Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

Sommario

Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l'impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

Abstract

La chirurgia stereotassica è uno strumento essenziale nel moderno laboratorio di neuroscienze. Tuttavia, la capacità di indirizzare in modo preciso e preciso le regioni cerebrali difficili da raggiungere rappresenta ancora una sfida, in particolare quando si prendono di mira le strutture cerebrali lungo la linea mediana. Queste sfide includono l'evitamento del seno sagittale superiore e del terzo ventricolo e la capacità di colpire costantemente nuclei cerebrali selettivi e discreti. Inoltre, le tecniche di neuroscienza più avanzate (ad esempio, optogenetica, fotometria delle fibre e imaging a due fotoni) si basano sull'impianto mirato di hardware significativo al cervello e le limitazioni spaziali sono un ostacolo comune. Qui viene presentato un protocollo modificabile per il targeting stereotassico delle strutture cerebrali dei roditori utilizzando un approccio coronale angolato. Può essere adattato a 1) modelli di topi o ratti, 2) varie tecniche di neuroscienza e 3) più regioni del cervello. Come esempio rappresentativo, include il calcolo delle coordinate stereotassica per il targeting del nucleo ventromediale ipotalamico di topo (VMN) per un esperimento di inibizione optogenetica. Questa procedura inizia con la microiniezione bilaterale di un virus adeno-associato (AAV) che codifica un canale del cloruro sensibile alla luce (SwiChR ++) in un modello murino Cre-dipendente, seguito dall'impianto bilaterale angolato di cannule in fibra ottica. Utilizzando questo approccio, i risultati mostrano che l'attivazione di un sottoinsieme di neuroni VMN è necessaria per le risposte controregolatorie del glucosio intatte all'ipoglicemia indotta dall'insulina.

Introduzione

Il controllo neurale del comportamento, dell'alimentazione e del metabolismo comporta il coordinamento di neurocircuiti altamente complessi, integrativi e ridondanti. Un obiettivo trainante del campo delle neuroscienze è quello di sezionare la relazione tra struttura e funzione del circuito neuronale. Sebbene gli strumenti classici delle neuroscienze (ad esempio, lesioni, iniezioni farmacologiche locali e stimolazione elettrica) abbiano scoperto conoscenze vitali riguardanti il ruolo di specifiche regioni del cervello che controllano il comportamento e il metabolismo, questi strumenti sono limitati dalla loro mancanza di specificità e reversibilità¹.

I recenti progressi nel campo delle neuroscienze hanno notevolmente migliorato la capacità di interrogare e manipolare la funzione del circuito in un modo specifico di tipo cellulare con un'alta risoluzione spaziotemporale. Gli approcci optogenetici² e chemiogenetici^3, ad esempio, consentono la manipolazione rapida e reversibile dell'attività in tipi di cellule geneticamente definiti di animali che si muovono liberamente. L'optogenetica prevede l'uso di canali ionici sensibili alla luce, chiamati channelrhodopsins, per controllare l'attività neuronale. La chiave di questa tecnica è la consegna genica di channelrhodopsin e una fonte di luce per attivare l'opsina. Una strategia comune per la consegna dei geni è attraverso una combinazione di 1) topi geneticamente modificati che esprimono Cre-ricombiinasi in neuroni discreti e 2) vettori virali cre-dipendenti che codificano per la channelrhodopsin.

