Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Yi Zhang; Kanako Kurosawa; Daisuke Nishiura; Mika Tei; Mikiko Tsudome

doi:10.3791/60945

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Articolo metodologico

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

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DOI:

10.3791/60945

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20 giugno 2020

Yi Zhang¹ , Kanako Kurosawa¹ , Daisuke Nishiura² , Mika Tei¹ , Mikiko Tsudome³

¹SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), ²Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), ³Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm² planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Abstract

I progressi nella risoluzione spaziale e nella sensibilità di rilevamento della strumentazione scientifica consentono di applicare piccoli reattori per la ricerca biologica e chimica. Per soddisfare la domanda di microreattori ad alte prestazioni, abbiamo sviluppato un dispositivo FemDA (Femtoliter droplet array) ed esemplificato la sua applicazione in reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) massicciamente parallele. Più di un milione di goccioline uniformi sono state prontamente generate all'interno di un'area delle dimensioni di un dito utilizzando un protocollo di sigillamento dell'olio in due fasi. Ogni goccia era ancorata in una microcamera femtolare composta da un fondo idrofilo e da una parete laterale idrofobica. La struttura ibrida idrofilo-in-idrofobico e gli oli e i surfactants di tenuta dedicati sono fondamentali per mantenere stabilmente la soluzione femtoliter aqueous nello spazio femtoliter senza perdita di evaporazione. La configurazione femtoliter e la semplice struttura del dispositivo FemDA hanno permesso un consumo minimo di reagenti. La dimensione uniforme dei reattori a goccia ha reso convincenti e affidabili le misurazioni quantitative e temporali su larga scala. La tecnologia FemDA ha correlato la resa proteica della reazione CFPS con il numero di molecole di DNA in ogni goccia. Abbiamo semplificato le procedure relative alla microfabbricazione del dispositivo, alla formazione delle goccioline del femtoltro e all'acquisizione e all'analisi dei dati microscopici dell'immagine. Il protocollo dettagliato con il basso costo di funzionamento ottimizzato rende la tecnologia FemDA accessibile a tutti coloro che hanno impianti standard di pulizia e un microscopio a fluorescenza convenzionale al proprio posto.

Introduzione

I ricercatori utilizzano i reattori per eseguire reazioni biochimiche. Ci sono sforzi significativi che sono stati fatti per ridurre le dimensioni del reattore e aumentare la produttività sperimentale al fine di ridurre il consumo di reagente migliorando al contempo l'efficienza del lavoro. Entrambi gli aspetti mirano a liberare i ricercatori da un carico di lavoro pesante, riducendo i costi e accelerando la ricerca e lo sviluppo. Abbiamo una chiara tabella di marcia storica sullo sviluppo delle tecnologie dei reattori dal punto di vista dei volumi di reazione e della produttività: singoli becher/flask/test-tube, tubi milliliter, tubi microliter, nanotubi microliter 8....