ER-1.
    6. Posizionare il piatto aperto contenente le patatine nella scatola luminosa UV (fornito da Emulate Inc.).
    7. Impostare l'interruttore sul retro della scatola della luce UV sull'impostazione "Coerente". Accendere l'alimentazione e avviare l'attivazione UV. Lasciare i trucioli sotto la luce UV per 20 min.
      NOTA: Evitare l'esposizione del personale alla luce UV.
    8. Rimuovere la miscela ER-1 da entrambi i canali.
    9. Lavare ogni canale con 200 gradi di soluzione ER-2.
    10. Rimuovere ER-2 da entrambi i canali.
    11. Lavare ogni canale con 200 gradi di salina (DPBS) raffreddaria di Dulbecco.
    12. Lasciare il DPBS freddo all'interno dei canali fino a procedere al passaggio successivo.
  3. Preparazione e rivestimento della matrice extracellulare (ECM)
    1. Preparare la soluzione ECM combinando i singoli componenti ECM con DPBS freddo, acqua o altro solvente alle concentrazioni di lavoro finali. La soluzione ECM deve essere preparata fresca ogni volta che viene utilizzata.
    2. Rivestire i canali superiore e inferiore del chip con ECM, con la composizione determinata dal tipo di cella da semare. La miscela ECM deve essere mantenuta sul ghiaccio fino all'uso.
    3. Usate lalamino (50 g/mL) per rivestire il "lato cerebrale", e il collagene IV e la fibronectina mescolati a un rapporto 4:1 (320:80 g/mL) per rivestire il "lato sangue" come descritto nella sezione 5.6.
  4. Preparazione di eCM aliquots
    1. Diluire 1 mg/mL di laminina nel DPBS freddo ad una concentrazione finale di 50 g/mL. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi fino all'uso.
    2. Sciogliere il collagene IV in 0,1% di acido acetico a una concentrazione di 1 mg/mL. Incubare la soluzione a 2-8 gradi durante la notte o a RT per 1-3 h o fino a completa dissoluzione.
    3. Preparare una miscela di 1 mL di collagene IV:fibronectina (320 : L di collagene IV, 80 l of fibronectin, 600 l di sterile doppio distillato H2O). La miscela può essere conservata a -20 gradi centigradi.
  5. Rivestimento dei trucioli con ECM
    1. Aspira completamente il DPBS freddo da entrambi i canali. Impostare una pipetta P200 in modo che occupi 100 - L di collagene IV:fibronectina soluzione.
    2. Introdurre la soluzione attraverso l'ingresso del canale inferiore fino a quando una piccola goccia si forma sulla presa. Lasciare una piccola goccia sull'inseridio dopo aver rimosso la punta della pipetta.
    3. Introdurre la soluzione laminin attraverso l'ingresso del canale superiore fino a quando una piccola goccia si forma sulla presa. Lasciare una piccola goccia sull'inseridio dopo aver rimosso la punta della pipetta.
    4. Esaminare attentamente i canali per assicurarsi che non siano presenti bolle. Se sono presenti bolle, lavare il canale con la soluzione ECM appropriata fino a rimuovere tutte le bolle.
    5. Ripetere i passaggi da 5.5.1– 5.5.4 per ogni chip.
    6. Aggiungere 1,5 mL di DPBS al tappo di un tubo conico da 15 mL. Posizionare il tappo DPBS nel piatto di coltura da 150 mm con le patatine per fornire umidità extra e sigillare il piatto con parafilm. Per ottenere i migliori risultati, incubare i trucioli a 4 gradi durante la notte.
      NOTA: se lo si desidera, le cellule possono essere semiate lo stesso giorno dell'attivazione del chip e del rivestimento ECM, anche se è preferibile un'incubazione durante la notte. I trucioli possono essere pronti per il seeding 4 h dopo l'aggiunta dell'ECM e l'incubazione dei trucioli a 37 gradi centigradi.

