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Articolo metodologico

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

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DOI:

10.3791/60952

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20 maggio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Clinical Medicine Center of Tissue Engineering and Nerve Injury Repair, Nantong University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.

Abstract

Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall'isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all'esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.

Introduzione

Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l'intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l'epineurium. Nell'endoneurium, l'intera popolazione cellulare è composta da 48% SC, e una parte sostanziale delle cellule rimanenti coinvolge fibroblasti2. Inoltre, i fibroblasti sono componenti importanti di tutti i compartimenti nervosi, tra cui l'epineurium, il perineurium e l'endoneurium3. Molti studi hanno indicato che SC e fibroblasti svolgono un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dopo le lesioni nervose periferiche4,5,6. Dopo la transezione del nervo periferico, i fibroblasti perineuriali regolano lo smistamento delle cellule attraverso il percorso di segnalazione ephrin-B/EphB2 tra SC e fibroblasti, guidando ulteriormente la ricrescita assonale attraverso le ferite5 . I fibroblasti nervosi periferici secernono la proteina tenascina-C e migliorano la migrazione delle SC durante la rigenerazione dei nervi attraverso il percorso di segnalazione dell'integrazione diz1 7. Tuttavia, le SC e i fibroblasti utilizzati negli studi di cui sopra sono stati derivati dal nervo sciatico, che include nervi sensoriali e motori.

Nel sistema nervoso periferico, i nervi sensoriali (nervi afferenti) conducono segnali sensoriali dai recettori al sistema nervoso centrale (SNC), mentre i nervi motori (nervi efferenti) conducono segnali dal SNC ai muscoli. Studi precedenti hanno indicato che le Ccs esprimono fenotipi motori e sensoriali distinti e secernono fattori neurotrofici per sostenere la rigenerazione del nervo periferico8,9. Secondo un recente studio, i fibroblasti esprimono anche diversi fenotipi motori e sensoriali e influenzano la migrazione delle SC10. Pertanto, l'esplorazione delle differenze tra fibroblasti nervosi motori e sensoriali/SC ci permette di studiare i complicati meccanismi molecolari sottostanti della rigenerazione specifica del nervo periferico.

Attualmente, ci sono molti modi per purificare Le SC e i fibroblasti, tra cui l'applicazione di agenti antimitotici, citolisi mediata da anticorpi11,12, immunopanning sequenziale13 e substrato di laminina14. Tuttavia, tutti i metodi di cui sopra rimuovono i fibroblasti e conservano solo le SCs. SCs altamente purificate e i fibroblasti possono essere ottenuti con la tecnologia di selezione della citometria di flusso15, ma è una tecnica che richiede tempo e denaro. Quindi, in questo studio, è stata sviluppata una semplice digestione differenziale e un metodo di aderenza differenziale per purificare e isolare i fibroblasti nervosi sensoriali e motori e le SC al fine di ottenere un gran numero di fibroblasti e SC più rapidamente.

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Protocollo

Questo studio è stato effettuato in conformità con le Linee guida istituzionali per la cura degli animali dell'Università di Nantong. Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate eticamente dal Comitato di Amministrazione degli Animali Sperimentali, provincia di Jiangsu, Cina.

