Lesione cerebrale indotta dal laser nella Corteccia Motoria dei Ratti

A livello globale, l'ictus è la seconda causa di morte e la terza causa di disabilità¹. L'ictus porta anche a gravi disabilità, spesso richiedendo cure supplementari da parte del personale medico e dei parenti. C'è, quindi, la necessità di comprendere le complicazioni associate al disturbo e migliorare il potenziale per risultati più positivi.

L'uso di modelli animali è il primo passo per comprendere le malattie. Per garantire i migliori risultati di ricerca, un modello tipico includerebbe una tecnica semplice, convenienza, elevata riproducibilità e variabilità minima. I determinanti nei modelli di ictus ischemico includono il volume dell'edema cerebrale, le dimensioni dell'infarto, l'entità della rottura tra la barriera eno- cervello (BBB) e il danno funzionale generalmente valutato tramite il punteggio di gravità^{neurologica 2}.

La tecnica di induzione del ictus più utilizzata nei modelli di roditore occlude l'arteria cerebrale centrale (MCA) transitoriamente o^{permanentemente 3}. Questa tecnica produce un modello di tratto simile a quelli degli esseri umani: ha una penobra che circonda l'area accarezzata, è altamente riproducibile e regola la durata dell'ischemia e la reperfusione⁴. Tuttavia, il metodo MCAO presenta alcune complicazioni. La tecnica è soggetta a emorragie intratracranali e lesioni alla retina ipsilaterale con una disfunzione della corteccia visiva e dell'ipertermia comune che spesso portano a ulteriori esiti^5,6,7. Altre limitazioni includono alte variazioni nell'ictus indotto (derivante dalla probabile estensione dell'ischemia alle regioni indesiderate, come la regione dell'arteria carotide esterna), l'occlusione insufficiente dell'MCA e la rifusione prematura. Inoltre, ratti di diverse varietà e dimensioni presentano vari volumi infarto⁸. Oltre a tutti gli svantaggi menzionati, il modello MCAO non può indurre piccoli tratti isolati nelle aree cerebrali profonde, perché è limitato tecnicamente in termini di requisito di dimensioni minime del vaso per la cateterizzazione. Ciò rende ancora più critica la necessità di un modello alternativo. Un altro metodo, la fotothrombosis, fornisce una possibile alternativa alle procedure MCAO ma non migliora l'efficienza⁹. Questa tecnica si rivolge alla corsa con la luce e offre alcuni miglioramenti sui modelli precedenti. Tuttavia, la fotothrombosi richiede una craniotomia invasiva associata a compications^{secondari 9}.

Alla luce delle carenze delineate, il protocollo qui presentato fornisce una tecnica laser alternativa in grado di indurre lesioni cerebrali nei roditori. Il meccanismo d'azione della tecnica laser si basa sugli effetti fototermici del laser impartiti sui tessuti viventi, che porta all'assorbimento dei fasci di luce da parte dei tessuti del corpo e alla loro conversione in calore. I vantaggi dell'utilizzo di una tecnica laser sono la sua sicurezza e facilità di manipolazione. La capacità di un laser di produrre calore per fermare il sanguinamento lo rende molto importante in medicina, mentre la sua capacità di amplificare diversi raggi in un dato punto di incontro assicura che i laser evitino di distruggere tessuti sani che si erge nel modo del punto di^{destinazione 10}. Il raggio laser utilizzato in questo protocollo può passare attraverso un basso mezzo liquido, come l'osso, senza emettere la sua energia e/o causando alcuna distruzione. Una volta che raggiunge un mezzo liquido elevato, come i tessuti cerebrali, utilizza la sua energia per distruggere i tessuti bersaglio. La tecnica, quindi, può indurre lesioni cerebrali solo nell'area appropriata del cervello.

La tecnica qui presentata ha mostrato un'enorme quantità di capacità di regolare i suoi livelli di irradiazione, producendo le variazioni scelte di lesioni cerebrali previste fin dall'inizio. A differenza dell'MCAO originale che colpisce sia la corteccia che lo striato, la tecnica laser è stata in grado di regolare l'impatto della lesione cerebrale, inducendo lesioni solo sulla corteccia motoria prevista. In questo caso, viene fornito il protocollo di lesione cerebrale indotta dal laser e un riepilogo dei risultati rappresentativi per la procedura eseguita sulla corteccia cerebrale dei ratti.