Mentre l'optogenetica fornisce un mezzo elegante e altamente preciso per controllare l'attività neuronale, il metodo è subordinato al successo della microiniezione stereotassica del vettore virale e del posizionamento delle fibre ottiche in una regione cerebrale definita. Sebbene le procedure stereotassica siano comuni all'interno del moderno laboratorio di neuroscienze (e ci sono diversi protocolli eccellenti che descrivono questa procedura)^4,5,6, essere in grado di indirizzare in modo coerente e riproducibile regioni cerebrali discrete lungo la linea mediana (cioè l'ipotalamo mediobasale, un'area cerebrale critica per la regolazione delle funzioni omeostatiche⁷) presenta ulteriori sfide. Queste sfide includono l'evitare il seno sagittale superiore, il terzo ventricolo e i nuclei ipotalamici adiacenti. Inoltre, ci sono significative limitazioni spaziali all'impianto bilaterale di hardware che è necessario per gli studi di inibizione. Con queste sfide in mente, questo protocollo qui presenta una procedura modificabile per il targeting di regioni cerebrali discrete attraverso un approccio stereotassico angolato.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate in conformità con il National Institutes of Health, la Guida per la cura e l'uso degli animali e sono state approvate sia dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) che dalla Environmental Health and Safety dell'Università di Washington.

1. Calcolo delle coordinate angolate

1. Usando un atlante cerebrale coronale, segna un triangolo rettangolo in modo che l'ipoteno passi attraverso la regione target di interesse. Nell'esempio rappresentativo (Figura 1), il nucleo ventromediale ipotalamico (VMN) è mirato ad un angolo di 15° rispetto alla linea mediana coronale.
   NOTA: Il posizionamento dell'asse di rotazione raffigurato nella Figura 1 (e quindi la lunghezza del lato C) è arbitrario e può essere modificato per colpire qualsiasi regione del cervello. Anche se questo può sembrare controintuitivo, i passaggi successivi del protocollo regoleranno la posizione della testa nell'asse z in modo tale che questo punto si allinei con il centro di rotazione stereotassico (vedere paragrafo 6). Tuttavia, si raccomanda di non superare un angolo di rotazione coronale di 15° a causa di vincoli fisici dell'apparato portatesta.
2. Stabilire l'angolo desiderato (a) e la lunghezza stimata del lato B e utilizzare la trigonometria per calcolare la lunghezza dei lati A e C. Questo passaggio è importante per posizionare correttamente la testa durante la rotazione.
   NOTA: nell'esempio nella Figura 1, le linee della griglia dell'atlante vengono utilizzate per approssimare la lunghezza del lato B, ottenendo una lunghezza di 7,576 mm. Queste informazioni vengono utilizzate per calcolare la lunghezza del lato A:
   
   In questo esempio, 2,03 mm indicano la distanza R/L dalla linea mediana alla quale la cannula a fibre ottiche entra nel cervello quando la testa viene ruotata di 15°.
   1. Facoltativamente, calcolate la lunghezza del lato C per approssimare la coordinata D/V:
      
      NOTA: 1) La lunghezza dell'ipoteno (C) non rappresenta la profondità di iniezione, ma sarà utile per determinare la coordinata D / V, che potrebbe essere necessario regolare per adattarsi alla maggiore lunghezza rispetto al lato B per le iniezioni dirette. Si raccomanda pertanto di eseguire iniezioni di prova per ottimizzare la coordinata D/V. 2) In questo esempio mirato al VMN, si ottengono due insiemi di coordinate: una per la microiniezione non angolata (A/P = -1,4, R/L = 0,4 a 0°, D/V = -5,7) e una per l'impianto angolato di fibre ottiche (A/P = -1,4, R/L = 0,0 a 15°, D/V = -5,4).