6. Seeding del canale "lato cervello" e differenziare le sfere di Ez in colture neurali miste

  1. Portare la teglia contenente le patatine preparate al BSC. Lavare delicatamente entrambi i canali con 200 -L di NDM.
  2. Evitare il contatto con le porte, aspirare con attenzione le goccioline dei supporti in eccesso dalla superficie del chip. Sospensione cellulare leggermente agita prima di seminare ogni chip per garantire una sospensione cellulare omogenea
  3. Seeding degli iNPC nel canale superiore per generare il "lato cervello"
    1. Semina le celle (1 x 106 celle / mL) nel canale superiore del chip. Aggiungere una punta P200 contenente 30-100 litri di sospensione delle celle all'ingresso del canale superiore e rilasciare delicatamente la punta dalla pipetta. Prendere una pipetta P200 vuota, premere lo stantuffo, inserire nella presa del canale superiore e tirare con attenzione la sospensione singole celle attraverso il chip.
    2. Coprire il piatto e trasferirlo al microscopio per verificare la densità di semina e la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del canale superiore. Rimuovere delicatamente la punta della pipetta dalle porte di ingresso e uscita del chip.
    3. La densità di seeding dovrebbe apparire come copertura del 20%. Se la densità di seeding è superiore o inferiore al previsto o irregolare, riportare i trucioli al BSC, lavare il canale 2x con 200 - L di mezzo fresco e ripetere il passaggio 6.3.1.
    4. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare, posizionare immediatamente i trucioli nell'incubatrice per 2 h a 37 gradi centigradi dopo aver eseguito il seeding di ogni lotto di trucioli. Lavare via le cellule che non si attaccano con NDM fresco.
    5. Mantenere le cellule in condizioni statiche a 37 gradi centigradi con una sostituzione NDM giornaliera per almeno 48 h prima di iniziare il flusso. Gli iBMEC possono essere semiizzati dopo l'attaccamento degli iNNC o il giorno successivo dopo il seeding iNPC.

7. Seeding iBMEC nel canale inferiore per generare il "lato sangue"

  1. Portare la teglia contenente le patatine preparate al BSC. Lavare delicatamente il canale inferiore con 200 gradi centigradi di mezzo EC.
  2. Evitare il contatto con le porte, aspirare con attenzione goccioline di mezzo CE in eccesso dalla superficie del chip, assicurandosi di lasciare il mezzo in entrambi i canali. Agitare delicatamente la sospensione cellulare prima di seminare ogni chip per garantire una sospensione omogenea delle cellule.
  3. Utilizzando una pipetta P200, redigere 30-100 gradi della sospensione cellulare iBMEC (14-20 x 106 celle/mL) e posizionare la punta nell'ingresso del canale inferiore. Scollegare delicatamente la punta dalla pipetta, lasciando la punta che contiene la cella nella porta di inseridimento.
  4. Deprimere lo stantuffo su una pipetta P200 con una punta vuota, inserire nella presa del canale inferiore e tirare con attenzione la sospensione a cella singola attraverso il canale inferiore rilasciando lentamente lo stantuffo della pipetta.
  5. Aspirare la sospensione delle cellule in eccesso dalla superficie del chip. Evitare il contatto diretto con le porte di ingresso e di uscita per garantire che nessuna sospensione cellulare venga aspirata dai canali.
  6. Coprire il chip e trasferirlo al microscopio per osservare la densità di seeding. Il canale inferiore deve essere riempito senza spazi osservabili tra le cellule quando osservato a 4x o 10x al microscopio (Figura 4).
  7. Se la densità di semina è inferiore al 90% della copertura o è distribuita in modo non uniforme, regolare la densità delle celle di conseguenza e ripetere i passaggi da 7,2 a 7,6 fino a ottenere la densità corretta all'interno del canale. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare (Figura 4), le celle di serie nei chip rimanenti. Per attaccare le cellule sulla membrana porosa, che si trova sulla parte superiore del canale inferiore, invertire ogni chip e riposare in una culla di truciolo.
  8. Posizionare un piccolo serbatoio (15 mL di tappo tubo conico contenente DPBS sterile) all'interno del piatto da 150 mm per fornire umidità alle cellule. Incubare i trucioli a 37 gradi centigradi per circa 3 h, o fino a quando le cellule nel canale inferiore non si sono attaccate. Una volta collegati gli iBMEC (3 h dopo la semina), capovolgere i chip di nuovo in posizione verticale per consentire l'attaccamento cellulare alla parte inferiore del canale inferiore.