La seguente procedura è stata condotta secondo gli orientamenti dell'uso degli animali sperimentali della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati anche dal Comitato per la cura degli animali presso l'Università Ben-Gurion del Negev.

1. Selezione e preparazione degli animali

1. Selezionare 65 ratti maschio Sprague-Dawley del peso di 300 a 350 g senza patologia overt per questa procedura. Le dimensioni più piccole pongono difficoltà tecniche per la procedura MCAO.
2. Assegnare 3 ratti per gabbia e lasciarli adattare per almeno 3 giorni.

2. Procedura MCAO

1. Selezionare 25 ratti per MCAO consentendo la mortalità del 10-20% associata alla procedura¹¹.
2. Eseguire MCAO utilizzando una tecnica standard, come descritto in precedenza nel dettaglio¹².

3. Procedura sperimentale di lesioni cerebrali indotte al laser

1. Assegnare 20 ratti a un gruppo contrassegnato come gruppo laser e 20 ratti a un altro gruppo di controllo (sham-operato).
2. Sottopone il gruppo laser ratti all'irradiazione laser a 50J X 10 points punti nel modo seguente:
   1. Anestetizzare ratto con una miscela di 2% isoflurane in ossigeno permettendo la ventilazione spontanea. Controllare la profondità anestetica sufficiente pizzicando la coda con pinne per vedere l'assenza del riflesso di ritiro.
   2. Mantenere la temperatura corporea del ratto a 37 gradi centigradi durante tutta la procedura sperimentale utilizzando un tampone di riscaldamento regolato a temperatura rettale.
   3. Rimuovere i capelli locali con un rasoio e disinfettare con 70% alcol e 0,5% gluconato di clorexidina. Ripetere il passo di disinfezione altre due volte.
      NOTA: La dimensione dell'incisione chirurgica deve essere di circa 3 cm. Rimuovere i capelli almeno 2 cm intorno all'area di incisione.
   4. Posizionare il ratto su un supporto della testa stereotassico in una posizione prona e fare un'incisione di 3 cm per riflettere il cuoio capelluto lateralmente ed esporre l'area tra Bregma e Lambda.
   5. Mantenere l'anestesia attraverso il cono del naso.
   6. Utilizzare il laser Neodymium-YAG (Nd-YAG) (lunghezza d'onda di picco 1064 nm) per somministrare 50J X 10 punti,con una durata dell'impulso di 1 s, all'area esposta del cranio sopra l'emisfero destro.
   7. Assicurarsi che la parte di generazione laser dell'apparecchio si trova ad una distanza di 2 mm dall'area esposta per produrre un raggio laser. 50J X 10 punti è stato selezionato dopo un'attenta valutazione delle diverse combinazioni energia/superficie. Questa combinazione è efficiente e non causa la distruzione ossea del cranio dopo la somministrazione per meno di un secondo¹⁰.
      NOTA: 2 mm è la distanza tra il terminale del raggio laser (dal cavo ottico attraverso il cui è passato) e l'osso del cranio. Nel caso in cui venga utilizzata una lente di messa a fuoco, la distanza deve essere calcolata tenendo conto dell'angolo di inclinazione dell'obiettivo per mettere a fuoco il fascio nell'area desiderata del danno. Garantire una sicurezza adeguata quando si utilizza un dispositivo laser, compresa un'adeguata formazione e protezione degli occhi.
   8. Rimuovere il ratto dal dispositivo e chiudere il cuoio capelluto con 3-0 suture chirurgiche di seta.
   9. Interrompere l'anestesia e riportare il ratto nella sua gabbia per il recupero. Somministrare 0,1 mL dello 0,25% di bupivacaina localmente per ridurre il dolore postoperatorio subito dopo l'intervento chirurgico.
      NOTA: Se eseguita correttamente, l'intera procedura deve durare meno di 5 minuti.
3. Osservare il ratto per eventuali segni di disagio durante il recupero post-anestesia. Prima dell'emergere dall'anestesia, dare 0.01mg/kg buprenorfina intramuscolare per analgesia postoperatoria e continuare con dosi ripetute ogni 12 h per almeno 48 h.
4. I ratti di controllo del soggetto alle stesse condizioni senza sottoponerli al laser.