2. Preparazione della stereotassa per la procedura angolata

1. Verificare che il telaio stereotassico e il micromanipolatore siano stati calibrati (vedere il manuale Kopf per il protocollo completo).
2. Posizionare il misuratore di altezza centrale nella presa della piastra di base del supporto della testa.
3. Fissare l'oscilloscopio di centraggio nel portautensili, quindi vedere l'oscilloscopio. Regolare la posizione del micromanipolatore fino a quando il mirino non è allineato e focalizzato sul mirino del calibro.
   NOTA: durante questa fase, l'oscilloscopio viene posizionato nel piano focale del centro di rotazione del supporto della testa. Una volta stabilito, il micromanipolatore non deve essere spostato durante i passaggi rimanenti.
4. Posizionare le barre auricolari nei supporti e centrarle in modo che le linee degli indicatori su entrambi i lati siano a 0 (Figura 3A).
5. Utilizzare le manopole mediale-laterali e anteriormente-posteriori sul supporto della testa (Figura 2) per allineare al centro le barre auricolari nei piani x e y sopra il mirino del misuratore di altezza centrale (Figura 3A).
6. Per allineare la posizione della barra auricolare nell'asse z, rimuovere le barre auricolari dal supporto e rimuovere il misuratore di altezza centrale. Sostituire le barre auricolari e centrarle di nuovo a 0.
7. Vista giù per l'ambito. Utilizzare la manopola di spostamento verticale (Figura 3B) e la manopola di inclinazione coronale, rispettivamente, per abbassare e ruotare le barre auricolari fino a quando il mirino dell'oscilloscopio rimane centrato tra le barre auricolari durante la rotazione coronale.
8. La stereotassa è ora calibrata e pronta. Non apportare ulteriori modifiche alla posizione del supporto della testa.

3. Preparazione dei materiali per l'iniezione/impianto

1. Assicurarsi che tutti gli strumenti, gli strumenti chirurgici e i materiali siano sterilizzati e collocati in un campo chirurgico sterile accanto alla stereotassa.
2. Gestire e conservare i costrutti virali in base al loro livello di biosicurezza e ai requisiti normativi istituzionali di biosicurezza pertinenti.
3. Aspirare il virus nella siringa, avendo cura di utilizzare pratiche di manipolazione adeguate e dispositivi di protezione individuale.

4. Anestesia

1. Registrare il peso corporeo del topo prima dell'intervento chirurgico.
2. Anestetizzare profondamente il mouse usando l'isoflurano.
3. Assicurarsi che il mouse sia profondamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento della dita fino a quando la risposta di flinching non è assente. Se l'animale continua a mostrare forti riflessi, aumentare la concentrazione e/o la durata dell'anestesia.
4. Applicare unguento per gli occhi su ciascun occhio per mantenerli umidi durante l'intervento chirurgico.
5. Rasare il cuoio capelluto da appena dietro le orecchie a appena dietro gli occhi con un tagliacapelli.
6. Fornire al topo un analgesico approvato da IACUC.
7. Monitorare continuamente l'animale durante la procedura chirurgica e fornire supporto termico.

5. Procedura chirurgica

1. Posizionare la testa nel supporto della testa posizionando gli incisivi superiori nello spazio nella barra del morso, assicurandosi che la lingua sia al di sotto della barra del morso.
2. Fissare la testa nelle barre auricolari inserendo delicatamente le barre auricolari nel meato uditivo esterno, assicurandosi che le barre auricolari siano posizionate simmetricamente (in genere tra tre e quattro per un topo adulto). Questo passaggio è fondamentale per garantire che la testa sia stabile e centrata per la rotazione.
3. Preparare asetticamente l'area di incisione rasata con tre scrub alternati di betadina e tamponi alcolici, o con preparazione alternativa del sito chirurgico approvata istituzionalmente.
4. Posizionare un drappo chirurgico sopra l'animale per mantenere un campo chirurgico sterile e ridurre il rischio di infezione post-operatoria.
5. Esporre il cranio facendo un'incisione lungo la linea mediana sagittale del cuoio capelluto. Raschiare delicatamente la superficie del cranio per rimuovere qualsiasi fascia ed esporre le suture.
   NOTA: se le linee di sutura sono difficili da visualizzare, il perossido di idrogeno può essere applicato al cranio utilizzando un applicatore sterile con punta di cotone per migliorare la visualizzazione della sutura.
6. Posizionare il cannocchiale di centraggio nel supporto e centrare il mirino su bregma (Figura 4, pannello di sinistra). Azzerare il micromanipolatore.
7. Sposta caudale il mirino su lambda, notando la distanza bregma-lambda (B-L).
   NOTA: se le linee di sutura non seguono una linea retta lungo la linea mediana, si consiglia di stabilire la linea mediana utilizzando la "linea di migliore adattamento" attraverso bregma e lambda. Tuttavia, se vengono seguiti i passaggi precedenti, il posizionamento iniziale del reticolo dell'oscilloscopio deve essere a metà strada tra le barre auricolari e avvicinarsi strettamente alla sutura della linea mediana B-L.
8. Se la distanza B-L è significativamente inferiore o superiore a 4,21 mm, regolare in modo incrementale il bregma assegnato per ottenere una distanza B-L di 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Sostituire l'ambito di centraggio con l'indicatore di allineamento. Posizionare le sonde su lambda e bregma e regolare la manopola di inclinazione dorsale sul supporto della testa per livellare nel piano sagittale (naso rivolto verso l'alto o verso il basso), quindi utilizzare il cannocchiale di centraggio per riassegnare bregma.
10. Utilizzare l'indicatore di allineamento per livellare nel piano coronale utilizzando la manopola di inclinazione coronale. Misurare in più punti lungo l'asse rostrale/caudale per tenere conto delle deformazioni superficiali del cranio.
11. Si noti la posizione sul quadrante della manopola di inclinazione coronale, in quanto questa è la posizione di rotazione di 0 °.