8. Avvio del flusso

  1. Il flusso viene in genere avviato 48 h post-seeding di iBMEC. Questa volta è necessario per l'iBMETC per attaccarsi saldamente al chip.
  2. Per mantenere il flusso laminare attraverso il chip, è importante degas e equilibrate la temperatura del mezzo. Il medio deve essere preriscaldato in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 1 h.
  3. Fino a 50 mL di mezzo riscaldato possono essere degassati per incubazione sotto un sistema di filtrazione sottovuoto per 15 min.
  4. Priming di moduli portatili
    1. Sanificare l'esterno del modulo portatile di imballaggio e vassoi con 70% di etanolo, salvietta e trasferimento al BSC. Aprire la confezione e posizionare i moduli nel vassoio. Orientali con i serbatoi verso la parte posteriore del vassoio.
    2. Pipetta 3 mL di supporti caldi pre-equilibrati per ogni serbatoio di inseridio. Aggiungere il supporto di coltura EC al serbatoio di ingresso del canale inferiore e NDM al serbatoio di ingresso del canale superiore del canale superiore (Figura 5).
    3. Pipette 300 - L di supporti caldi pre-equilibrati per ogni serbatoio di presa, direttamente sopra ogni porta di uscita (Figura 5).
    4. Posizionare fino a sei moduli portatili su ciascun vassoio. Portare i vassoi nell'incubatrice e scivolare completamente nel modulo di coltura con la maniglia del vassoio rivolta verso l'esterno.
    5. Selezionare ed eseguire il ciclo "Prime" nel modulo culture. Chiudere la porta dell'incubatrice e consentire al modulo di coltura di innescare i moduli portatili (prende 1 min). Il ciclo di innesco viene completato quando la barra di stato è "Pronto". Rimuovere il vassoio dal modulo di coltura e portarlo al BSC.
    6. Verificare che i moduli portatili siano stati installati correttamente controllando la parte inferiore di ogni modulo portatile nel BSC. Cercare la presenza di piccole goccioline in tutte e quattro le porte.
      1. Se un modulo portatile non mostra goccioline, eseguire nuovamente il ciclo primario su tali moduli. Se un supporto gocciolava sul vassoio (questo può verificarsi più spesso dalle porte di uscita), pulire il vassoio con 70% di etanolo.
  5. Collegamento di chip a moduli portatili, regolazione e avvio del flusso
    1. Lavare delicatamente entrambi i canali di ogni chip con un mezzo di coltura caldo e equilibrato specifico per le cellule per rimuovere eventuali bolle nel canale e posizionare piccole goccioline di supporti (secondo il supporto nel canale) sulla parte superiore di ogni porta di ingresso e uscita.
    2. Inserire chip con supporti nei moduli portatili e posizionare fino a sei su ciascun vassoio. Inserire i vassoi nel modulo delle impostazioni cultura. Programmare le condizioni di coltura dei chip per organi appropriati (portata e allungamento) sul modulo di coltura.
    3. Le condizioni programmate inizieranno non appena il ciclo "Regolamento" sarà completato.
      NOTA: le portate per ogni canale possono essere controllate in modo indipendente e possono essere impostate su velocità che vanno da 0 a 1.000 l/h. Il chip BBB è in genere coltivato a 30 l/h. Quando un supporto scorrevole, ad esempio supporti EC o ESM a 30 gradi centigradi/h e 1000 l/h, le forze di taglio sono rispettivamente di 0,01 dyn/cm2 e 0,33 dyn/cm2.
    4. Eseguire il ciclo "Regulate", che richiede circa 2 h, dopo di che il modulo di coltura inizierà il flusso alle condizioni di coltura del chip dell'organo preimpostato.

9. Valutazione della permeabilità paracellulare da sangue a cervello

  1. Preparare l'NDM integrato con 10 g/mL dextran-FITC (4 kDa). Questa soluzione verrà utilizzata come input per il canale "lato sangue".
  2. Riempire i serbatoi di canale inferiore dei moduli portatili con NDM integrato con dextran-FITC. Riempire i serbatoi del canale superiore con NDM senza tracciante.
  3. Perfusi entrambi, i canali superiore e inferiore ad una portata di 30 gradi centigradi per almeno 4 h fino a quando non si accumulano supporti sufficienti per la valutazione della fluorescenza in un lettore di lastre (tipicamente 100 l).
  4. Raccogliere campioni di supporti dai serbatoi di ingresso e output dei canali superiore e inferiore. Proteggere i campioni dalla luce.
  5. Diluire in modo seriale l'NDM integrato con 10 g/mL dextran-FITC 1:1 utilizzando NDM senza tracciante per generare una curva di calibrazione da 10-12 punti.
  6. Prelevare 100 l. di ogni campione, compresa la curva di calibrazione, in una piastra nera di 96 pozze e leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di lamiere (485 nm eccitazione, 530 nm di emissione).
  7. Usa i valori misurati per calcolare i valoridell'app P come segue:

figure-protocol-1

  1. Prendere le misurazioni giornaliere per valutare le proprietà della barriera e confermare che il chip BBB è ancora funzionante.