4. Punteggio di gravità neurologica (NSS)

1. Valutare il punteggio di gravità neurologica 24 h dopo la lesione cerebrale indotta dal laser utilizzando un punteggio di 43 punti¹³. Testare gli animali per deficit neurologici, disturbi comportamentali, attività di bilanciamento del fascio, e riflessi, assegnando punteggi più alti per le disabilità più gravi, come^{precedentemente dettagliato 13}.

5. Manipolazioni post-lesioni

1. Dopo la valutazione NSS, eutanasia i ratti esponendoli al 20% di ossigeno e 80% di CO2 (tramite ispirazione) e a perfutilizzare il ratto con salina tamponata di fosfati eparati (PBS, 0,9% NaCl).
   NOTA: Assicurarsi che il CO₂ venga consegnato a un tasso predeterminato in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Questo passaggio può anche essere eseguito sotto il 5% di anestesia isoflurana.
2. Raccogliere i cervelli e prepararsi per un ulteriore esame come descritto in un precedente protocollo¹¹.
3. Valutare l'emorragia subararacnoide (SAH) attraverso l'esame visivo di tutto il cervello dopo il suo isolamento dal cranio. Se necessario, a questo scopo può essere utilizzato un microscopio o un'omosta'.

6. Valutazione della lesione cerebrale

1. Determinazione del volume dell'infarto cerebrale e dell'edema cerebrale mediante colorazione TTC
   NOTA: 2,3,5-Cloruro di trifeniltetrazolium (TTC) colorazione è una procedura conveniente per il rilevamento infarto^{cerebrale 11}.
   1. Sezionare i cervelli raccolti in 6 fette coronali, ciascuno spessore di 2 mm.
   2. Incubare l'insieme di fette da ogni cervello per 30 min a 37 gradi centigradi in 0.05% TTC.
   3. Dopo la colorazione, eseguire la scansione delle fette con uno scanner ottico con una risoluzione di 1600 X 1600 dpi.
   4. Le aree non macchiate delle fette fisse del cervello sono definite come infarti¹².
   5. Utilizzando un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, freeware Image J) misurare l'area infartata non macchiata, gli emisferi ipsi e contralaterali per ciascuna delle 6 fette coronali.
   6. Calcolare il volume infarto come percentuale del cervello totale:
      
   7. Calcolare l'edema cerebrale utilizzando il metodo Kaplan:
      
2. Determinazione dell'entità della rottura della barriera ematica (BBB)
   NOTA: Valutare la rottura BBB 24 h dopo la lesione cerebrale indotta dal laser come segue:
   1. Somministrare il 2% di Evans Blue mescolato con soluzione salina da 4 mL/kg per via endovenosa ai ratti attraverso la vena della coda cannulated e lasciare che la soluzione circole per 1 h.
   2. Eutanasia ratti esponendoli al 20% di ossigeno e 80% CO₂ (tramite ispirazione) 24 h dopo l'ultimo NSS, come precedentemente^{descritto 13}.
   3. Raccogliere il colorante intravascolare localizzato come segue:
      1. Aprire le casse dei ratti con pincette chirurgiche e forbici chirurgiche.
      2. Perfuse gli animali con raffreddato 0.9% salina tramite il ventricolo sinistro utilizzando 110 mmHg fino ad ottenere un liquido perfusione incolore dall'atrio destro.
   4. Raccogliere i cervelli e tagliarli rostrocaudalmente in fette da 2 mm.
   5. Separare le fette del cervello sinistro dalle parti destra per valutare separatamente gli emisferi feriti e non feriti.
   6. Pesare, omogeneizzare utilizzando malta e pestello, e poi incubare i tessuti cerebrali in 50% acido tricloroacetico per 24 h.
   7. Centrifugare le fette cerebrali omogeneizzate a 10.000 g per 20 min.
   8. Mescolare 1 mL del supernatanto dal cervello centrifugato con 1,5 mL del 96% di etanolo a 1:3 e valutare la rottura della barriera emato-0-0-0 utilizzando un rilevatore di fluorescenza a 620 nm di lunghezza d'onda di eccitazione (10 nm di larghezza di banda) e lunghezza d'onda di emissione di 680 nm (larghezza di banda 10 nm).
      NOTA: entrambi i gruppi di ratti sono sottoposti allo stesso protocollo per determinare la rottura BBB.