1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC

  1. Usa i ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni forniti dal Centro Sperimentale degli Animali della Nantong University of China. Mettere i ratti in un serbatoio contenente il 5% di isoflurane per 2-3 minuti, permettere agli animali di respirare lentamente e non hanno alcuna attività indipendente, e quindi sanificare utilizzando il 75% di etanolo prima della decapitazione.
  2. Utilizzare le forbici per tagliare la pelle posteriore per circa 3 cm e rimuovere la colonna vertebrale. Aprire accuratamente il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.
  3. Mantenere il midollo spinale in una piastra Petri da 60 mm con 2-3 mL di soluzione di sale bilanciato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).
  4. Sulla base della struttura anatomica, accise la radice ventrale (nervo motore) e poi la radice dorsale (nervo sensoriale) sotto un microscopio dissetante. Successivamente, metterli in una soluzione di sale equilibrato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).
  5. Dopo aver rimosso l'HBSS, affettare i nervi in pezzi da 3-5 mm con le forbici e digerire con 1 mL dello 0,25% (w/v) trypsin a 37 gradi centigradi per 18-20 min. Successivamente, integrare con 3-4 mL di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) per fermare la digestione.
  6. Pipette il composto su e giù delicatamente circa 10 volte e centrifugare a 800 x g per 5 min. Dopo di che, scartare il supernatore e sospendere il precipitato in 2-3 mL di DMEM integrato con 10% FBS.
  7. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro a 400 maglie, quindi inoculare le cellule in parabola Petri da 60 mm e coltura a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO2. Dopo 4-5 giorni di coltura, isolare il passaggio 0 (p0) fibroblasti e SC dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.
  8. Isolamento e cultura degli SCs (Figura 1)
    1. Lavare le cellule una volta utilizzando 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) di metapsina (37 gradi centigradi) per la piastra Petri a 60 mm per digerire le cellule per 8-10 s a temperatura ambiente. Dopo di che, aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS per fermare la digestione.
    2. Soffiare delicatamente la miscela per staccare le SC con una pipetta. Quindi raccogliere e centrifugare le SC a 800 x g per 5 min.
    3. Scartare il supernatante e sospendere il precipitato in 3 mL di DMEM con 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 2 forskolin e 10 ng/mL HRG, quindi inoculare le cellule in piatto Petri non rivestito da 60 mm. Dopo la coltura a 37 o 45 min, i fibroblasti (alcuni dei fibroblasti vengono digeriti con SCs) si attaccano sul fondo del piatto.
    4. Trasferire il supernatante (comprese le SC) in un altro piatto medio rivestito di poli-L (PLL) e cultura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
  9. Isolamento e coltura di fibroblasti (Figura 1)
    1. Dopo aver rimosso i SC (come mostrato al punto 1.8), lavare i fibroblasti rimanenti nei piatti con 1x PBS e quindi aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) trypsin per digerire i fibroblasti per 2 min a 37 .
    2. Aggiungere DMEM integrato con 10% FBS per terminare la digestione. Soffiare i fibroblasti con una pipetta, quindi raccoglierli e centrifugarli a 800 x g per 5 min.
    3. Scartare il supernatante, sospendere il precipitato con 2 mL di DMEM contenente il 10% di FBS, quindi inoculare le cellule nella parabola Petri da 60 mm non rivestita. I fibroblasti dopo la coltura per 30-45 min a 37 gradi centigradi si attaccano al fondo del piatto. Scartare il super-attante (compresi alcuni numeri di SC). Quindi aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS nel piatto fibroblasts e la coltura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
  10. Passare le cellule p1 fino a raggiungere 90% confluenza. Poi purificarli con la digestione differenziale e l'aderenza differenziale di nuovo come descritto nelle sezioni 1.8 e 1.9.
  11. Digerire i fibroblasti p2 e le SC dopo la coltura per 2 giorni, quindi raccogliere le cellule, contare e inoculare in 1 x 105 numeri / bene su diapositive Rivestite di PLL per l'immunocitochimica (ICC).

2. ICC per l'identificazione della purezza cellulare

  1. Coltura le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi ed eseguire la colorazione ICC dopo la digestione differenziale e l'aderenza differenziale dei fibroblasti motori e sensoriali e degli SC.
  2. Lavare i fibroblasti motori e sensoriali e le SC con 1x PBS e fissarli in 200 gradi centigradi di paraformaldeide del 4% (pH 7,4) per 18 min a temperatura ambiente.
  3. Bloccare le SC campione con buffer di blocco (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS contenente il siero di capra 5%) e bloccare i fibroblasti del campione con buffer di blocco (0,01 M PBS contenente 5% siero di capra) per 45 min a 37 gradi centigradi dopo averli lavati con PBS trecento.
  4. Rimuovere il buffer di blocco e incubare con i seguenti anticorpi primari: anticorpo monoclonale anti-CD90 del topo (un marcatore specifico per i fibroblasti) (1:1000) per i fibroblasti e gli anticorpi anti-S100 del topo (un marcatore specifico per sCs) (1:400) per le SC a 4 gradi centigradi.
  5. Eliminare gli anticorpi primari, lavare con PBS tre volte, e incubare con i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG (1:400) per fibroblasti e 488-coniugato capra anti-topo IgG (1:400) per SCs a temperatura ambiente per 1.5 h.
  6. Lavare i campioni tre volte con PBS, e macchiare i nuclei con 5 g/mL Hoechst 33342 coloranti per 10 min a temperatura ambiente. Lavare il campione con 1x PBS tre volte e montarli utilizzando il supporto di montaggio (20 gradi centigradi/scorrimento) sul vetrino di vetro.
  7. Prendere le fotografie delle cellule con microscopio a scansione laser confocale in tre campi casuali per ogni pozzo. Valutare il numero totale di nuclei e cellule CD90-positive, cellule S100-positive e quindi calcolare la percentuale di cellule CD90-positivo e S100-positivo, rispettivamente. Eseguire la colorazione in triplice copia.