10. Immunocitochimica

  1. Portare le patatine in un cofano di fumi chimici. Utilizzando una pipetta P200, fissare le cellule perfondendo entrambi i canali con 200 litri del 4% di paraformaldeide (PFA) in DPBS e incubare per 10 min a RT.
  2. Dopo la fissazione, perfusione di ogni canale con 200 -L di DPBS e incubare per 5 min. Ripetere il lavaggio DPBS 2x.
  3. Bloccare e permeabilizzare le cellule sul chip perfinendo la soluzione di blocco primario (PBS, integrata con il siero dell'asino normale del 5% e lo 0,1% Triton X-100). Incubare a RT per 1 h.
  4. Diluire gli anticorpi primari nella soluzione di blocco primario e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi. I marcatori BMECs sono GLUT-1 (1:100 diluizione), .O-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) e VE-cadherin (1:200). I marcatori neurali sono z-tubulina (1:1000; Tuj1, S100 (1:500), nestin (1:1000) e GFAP (1:1000).
  5. Lavare i trucioli 3x con il DPBS freddo.
  6. Diluire gli anticorpi secondari in soluzione di blocco secondario (DPBS con siero asino normale del 5% senza Triton-X).
  7. Perfuso la soluzione anticorpale secondaria attraverso entrambi i canali. Tipicamente, gli anticorpi secondari fluorescenti vengono diluiti 1:1000. Incubare per 1 h a RT protetto dalla luce.
  8. Lavare i chip 3x con DPBS.
  9. Nuclei cellulari macchiando perffonde chip con 100 L di soluzione DAPI. Incubare a RT per 5 min.
  10. Lavare i chip 3x con DPBS.
  11. Il chip è pronto per l'imaging utilizzando un microscopio fluorescente verticale o invertito. La trasparenza del PDMS consente l'imaging nel chip dell'organo intatto. Gli ingrandimenti superiori a 10x possono richiedere obiettivi di lunga distanza di lavoro a causa dello spessore del chip dell'organo.

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Risultati

Figura 6A,B,C rappresenta un chip BBB seminato con sfere ez sul canale superiore "lato cervello" e iBMETsul canale inferiore "lato sangue". Gli iBMEC sono stati prima di edte e hanno permesso di attaccarsi durante la notte, dopo di che sono state seminate le sfere dell'EZ. I trucioli sono stati poi coltivati in condizioni statiche con sostituzione giornaliera dei media per sette giorni. Il chip BBB è stato poi fissato utilizzando il 4% di PFA a RT per 10 min e lavato 3x con ...

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Discussione

La combinazione della tecnologia organ-on-chip e delle cellule derivate da iPSC nell'NVU promette una modellazione accurata della BBB umana. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'applicazione semplice e robusta del chip BBB basato su iPSC recentemente pubblicato16. Una panoramica e la temporizzazione del paradigma di seeding è illustrato nella Figura 3. Per ottenere e mantenere funzioni di barriera adatte alla modellazione BBB, la generazione di un monostrato ...

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Dichiarazioni

Cedars-Sinai possiede una partecipazione di minoranza in Emulate, la società che produce i chip di organi microfluidici dello studio. Un ufficiale di Cedars-Sinai fa anche parte del Consiglio di Amministrazione di Emulate. Emuleto non ha fornito alcun sostegno finanziario per questa ricerca. Cedars-Sinai e Emulate hanno brevetti depositati relativi a questo lavoro.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dott.ssa Soshana Svendsen per l'editing critico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Israel Science Foundation 1621/18, dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST), da Israele 3-15647, dalla borsa di studio California Institute for Regenerative Medicine ID DISC1-08800, dalla Sherman Family Foundation, dalla NIH-NINDS grant 1UG3NS105703 e dalla sovvenzione 18-SI-389 della ALS Association. AH è stata finanziata dalla Wallenberg Foundation (numero di sovvenzione 2015.0178).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AccutaseEMD MilliporeSCR005Soluzione di dissociazione
B27Gibco12587010
BfgfPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1Organ-Chip
Collagen IVSigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
Dextran-FITCSigma46944
DMEM: F12Thermo Fisher Scientific 31330038
Siero d'asinoSigmaD9663
Emulare Reagente 1 (ER-1)Emulare IncER-1
Emulare Reagente 2 (ER-2)Emulare IncER-2
FibronectinaSigmaF1141
Glial Proteina acida fibrillare (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutamaxLife Technologies35050038Integratore di glutammina
hBDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning354234Matrice a membrana basale
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
NEAABiological industries01-340-1B
NestinMilliporeMAB353
NutriStemBiological industries05-100-1AAlternate media
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
Siero bovino plasmaderivato povero di piastrine (PPP)Biomedical TechnologiesJ64483AB
Acido retinoico (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP Unità di filtro superiore per provette da centrifuga sterileMilliporeSCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 Anticorpo monoclonaleInvitrogen33-9100
β III-tubulina (Tuj1&alfa;)SigmaT8660
β-mercaptoetanoloLife Technologies31350010

Riferimenti

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