Nessun decessi o SAH sono stati registrati nei gruppi di controllo o sperimentali (Tabella 1). Il gruppo MCAO aveva un tasso del 20% sia di mortalità che di SAH.

Anche i cambiamenti relativi della temperatura corporea nei ratti di entrambi i gruppi erano simili, nonostante una differenza nella variabilità di entrambi i gruppi (tabella 1).

C'era un SIgnificativamente peggiore NSS sia nel laser (16 x 1,1) che in MCAO (20 x 1,5) modelli, rispetto al gruppo di controllo a gestione fittizia (1 x 0,3; Tabella 1; p<0.01).

La lesione cerebrale indotta dal laser ha causato anche un aumento significativo del volume dell'infarto nell'emisfero bersaglio, rispetto al gruppo di controllo azionato da finto (2,4% - 0,3 contro 0,5% - 0,1; Tabella 2 e Figura 1A; p<0.01), per il test Mann-Whitney U. Tuttavia, il volume infarto del modello laser era più piccolo rispetto alla tecnica MCAO (2,4% - 0,3 contro 9,9% - 2,9).

L'edema cerebrale determinato 24 h dopo la lesione cerebrale sono mostrati nella Figura 1B e nella Tabella 2. Non c'era differenza nell'edema cerebrale tra il modello di lesione cerebrale indotta dal laser e il gruppo di controllo azionato da farsa (3,4% - 0,6 contro 0,7% - 1,2). C'era una differenza significativa nell'edema cerebrale tra il modello laser e la tecnica MCAO (3,4 x 0,6 contro 7 x 2,6†). I dati sono presentati come media : SEM.

Rispetto al gruppo di controllo azionato dalla finta, la lesione cerebrale indotta dal laser e la tecnica MCAO hanno entrambi causato un aumento significativo della rottura BBB nell'emisfero non ferito (563 ng/g , rispettivamente 66 e 1176 ng/g , 168, contro 141 ng/g ; Figura 2A e tabella 2; p<0.01) e emisfero bersaglio (2204 ng/g - 280 e 2764 ng/g , rispettivamente, 256, vs 134 ng/g - 11; figura 2B e tabella 2; p<0.01).

L'esame irologico del cervello dei ratti è mostrato nella Figura 3.

Tabella 1: Valutazione della NSS, della temperatura corporea, dell'emorragia di subarnoidi e della mortalità.

Tabella 2: Valutazione della ripartizione BBB, della zona infarta e dell'edema cerebrale. P < 0,01

Figura 1: Valutazione delle lesioni cerebrali nel modello laser 24 h dopo la lesione rispetto al modello MCAO e al controllo azionato da farsa. (A) Valutazione del volume infarto. C'è stato un aumento del volume infarto nel modello laser rispetto al controllo azionato da farsa (p<0.01). Tuttavia, il volume dell'infarto nel modello laser era più piccolo rispetto al modello MCAO (p<0.01). (B) Valutazione dell'edema cerebrale totale. C'è stato un aumento dell'edema cerebrale nel modello MCAO rispetto al modello laser o al controllo azionato da finte. Non c'era differenza nell'edema cerebrale tra il modello laser e il controllo fittizio. I dati sono misurati come % per l'emisfero contralaterale ed espressi come media : SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2: L'entità della ripartizione BBB rispetto ai controlli fittizi. (A) Emisfero contralaterale (non ferito). Sia il laser che il modello MCAO, hanno portato ad un aumento significativo della rottura BBB nell'emisfero non ferito rispetto al gruppo di controllo fittizio (p<0.01). (B) emisfero ipsilaterale (infortunato). C'è stata una differenza nella ripartizione ipsilaterale BBB nei modelli laser e MCAO rispetto al controllo fittizio (p<0.01). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esame irologico del cervello dei ratti da gruppi fittizi, laser e MCAO. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.