Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.
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Articolo metodologico
Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall'isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all'esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.
Introduzione
Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l'intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l'epineurium. Nell'endoneurium, l....
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Protocollo
Questo studio è stato effettuato in conformità con le Linee guida istituzionali per la cura degli animali dell'Università di Nantong. Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate eticamente dal Comitato di Amministrazione degli Animali Sperimentali, provincia di Jiangsu, Cina.
1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC
- Usa i ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni forniti dal Centro Sperimentale degli Animali della Nantong University of China. Mettere i ratti in un serbatoio contenente il 5% di isoflurane per 2-3 minuti, permettere agli animali di respirare lentamente e non h....
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Risultati
Osservazione microscopica leggera
Le SC e i fibroblasti sono le due principali popolazioni di cellule ottenute nella coltura cellulare primaria dai tessuti nervosi. Dopo l'inoculazione per 1 h, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del piatto e la morfologia cellulare è cambiata da rotonda a ovale. Dopo la coltura per 24 h, le SCs hanno esibito una morfologia bipolare o tripolare e la lunghezza di questi variava da 100 a 200 m. Dopo 48 h, si è verificata l.......
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Discussione
Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l'85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l'1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibrobl.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Capra Anti-Topo IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Diluizione: 1:400 |
| CoraLite488-coniugato Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Diluizione: 1:400 |
| Microscopio a scansione laser confocale | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Software Cell Quest | Becton Dickinson Biosciences | ||
| Soluzione salina bilanciata di D-Hank | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Microscopio da dissezione | Olympus | SZ2-ILST | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Mezzo di fissazione/Mezzo di permeabilizzazione | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Citometria a flusso | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipo | Abcam | ab106163 | Diluizione: 1:400 |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-CD90 | Abcam | ab225 | Diluizione: 1:1000 per ICC, 0,1 µ g per cellule 106 per Flow Cyt |
| Mouse anticorpo anti-S100 | Abcam | ab212816 | Diluizione: 1:400 |
| Polilisina (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Proteina del dominio EGF ricombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 | D Systems | 396-HB-050 | |
| 0,25% (con v) tripsina | Gibco | 25200-072 |
Riferimenti
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L.
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Ristampe e permessi