6. Allineamento degli assi centrali di rotazione per le coordinate angolate

1. Fissare l'oscilloscopio di centraggio nel portautensili e posizionare il micromanipolatore sulla coordinata calcolata dalla sezione 1. Si noti che la coordinata R/L per l'impianto angolato corrisponde alla lunghezza del lato A.
   1. Nell'esempio nella Figura 1, le coordinate angolate per il posizionamento in fibra ottica che mira al VMN sono (A/P = -1.4, R/L = [2.03] a rotazione coronale di 0°, [0.00] a rotazione coronale di 15°, D/V = -5.4).
2. Avvistare l'oscilloscopio e contrassegnare questa coordinata (R/L 2,03 mm dalla linea mediana per l'esempio VMN; Figura 4, pannello centrale). Questo segno rappresenta il punto in cui la cannula entrerà nel cervello una volta ruotata la testa.
3. Riposizionare il micromanipolatore sulla linea mediana (R/L = 0,00). Utilizzare la manopola di inclinazione coronale per ruotare la testa fino all'angolo calcolato nella sezione 1.
   1. Se il mirino dell'ambito è già allineato con il marchio, procedere alla sezione 7.
   2. Se il mirino dell'oscilloscopio non è allineato con il segno di riferimento, regolare la posizione della testa nell'asse z utilizzando la manopola di spostamento verticale (Figura 2) fino a quando il mirino non si allinea il più vicino possibile al segno.
4. Ruotare la testa all'indietro fino alla posizione coronale di 0°. Se lo spostamento verticale è stato regolato nel passaggio 6.3, riassegnare bregma utilizzando l'oscilloscopio di centraggio.
5. Ripetere i passaggi 6.3 e 6.4 fino a quando il mirino non colpisce costantemente il segno di riferimento quando la testa viene ruotata (Figura 4C).
6. A questo punto, il punto di rotazione arbitrario stabilito nella sezione 1 dovrebbe ora essere allineato con il centro di rotazione stereotassico.