3. Analisi della citometria di flusso (FCA) per l'identificazione della purezza cellulare

  1. Valutare la purezza dei fibroblasti motori e sensoriali e delle SC come descritto in precedenza da FCA16. In breve, digerire il motore p2 e i fibroblasti sensoriali e le SC con 0,25% (w/v) trypsin, risospendere i pellet cellulari e incubarli nel mezzo di fissazione a temperatura ambiente per 15 min.
  2. Incubare le cellule con mezzo di permeabilizzazione e sonda utilizzando anticorpi monoclonali del topo (0,1 g/106 cellule, 200 l) per fibrolanti e topo anti-S100 anticorpi (1:400, 200 - L) per SCs a temperatura ambiente per 30 min, rispettivamente.
  3. Incubare le cellule con 488 capre con coniugata IgG per 30 min.
  4. Incubare le cellule solo con 488-coniugato capra anti-toro IgG (fibroblasts Group) e topo IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipo (gruppo SCs), che serve come controllo negativo.

4. Analisi statistica

  1. Presentare tutti i dati come mezzi - SEM. Valutare le differenze statistiche nei dati tramite test tnon accoppiato utilizzando GraphPad Prism 6.0. Impostare la significatività statistica su p<0.05. Esegui tutti i saggi in triplice copia.

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Risultati

Osservazione microscopica leggera
Le SC e i fibroblasti sono le due principali popolazioni di cellule ottenute nella coltura cellulare primaria dai tessuti nervosi. Dopo l'inoculazione per 1 h, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del piatto e la morfologia cellulare è cambiata da rotonda a ovale. Dopo la coltura per 24 h, le SCs hanno esibito una morfologia bipolare o tripolare e la lunghezza di questi variava da 100 a 200 m. Dopo 48 h, si è verificata l...

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Discussione

Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l'85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l'1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibrobl...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 594 Capra Anti-Topo IgG(H+L)Life TechnologiesA11005Diluizione: 1:400
CoraLite488-coniugato Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)ProteintechSA00013-1Diluizione: 1:400
Microscopio a scansione laser confocaleLeica MicrosystemsTCS SP5
Software Cell QuestBecton Dickinson Biosciences
Soluzione salina bilanciata di D-HankGibco14170112
DMEMCorning10-013-CV
Microscopio da dissezioneOlympusSZ2-ILST
Siero fetale bovino (FBS)Gibco10099-141C
ForskolinSigmaF6886-10MG
Fluoroshield Mounting MediumAbcamab104135
Mezzo di fissazione/Mezzo di permeabilizzazioneMulti Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTDGAS005
Citometria a flussoBecton Dickinson BiosciencesFACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipoAbcamab106163Diluizione: 1:400
Anticorpo monoclonale di topo anti-CD90Abcamab225Diluizione: 1:1000 per ICC, 0,1 µ g per cellule 106 per Flow Cyt
Mouse anticorpo anti-S100Abcamab212816Diluizione: 1:400
Polilisina (PLL)SigmaP4832
Proteina del dominio EGF ricombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 D Systems396-HB-050
0,25% (con v) tripsinaGibco25200-072

Riferimenti

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