7. Microiniezione

1. Posizionare il trapano stereotassico nel supporto e manovrare il micromanipolatore alla prima coordinata di iniezione.
   1. Secondo l'esempio per il targeting del VMN, forare a A/P = -1,4 e R/L = 0,4 mentre la testa è in piano.
2. Abbassare il trapano fino a quando la punta è appena sopra il cranio. Accendere il trapano e abbassare delicatamente fino a quando la punta non ha appena perforato il cranio (non la dura).
3. Ripetere per il sito di iniezione controlaterale.
4. Utilizzare un ago-driver sterile per introdurre una curva a 90° in un ago da 27-30 G (ad esempio, di una siringa da insulina sterile da 0,5 ml) e utilizzare l'ago piegato per colpire delicatamente la dura madre.
5. NOTA: in caso di sanguinamento, applicare una pressione con un applicatore sterile con punta di cotone e pulire con acqua sterile fino a quando il sanguinamento non si è fermato.
6. Quando è pronto per l'iniezione, posizionare con cura una siringa hamilton piena nel supporto stereotassico.
   NOTA: le coordinate sul micromanipolatore non si applicano più dopo il passaggio a un nuovo utensile. Utilizzare il centro del foro della bava come nuovo bersaglio per l'iniezione.
7. Posizionare con attenzione l'ago sopra il foro della bava.
8. Abbassare l'ago fino a quando non tocca leggermente la dura all'interno del centro del foro della bava. CRITICO: Azzerare il micromanipolatore solo nell'asse z, in modo tale che le coordinate sul micromanipolatore per l'oscilloscopio di centraggio stereotassico e il trapano siano mantenute.
9. Abbassare lentamente l'ago nel cervello, osservando attentamente per assicurarsi che l'ago non devii sul bordo del foro della bava. Continuare ad abbassare fino a 0,05 mm ventrali alla coordinata di iniezione D/V e attendere 1 min. Questo passaggio aggiuntivo crea una piccola "tasca" per ridurre al minimo il riflusso virale sulla rimozione dell'ago.
10. Sollevare lentamente l'ago alla coordinata D/V e iniziare l'iniezione.
    NOTA: la portata e il volume variano a seconda della regione di destinazione e del progetto sperimentale. Per il silenziamento optogenetico dei neuroni VMN, si desidera una copertura sufficiente, quindi 200 nL di virus vengono iniettati ad una velocità di 1 nL / s.
11. Dopo la microiniezione, attendere 10 minuti nel sito di iniezione per ridurre al minimo l'efflusso del virus durante la sospensione.
12. Prelevare lentamente la micropipetta dal cervello ad una velocità approssimativa di 1 mm/min.
13. Una volta che l'ago è libero dal cranio, espellere un piccolo volume di virus per assicurarsi che l'ago non si sia intasato di sangue o tessuti. Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per rimuovere il virus prima di continuare.
14. Ripetere i passaggi da 7,6 a 7,12 per il lato controlaterale.
15. Sigillare i fori della bava di microiniezione con cera ossea per migliorare la guarigione (Figura 5B).

8. Impianto di fibre ottiche

NOTA: Dopo l'iniezione virale, le cannule bilaterali in fibra ottica vengono impiantate all'angolo calcolato per sezione 1. Si noti che queste coordinate dovrebbero già essere segnate sul cranio dalla sezione 6.

1. Ripetete i passaggi 7.1 –7.4 per le coordinate angolate.
2. Riportare la testa in posizione di livello 0°.
3. Quindi, utilizzare il trapano a mano per produrre quattro fori aggiuntivi per le viti ossee: due devono essere posizionati anteriormente e due posteriormente (Figura 5A). Questi serviranno come ancore per fissare le fibre ottiche al cranio (Figura 5D).
   NOTA: Assicurarsi di distanziare i fori abbastanza lontano dai fori della bava delle coordinate angolate per ospitare la porzione di ghiera della fibra ottica che si trova sopra il cranio.
4. Il più delicatamente possibile, utilizzare il piccolo cacciavite a testa piatta per impostare le viti ossee in modo che si siedano saldamente nel cranio ma non penetrino nel cervello.
5. Bloccare una cannula a fibre ottiche nel supporto della cannula e posizionarla nel supporto stereotassico.
6. Ruotare la testa fino all'angolo calcolato, notando nuovamente che le coordinate sul micromanipolatore non si applicano al nuovo utensile. Utilizzare il centro dei fori di bava angolati come bersaglio dell'impianto.
7. Abbassare la fibra ottica fino a quando non tocca la dura all'interno del centro del foro della bava (Figura 5C). Azzerare il micromanipolatore nell'asse z, quindi rallentare lentamente la fibra ottica alla coordinata angolata D/V (-5,4 per l'esempio VMN).
8. Utilizzare gel cianoacrilato per collegare la ghiera in fibra ottica alle viti di ancoraggio ipsilaterali, quindi applicare un accelerante con una punta a micropipetta (Figura 5D).
9. Una volta che il gel di cianoacrilato si è completamente indurito, allentare delicatamente il supporto della cannula e sollevarlo fino a quando non si libera della ghiera della fibra ottica.
10. Ripetete i passaggi da 8,5 a 8,9 per la coordinata angolata controlaterale, quindi livellate la testa. Per una maggiore sicurezza, effettuare una connessione aggiuntiva tra le due cannule angolate in fibra ottica con il gel cianoacrilato e l'accelerante (Figura 5D).
11. Preparare una piccola quantità relativamente sottile di cemento dentale. Applicare sulla superficie del cranio, assicurandosi di coprire accuratamente le viti di ancoraggio e la base delle cannule in fibra ottica. Lasciare abbastanza della ghiera pulita per il successivo accoppiamento con i cavi patch in fibra ottica.
12. Una volta che il cemento è stato completato a secco, rimuovere il mouse dall'apparato stereotassico.
13. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero con supporto termico. Consenti che si riprenda e si trasferisca nella gabbia di casa una volta che appare vigile, mobile e sta pulendo.

9. Cure post-chirurgiche

1. Monitorare gli animali ogni giorno per 3 giorni post-operatoriamente per comportamento, postura, attività e toelettatura e tenere registri dell'assunzione di cibo e del peso corporeo.
2. Se gli animali presentano indicatori generali di dolore o cattiva salute, consultare i servizi veterinari.
3. Consentire ai topi almeno 2 settimane per il recupero e per l'espressione virale prima di iniziare gli studi comportamentali.

10. Optogenetica

1. Per l'esecuzione di studi di optogenetica, fare riferimento a Sidor et al.⁸.
2. Convalidare l'espressione virale e il posizionamento delle fibre al completamento degli studi.

Risultati

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'esecuzione di studi optogenetici per interrogare il ruolo dei neuroni VMN ipotalamici nel controllo glicemico⁹. Il primo utilizzo è stato un approccio stereotassico standard (non angolato) per la microiniezione bilaterale di un virus inibitorio channelrhodopsin al VMN. Mentre un approccio angolato sarebbe anche adatto, l'approccio standard (non angolato) è stato scelto perché è sufficiente per indirizzare la regione del cervello di interess...

Discussione

I recenti progressi nelle neuroscienze hanno supportato l'intuizione avanzata e la comprensione dell'attività e della funzione dei neurocircuiti cerebrali. Ciò include l'applicazione di tecnologie optogenetiche e chemiogenetiche per attivare o silenziare popolazioni neuronali discrete e i loro siti di proiezione in vivo. Più recentemente, questo ha incluso lo sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati (ad esempio, GCaMP, RCaMP) e altri biosensori fluorometrici (ad esempio, dopamina, noradrenalina) per la r...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cannule a fibre ottiche	Lenti doriche	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT
Kopf personalizzabile 1900 Sistema di allineamento stereotassico	Kopf	1900 Modello Kopf 1900-51
Misuratore di altezza centrale	Kopf	Modello 1900-51
Modello Kopf 1905 Indicatore di allineamento	Modello Kopf	1905
Kopf Modello 1911 Trapano stereotassico		Kopf Modello 1911
Kopf Modello 1915 Cannocchiale di centraggio	Modello Kopf	1915
Modello Kopf 1922 Barre auricolari a 60 gradi senza rottura Modello	Kopf	1922
Modello Kopf 1923-B Supporto per testa per anestesia a gas di topo	Kopf	Modello 1923-B
Modello Kopf 1940 Micro manipolatore	Kopf	Modello 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	-
Viti per osso di topo	Plastica Un	00-96 X 1/16
, ghiera da 1,25 mm	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill