Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Sommario

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Abstract

Le cellule ciliate sono cellule meccanosensoriali che mediano il senso dell'udito. Queste cellule non si rigenerano dopo danni nell'uomo, ma sono naturalmente rifornite in vertebrati non mammiferi come il pesce zebra. Il sistema di linee laterale zebrafish è un modello utile per caratterizzare la rigenerazione sensoriale delle cellule ciliere. La linea laterale è composta da organi contenenti cellule ciliate chiamati neurositi, che sono collegati tra loro da una serie di cellule interneuromast (INMC). Gli INMC agiscono come cellule progenitrici che danno origine a nuovi neurosott durante lo sviluppo. Gli INMIC possono riparare gli spazi vuoti nel sistema di linee laterale creato dalla morte cellulare. Un metodo è descritto qui per l'ablazione INMC selettiva utilizzando un microscopio confocale a scansione laser convenzionale e pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti verdi negli INMC. La microscopia time-lapse viene quindi utilizzata per monitorare la rigenerazione inMC e determinare il tasso di chiusura dello spazio. Questo rappresenta un protocollo accessibile per l'ablazione cellulare che non richiede apparecchiature specializzate, come un laser ultravioletto pulsato ad alta potenza. Il protocollo di ablazione può servire interessi più ampi, in quanto potrebbe essere utile per l'ablazione di ulteriori tipi di celle, impiegando un set di strumenti che è già disponibile per molti utenti. Questa tecnica consentirà ulteriormente la caratterizzazione della rigenerazione INMC in diverse condizioni e da diversi background genetici, il che farà progredire la comprensione della rigenerazione delle cellule progenitrici sensoriali.

Introduzione

Al centro della perdita dell'udito più progressiva si trova la distruzione delle cellule ciliate sensoriali, che trasducono stimoli uditivi estrinseci negli impulsi nervosi rilevabili dal cervello. La morte delle cellule ciliate cocleari causa una perdita permanente dell'udito, poiché i mammiferi adulti non hanno la capacità di rigenerare queste cellule a seguito di danni. Al contrario, i vertebrati non mammiferi come il pesce zebra possono rigenerare le cellule ciliate perse a causa di traumi acustici o insulti ototossici. La linea laterale meccanosensoriale zebrafish è un sistema di organi semplice e facilmente manipolato che può essere utilizzato per studiare la rigenerazione delle cellule^{ciliate 1,2,3}.

La linea laterale è costituita da piccole patch sensoriali chiamate neurositi, che sono collegate durante lo sviluppo da una serie di cellule allungate note come cellule interneuromast (INMC). Data la loro capacità proliferativa come cellule staminali apparenti che danno origine a nuovi organi contenenti cellule ciliate, il comportamento degli INMIC è di grande interesse per la comunità^4,5. Gran parte delle ricerche relative agli INBC hanno caratterizzato la soppressione della loro proliferazione da parte delle vicine cellule di Schwann che avvolgono il nervo della linea laterale, probabilmente attraverso un inibitore della segnalazione Wnt/β-catenina. ^6,7,8. Mentre la regolazione della proliferazione e differenziazione dell'INMC in nuovi neuroscit è stata ben descritta, i meccanismi che regolano la ricrescita dell'INMC dopo l'ablazione non sono stati chiariti. Questo protocollo serve come mezzo per ablare i singoli INBC e analizzare il loro successivo comportamento rigenerativo.

Sono stati pubblicati una varietà di metodi per distruggere le cellule ciliate, le cellule di supporto e interi neurositi, insieme a metodologie per monitorare il recupero. L'ablazione chimica funziona bene per le cellule ciliate, ma dosi di sostanze chimiche tossiche come CuSO_{4 devono} essere significativamente aumentate per rimuovere altri tipi di cellule della linea laterale⁹. Mentre l'elettroablazione sotto microscopia a fluorescenza è un mezzo efficace e semplice per distruggere gli INBC per studiare la rigenerazione, è difficile mirare strettamente e, pertanto, è probabile che produca danni collaterali significativi. Di conseguenza, ciò può mascherare aspetti dei comportamenti specifici di INMC^10,11. Sono stati utilizzati protocolli di ablazione laser, ma richiedono l'uso di apparecchiature specializzate non necessariamente presenti nel laboratorio medio o nella struttura di imaging (ad esempio, laser UV pulsati ad alta potenza^12). Il metodo qui descritto può essere eseguito con qualsiasi microscopio confocale a scansione laser dotato del comune laser a 405 nm, solitamente utilizzato per l'imaging di DAPI e altri fluorofori blu. Un vantaggio di questo metodo è che l'imaging confocale può essere eseguito immediatamente prima e dopo i danni cellulari senza coinvolgere ulteriori sistemi di controllo laser o trasferirsi in un altro microscopio dotato di un laser pulsato.

Un metodo simile è stato descritto per i neuroni in fiamme nel midollo spinale zebrafish¹³. Tuttavia, il metodo precedente richiede un modulo FRAP per l'ablazione delle celle, che non è un requisito per questo protocollo. Inoltre, date le proprietà distinte dei diversi tipi di cellule (cioè la luminosità della fluorescenza transgena, la profondità all'interno del corpo e la forma cellulare), è probabile che saranno necessarie modifiche significative a seconda del tipo di cella utilizzato. Il protocollo qui dettagliato ha maggiori probabilità di essere efficace per le cellule più superficiali, come supportato da una dimostrazione di ablazione sensoriale delle cellule ciliate usando lo stesso metodo. È inoltre delineato un saggio di rigenerazione per valutare i tassi di recupero dell'INMC dopo l'ablazione, che non era una caratteristica del suddetto studio.

Il protocollo di ablazione cellulare basato su laser descritto nel presente documento cattura la capacità rigenerativa degli INMIC attraverso l'ottimizzazione delle condizioni laser, l'imaging pre e post-ablazione e la microscopia time-lapse. Questi elementi si uniscono per rappresentare in modo completo la ricrescita inMC e la chiusura delle fessure nella sua interezza. Mentre questo protocollo viene utilizzato qui per distruggere gli INMIC, può essere applicato ad altri lavori che richiedono una valutazione affidabile ed efficace dell'ablazione cellulare. È anche una tecnologia accessibile, poiché può essere condotta su qualsiasi microscopio confocale dotato di un laser a 405 nm.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Pace University ai sensi del protocollo 2018-1.

1. Preparazione di larve di zebrafish

1. Impostare l'accoppiamento 3-5 giorni prima di condurre l'esperimento, in modo che le larve siano da 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) a 4 dpf di età quando montate per l'ablazione laser.
   NOTA: La linea et(krt4:EGFP)sqEt20 (abbreviata in ET20) enhancer trap line, in cui le cellule interneuromast sono chiaramente etichettate con proteina fluorescente verde avanzata (eGFP), consente un'identificazione cellulare relativamente facile e l'ablazione^11,14. Per la conferma della specificità e della flessibilità dell'ablazione laser, i pesci ET20 vengono allevati con pesci Tg(neuroD:tdTomato),in cui il nervo della linea laterale è etichettato con proteine fluorescenti rosse o con Tg(myo6b:βactin-GFP) per etichettare le cellule ciliate sensoriali con GFP^15,16.
2. Dopo la raccolta dell'embrione il giorno seguente, incubare embrioni a 28,5 °C in mezzo E3 contenente lo 0,0001% di blu di metilene fino a quando non sono pronti per anestetizzare e montare.

2. Preparazione di soluzioni di agarosio e tricaina a basso gelificante

1. A un pallone Erlenmeyer in vetro da 250 ml aggiungere 48 ml di mezzo E3 1x, 2 ml di soluzione di stock di tricaina da 15 mM e 0,5 g di agarosio a bassa fusione.
2. Microonde la soluzione in alto per 30 s e vortice (indossando guanti protettivi per il calore) per sciogliere l'agarosio. Ripetere i cicli di riscaldamento di 30 s fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.
3. Conservare l'agarosio in un'incubatrice riscaldata a 42 °C fino a quando non è pronta per l'uso.

3. Anestesia delle larve di zebrafish

1. Ad un tubo conico da 50 mL aggiungere 24 ml di 1x E3 medio e 1 ml di soluzione di stock di tricaina (15 mM) ad una concentrazione finale di 600 μM.
2. Caricare uno dei sei pozzi di una piastra di coltura cellulare a fondo piatto con 8 mL di E3 contenente 600 μM di tricaina.
3. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare le larve di zebrafish in un inserto di trasferimento con fondo a rete da 74 μm.
4. Trasferire l'inserto con fondo a rete nel pozzo della piastra a sei pozzi contenente la soluzione E3 + tricaina. Lasciare che le larve rimangano nel pozzo per un minimo di 3 minuti o fino a quando non sono completamente anestetizzate. Testare l'anestesia toccando l'inserto. Le larve non dovrebbero iniziare e nuotare in risposta al rubinetto.

4. Screening fluorescente delle larve di zebrafish anestetizzato

1. Pipetta una larva anestetizzata per pozzo su 12 scivoli rivestiti idrofobici per lo screening. Assicurarsi che vi sia una curvatura minima del menisco formato in ogni pozzo dello scivolo per ridurre la distorsione ottica durante lo screening. Questo può essere fatto rimuovendo un piccolo volume di E3 da ogni pozzo dopo aver posizionato le larve.
2. Sotto un obiettivo 10x su un microscopio verticale (dotato di una lampada ad arco di mercurio, lampada ad alogenuri metallici o sorgente luminosa a LED e un apposito cubo filtrante), schermo per larve che esprimono eGFP nei neurositi e nelle cellule interneuromast del sistema di linee laterale.
   1. Seleziona larve con un'espressione più forte con conseguente eGFP più luminoso, che presumibilmente sono omozigoti per il transgene.
      NOTA: Nella linea ET20, l'eGFP è espresso in un anello di cellule del mantello che circondano ogni neuromast e la stretta striscia di cellule interneuromast che collegano questi organi. Un'espressione eGFP più forte (fluorescenza più luminosa) contribuisce a un'ablazione più efficace.
   2. Per esaminare la specificità dell'ablazione, utilizzare larve a doppia transgenica con transgeni ET20 e Tg(neuroD:tdTomato). Se si screening per i portatori Tg(neuroD:tdTomato), utilizzare il set di cubi filtranti RFP per identificare una macchia rossa brillante appena posteriore all'orecchio che rappresenta il ganglio della linea laterale posteriore.
   3. Per ablare le cellule ciliate nei neuromascheri della linea laterale, utilizzare la linea transgenica Tg(myo6b:βactin-GFP) e lo schermo per la localizzazione della GFP al centro di ogni neuromast.
3. Seleziona le larve con spaziatura stereotipa dei neuroscopi. Le differenze nella spaziatura tra neurosumati possono indicare una deposizione neuromast anomala durante lo sviluppo, suggerendo un comportamento migratorio difettoso o la proliferazione cellulare nella linea laterale primordium¹⁷. Tali difetti possono anche influenzare il comportamento migratorio o rigenerativo degli INMIC a seguito dell'ablazione.
   NOTA: I difetti comuni nella spaziatura includono una distanza insolitamente grande tra il neuromast più anteriore depositato dal primordium migratore (prim1L1) e il secondo neuromast depositato dallo stesso primordium (prim1L2), spesso associato all'affollamento dei neuroscopne più posteriori.

5. Montaggio di larve per l'ablazione laser e l'imaging

1. Pipetta 3 - 4 larve anestetizzate in una piccola goccia di soluzione di E3 / tricaina al centro di un piatto con fondo di copertura (piatto da 35 mm con un copriletto numero 1,5 da 14 mm). Rimuovere la soluzione in eccesso in modo che le larve rimangano in una piccola goccia, abbastanza grande da contenerle.
2. Trasferire il piatto sullo stadio di un microscopio stereo binoculare e manipolare lo zoom e la messa a fuoco in modo che tutte le larve siano nel campo visivo.
3. Rimuovere il pallone Erlenmeyer contenente l'agarosio a basso punto di fusione dall'incubatore riscaldato. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire la soluzione di agarosio sullo scivolo del coperchio per produrre uno strato sottile. Estraggono l'agarosio in eccesso fino a quando il liquido riempie il pozzo nella parte inferiore del piatto, facendo attenzione a non aspirare larve.
4. Disporre rapidamente le larve nella soluzione di agarosio usando un coltello per capelli o un anello per capelli in modo che siano allineate tra loro e orientate con rostral a sinistra.
5. Premere delicatamente le larve contro il vetro con il coltello per capelli, in modo che giacciono di profilo con i lati destro verso il basso. Le larve di età superiore a 3 dpf tendono a galleggiare a causa delle loro vesciche gonfiate, quindi potrebbero dover essere ripetutamente premute contro il vetro fino a quando l'agarosio inizia a gelare.
6. Dopo circa 60 s l'agarosio inizierà a solidificarsi e le larve non potranno essere riorientate. Lasciare che circa 5 minuti a temperatura ambiente per l'agarosio sul coperchio scivolino per solidificarsi completamente. Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire il piatto a metà strada con E3 contenente 1 tricaina.

6. Individuazione di potenziali obiettivi e imaging pre-ablazione

1. Accendere l'alimentazione del sistema di microscopia confocale a scansione laser e inizializzarlo tramite il software di imaging integrato. Selezionare l'obiettivo di immersione dell'olio plan-apochromat 63x (apertura numerica 1.40) o simile. Applicare l'olio ad immersione e fissare il piatto in un inserto circolare in modo che le larve si affacciano con il loro aspetto rostrale a sinistra.
2. Sotto l'illuminazione a contrasto di interferenze luminose o differenziali, selezionare una delle larve montate per l'imaging. Regolare la messa a fuoco con la manopola di messa a fuoco in modo che la pelle sul lato del pesce più vicino al coverslip sia a fuoco, riconoscibile dal modello simile a un'impronta digitale delle cellule periderm.
3. Una volta a fuoco, passare all'illuminazione epifluorescente nel canale GFP. Individuare la linea laterale posteriore per espressione GFP lungo il miosio orizzontale. Anelli di cellule fluorescenti indicano cellule del mantello neuromast e filamenti allungati di cellule sono cellule interneuromast.
4. A partire dal neuromast primIL1, di solito situato appena dorsale al tuorlo, usa il joystick di controllo dello stadio o altro controllo del movimento dello stadio per scansionare visivamente caudally lungo il mioosepto orizzontale.
   1. Seguire la stringa di cellule interneuromast fino a raggiungere la regione tra i neuromascheri primIL3 e primIL4 (L3 e L4)(Figura 1A).
      NOTA: Anche altre regioni possono essere prese di mira, ma questa sezione del tronco e della coda tende ad essere più vicina al vetro di copertura e, quindi, più suscettibile all'ablazione.
   2. Se si imagingno più larve, impostare la posizione del primo stadio, quindi disattivare l'opzione posizioni a più stadi deselezionando la casella di controllo appropriata.
   3. Ripetere i passaggi da 6.4.1 a 6.4.2. per ogni posizione dello stadio desiderata (ogni larva).
5. Dopo aver identificato i corpi cellulari nella regione L3-L4, passare alla modalità di acquisizione.
   1. Attivare una traccia di imaging GFP utilizzando il laser a 488 nm o 491 nm.
   2. Aggiungere un canale di luce trasmessa (tubo fotomoltiplicatore di luce trasmessa o T-PMT) alla traccia laser attivata a 488 nm attivando la casella di controllo T-PMT sotto il menu a discesa "Imaging Setup".
   3. Impostare la potenza laser sul 6%, le dimensioni del foro stenopeico su 1 equivalente unità Airy e il guadagno digitale a 750 per l'imaging delle larve ET20. Il guadagno esatto e la potenza del laser possono variare per una data larva, a seconda di quanto vicino allo slittamento della copertura sono montati e della luminosità della fluorescenza. Regolare il guadagno in modo che i corpi cellulari siano saturi per catturare proiezioni altrimenti fioche e filipodia.
   4. Regolare i parametri in base a una dimensione del fotogramma di 1024 pixel x 1024 pixel, zoom digitale di 0,7 (dimensioni dell'immagine 145,2 μm x 145,2 μm). Impostare una media su 2 per migliorare la qualità dell'immagine.
6. Selezionare la casella z-stack per visualizzarlo nel menu a discesa posizione Z. Durante la scansione rapida, concentrati fino a quando le cellule interneuromast sono appena fuori fuoco. Impostare la prima fetta, quindi mettere a fuoco l'esempio fino a quando le celle interneuromast non sono di nuovo fuori fuoco. Impostare l'ultima fetta. Assicurarsi che comprenda una pila z di circa 25 μm. Impostare l'intervallo di imaging su 1 μm.
7. Avviare l'esperimento per acquisire uno z-stack di pre-ablazione (Figura 1B). Se sono state aggiunte posizioni di fase, disattivare l'opzione posizioni in modo che sia selezionata solo la posizione corrente. Salvare il file una volta acquisito.

7. Ablazione laser dei corpi cellulari

1. Clicca su "Mostra tutti gli strumenti". Questa opzione si trova nella parte superiore dell'interfaccia di acquisizione.
2. Fare clic sul menu a discesa per "Imaging Set Up". In "Imaging Set up", clicca su " Aggiungi una nuovatraccia" (rappresentata come "+").
3. In "Imaging Set Up", fate clic sul menu a discesa per "Dye". Selezionate DAPI come colorante.
4. Fate clic sul menu a discesa per "Canali" e deselezionate tutte le altre tracce deselezionando le rispettive caselle di controllo. Assicurarsi che sia selezionata solo la traccia DAPI.
5. Nella traccia DAPI, clicca su 405 per l' "impostazione Laser". Aumentare la potenza del laser al 75%. Deselezionare il canale DAPI per disattivare il laser durante la scansione dei corpi cellulari candidati per l'ablazione.
6. Con il corpo di una cella internauromast centrata nel campo visivo, ingrandisci il fotogramma di scansione a 20x-22x. Potrebbe essere necessario regolare la posizione del fotogramma per mantenere il corpo della cella al centro man mano che viene applicato lo zoom. Interrompere la scansione dal vivo non appena il corpo cellulare riempie il campo visivo.
   NOTA: Il corpo cellulare deve occupare l'intero campo visivo. A questo livello di zoom, il GFP sbianca rapidamente. Ridurre al minimo i tempi di esposizione laser lavorando rapidamente. Usa lo zoom piuttosto che selezionare una regione di interesse per aumentare la distribuzione della potenza laser su una piccola area.
7. Selezionare la scatola dell'otturatore laser da 405 nm per attivare la traccia. Regolare la potenza del laser al 75%. Impostare un timer per 45 s. Attivare la scansione continua e avviare il timer. Interrompere immediatamente la scansione alle 45 s.

8. Imaging post-ablazione e microscopia time-lapse per studiare la rigenerazione

1. Fate clic sul menu a discesa per "Canali". Nei canali, deselezionare la traccia "DAPI" per disattivare il laser di ablazione. Fare clic sul menu a discesa per "Modalità acquisizione".
2. In modalità di acquisizione, clicca su "Zoom".
3. Ridurre lo zoom a 0,7 utilizzando il dispositivo di scorrimento o digitando "0.7".
   1. Per garantire un'ablazione cellulare riuscita, aumentare il guadagno a 900 e scansionare rapidamente il campo visivo.
      NOTA: Nessuna FPG deve essere visibile all'interno della cella o delle celle di destinazione. Se la fluorescenza è ancora osservata, tornare ai passaggi 7.1–7.3.
   2. Utilizzando impostazioni uguali o simili a quelle descritte per l'imaging pre-ablazione, acquisire e salvare un'immagine post-ablazione (Figura 1C). Se l'immagine rivela resti di cellule fluorescenti o corpi cellulari aggiuntivi che devono essere rimossi, ripetere i passaggi di ablazione laser per creare uno spazio visibile nella stringa di cellule interneuromast.
   3. Ispezionare l'immagine del canale T-PMT per confermare ulteriormente i danni cellulari. Le cellule danneggiate avranno un aspetto granulare e spesso i nuclei si gonfieranno o diventeranno di forma irregolare (Figura 2).
4. Dopo aver acquisito un'immagine di pre-ablazione, aver ablato le celle se necessario e acquisito un'immagine post-ablazione per ogni singola posizione dello stadio, impostare la microscopia time-lapse attivando sia la posizione del palco che le opzioni di tempo per l'acquisizione dell'immagine. Impostare i parametri di tempo su 24 ore o un altro punto finale desiderato e intervalli di 15 minuti. Inizia l'esperimento per acquisire immagini e salvare il file risultante al termine (il giorno seguente).
5. Se le larve devono essere ulteriormente studiate o sollevate, rimuoverle con cura dall'agarosio usando forcep fini, quindi trasferire in mezzo E3 senza tricaina per il recupero. Se non devono essere utilizzati ulteriormente, eutanasia secondo il protocollo animale approvato (l'immersione rapida e sostenuta in un bagno di ghiaccio è un metodo comune) e smaltirli come richiesto dall'istituzione.

9. Analisi delle immagini

1. Aprire un file z-stack post-ablazione nel software di elaborazione delle immagini preferito (Table of Materials). Dividi i canali in modo che ogni canale si trova in un riquadro di visualizzazione separato.
2. Nella finestra del canale GFP, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea retta tra le punte degli INMIC rimanenti. Questo può essere aiutato scorrendo su e giù attraverso la pila z o eseguendo una proiezione di intensità massima prima di disegnare la linea.
3. Usate lo strumento "Misura" per ottenere la distanza tra le estremità INMC nei piani x e y.
4. Scorrete le z slice nello z-stack originale per determinare la distanza tra gli INMIC nel piano z.
5. Calcolare la distanza totale tra le estremità INMC usando il teorema di Pitagora (a² + b² = c²). L'ipotenusa è la distanza totale (o dimensione dello spazio).
6. Immettere la misurazione della distanza risultante in un'applicazione foglio di calcolo per l'analisi dei dati.
7. Esaminare i file di microscopia time-lapse raccolti nel passaggio 8.2-8.3 utilizzando il software di imaging integrato sul sistema confocale o il software di analisi delle immagini liberamente disponibile. Identificare il punto di tempo in cui lo spazio tra le cellule interneuromast è stato colmato dalle proiezioni cellulari. Questo può essere aiutato dall'esame di più fette z per confermare la chiusura dello spazio in tutte le dimensioni.
8. Per ottenere la misurazione più accurata della chiusura da tempo a gap, usate il timestamp dell'immagine post-ablazione (visibile in Finder o Esplora file) come punto di tempo zero; il tempo di misurazione dall'inizio della pila di immagini time-lapse può comportare una sottovalutazione del tempo di chiusura, a seconda del tempo trascorso durante la trasmissione di posizioni di fase aggiuntive, ecc.
9. Derivare la velocità di chiusura semplicemente dividendo la dimensione dello spazio originale (μm) per le ore o i minuti necessari per la completa chiusura dello spazio.

Risultati

Al fine di ablare gli INBC e registrare la rigenerazione, le larve di zebrafish che esprimono GFP schermate della linea transgenica ET20 sono state montate a 2 o 3 giorni dopo la fecondazione per l'ablazione come descritto nella fase 5.4. Diversi pesci possono essere montati contemporaneamente in modo che più time lapses possano essere catturati in un singolo esperimento. È stata identificata la regione della linea laterale situata tra i neuromascheri primIL3 e primIL4, e le immagini pre-ablazione sono state catturate come descritto nei passaggi 6.5-6.7 (Figura 1A,B).

Tre corpi cellulari sono stati presi di mira per l'ablazione laser per creare uno spazio nella stringa INMC di circa 40 μm. La scansione post-ablazione ad alto guadagno e la successiva imaging hanno confermato che nessun corpo cellulare è rimasto nella regione ablata, lasciando uno spazio tra le proiezioni allungate degli INMIC adiacenti (Figura 1C). La morte cellulare è stata ulteriormente dimostrata esaminando il canale T-PMT dopo l'ablazione. Le cellule danneggiate e morenti erano contrassegnate da nuclei gonfi e di forma irregolare e da un aspetto granulare(figura 2,delineata). In alcuni casi, l'imaging time-lapse ha anche rivelato il reclutamento di grandi cellule ameboidi che erano probabilmente macrofagi (Figura 2, asterisco). Le aree scure che circondano gli INMC ablati indicavano il fotobleaching nelle cellule periderm sovrascrienti. Queste cellule non sembrano essere state danneggiate o distrutte dall'irradiazione laser in questi esperimenti; piuttosto, la loro fluorescenza è stata temporaneamente ridotta. La microscopia time-lapse rivela che queste cellule normalmente si riprendono dopo l'ablazione e non cambiano forma o appaiono altrimenti danneggiate (risultati inediti, Volpe et al.).

Per supportare la specificità della distruzione INMC, le ablazioni sono state eseguite in larve ET20 e Tg (neuroD:tdTomato) in cui il nervo della linea laterale (che scorre solo micron sotto le cellule interneuromast) è etichettato con proteine fluorescenti rosse. Le ablazioni di diverse cellule che creavano spazi bilivibili nella stringa INMC hanno avuto poco o nessun effetto sul nervo della linea laterale basato sulla fluorescenza rossa (Figura 3). La flessibilità della tecnica per l'ablatura superficiale delle cellule localizzate è stata dimostrata dalla distruzione selettiva delle singole cellule ciliate sensoriali all'interno di neurositi della linea laterale. Utilizzando essenzialmente lo stesso protocollo sopra descritto (sezioni 7 e 8), le singole cellule ciliate nelle larve transgeniche Tg(myo6b:βactin-GFP) sono state distrutte senza danni apparenti alle cellule adiacenti(Figura 4). Le cellule ciliate ablate non hanno recuperato la fluorescenza dopo la microscopia time-lapse e i loro nuclei sono stati notevolmente granulari e deformi dopo l'esposizione al laser (Figura 4B). Analogamente alle ablazioni INMC, i macrofagi apparenti sono stati spesso reclutati nel sito di esposizione laser (risultati inediti, Volpe et al.).

A seguito dell'ablazione laser e dell'acquisizione dell'immagine post-ablazione, la dimensione dello spazio è stata misurata utilizzando un software di analisi delle immagini liberamente disponibile. Lo strumento di misura ha dimostrato dimensioni dello spazio che vanno da pochi micron fino a 100 micron, a seconda della larghezza dei singoli INBC e del numero di cellule scelte per l'ablazione (Figura 5). La microscopia timelapse è stata utilizzata per registrare i comportamenti INMC durante la rigenerazione. In 50 prove, 15 divari (30%) sono stati chiusi per rigenerazione entro un periodo di 24 ore. Nella maggior parte dei casi, gli INMIC che sono stati in grado di recuperare lo hanno fatto entro le prime ore dall'imaging. Il recupero è stato definito come il punto di tempo in cui sono entrano in contatto le proiezioni delle cellule vicine, che si è verificato 16 ore dopo l'ablazione per uno spazio di circa 40 μm (Filmato 1). Le pile Z sono state attentamente esaminate per garantire che il contatto cella-cella si verificasse all'interno di un singolo piano z, evitando possibili artefatti dovuti alle proiezioni z. L'analisi di regressione logistica ha rivelato che la probabilità di chiusura del gap era correlata con la dimensione del gap (p = 0,0453), con lacune minori che erano più propense a guarire. Un gap di 55,5 μm ha prodotto una probabilità di chiusura del 50% (Figura 5).

Nel 70% dei casi, gli INMIC non sono stati in grado di colmare completamente il divario creato dall'ablazione. Tuttavia, anche in questi casi siamo stati in grado di monitorare la formazione di lunghe proiezioni dagli INMIC vicini, che assomigliano per certi aspetti all'estensione dei coni di crescita neuronale (Film 2). Pertanto, questi esperimenti possono anche fornire informazioni sui comportamenti degli INMIC dopo il danno.

Figura 1: Ablazione selettiva delle cellule interneuromast mediante irradiazione laser. (A) Le cellule interneuromatiche tra i neurositi primIL3 e primIL4 sono state selezionate per l'ablazione. Queste celle mostrano una caratteristica forma del mandrino con proiezioni allungate che si sovrappongono ai corpi cellulari adiacenti. (B) L'imaging pre-ablazione ha identificato corpi cellulari che potrebbero essere ablati per produrre uno spazio. (C) L'imaging post-ablazione conferma l'ablazione riuscita come indicato dall'assenza di corpi cellulari nella regione gap. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'imaging post-ablazione dimostra la morte cellulare in risposta all'esposizione laser nelle cellule interneuromast etichettate GFP. L'imaging fotomoltiplicatore di luce trasmessa (T-PMT) indica la presenza di una cellula necrotica con un aspetto granulare (accerchiato) e il reclutamento di cellule di forma irregolare che sono probabili macrofagi (*). La fusione dei canali GFP e T-PMT conferma che la morte cellulare e l'attività del macrofago si sono verificate nel sito di ablazione. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Specificità dell'ablazione internauromast. (A) Cellule interneuromatiche con etichetta GFP pre-ablazione (verde) e nervo della linea laterale con etichetta tdTomato (rosso) in un Tg (ET20) a doppia transgenica; Larva NeuroD:tdTomato). I corpi cellulari in prossimità del nervo della linea laterale sono stati presi di mira per l'ablazione. (B) L'imaging post-ablazione dimostra l'ablazione di corpi cellulari mirati con un nervo di linea laterale intatto. Barre di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Ablazione delle cellule ciliate sensoriali mediante microscopia confocale. (A) L'imaging pre-ablazione ha identificato una cellula capillare sensoriale etichettata GFP (*) destinata all'ablazione nel pesce zebra a doppio transgenico Tg(ET20; myo6b:βactin-GFP). L'imaging a tubo fotomoltiplicatore di luce trasmessa (T-PMT) rivela la normale morfologia delle cellule cilieche, con una sezione trasversale rotonda. (B) L'imaging post-ablazione conferma l'ablazione riuscita della cellula capillare mirata. Un'immagine T-PMT indica irregolarità nella forma delle cellule ciliere e maggiore granularità dopo l'esposizione laser, suggerendo la morte cellulare piuttosto che il fotobleaching. Barre di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: La regressione logistica modella la probabilità di chiusura dello spazio in funzione della larghezza dello spazio (in μm). Un punteggio di 0 rappresenta la chiusura completa del gap, mentre un punteggio di 1 rappresenta la chiusura del gap incompleta. I risultati indicano che l'effetto della larghezza dello spazio sulla capacità delle cellule interneuromast di colmare i rispettivi divari è statisticamente significativo (p = 0,0453, n = 24 totali; n = 12 spazi chiusi, n = 12 spazi incompleti chiusi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato 1: Microscopia time-lapse che dimostra la chiusura dello spazio (~40 μm) dopo 16 h. Le immagini sono state catturate ogni 15 minuti e una proiezione z ad intensità massima è stata fatta per tutti i punti di tempo. Clicca qui per scaricare questo video.

Filmato 2: Microscopia time-lapse di un gap INMC che non si è chiuso. Vengono mostrate le proiezioni allungate e ramificate degli INMIC rimanenti. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Il protocollo descrive un metodo versatile per l'ablazione delle cellule laser che può essere eseguito su qualsiasi microscopio confocale dotato di un laser quasi ultravioletto (lunghezza d'onda di 405 nm). Questo protocollo affronta le limitazioni di metodi precedentemente utilizzati come l'elettroablazione (che causa danni^{più diffusi 11)}e l'ablazione UV-laser pulsata (che richiede ulteriori^{apparecchiature specializzate 12}). L'imaging confocale pre e post-ablazione fornisce un feedback rapido sul successo dell'esperimento. La successiva microscopia time-lapse offre un semplice saggio per la rigenerazione in un tipo di cella critico per lo sviluppo del sistema sensoriale.

È di vitale importanza prescreen per il pesce zebra transgenico che esprime fortemente la GFP nei neurosci e negli INMIC. Le larve con fluorescenza brillante e approssimativamente anche la spaziatura dei neuroscit derivati dal primI sono i candidati ideali per l'ablazione laser. Anche in questi pesci, ci sono occasionalmente INBC dimmer che possono al primo rilevamento della fuga. Queste cellule possono rimanere indietro dopo l'ablazione laser, impedendo la formazione di un vero divario tra gli INMIC. Il guadagno digitale deve essere regolato per rivelare queste cellule dimmer durante l'imaging pre-ablazione in modo che possano essere prese di mira anche con il laser a 405 nm (passaggio 8.2).

Allo stesso modo, il targeting laser a volte non distruggerà completamente una cellula; piuttosto, candeggina la fluorescenza, con conseguente incapacità di creare un vero divario. Queste cellule aumenteranno generalmente di fluorescenza durante la microscopia timelapse. La regolazione del guadagno nella fase di imaging post-ablazione insieme all'imaging T-PMT (Figura 2) aiutano a garantire che tutte le celle prese di mira siano state effettivamente rimosse. Spesso richiede due o tre singole ablazioni cellulari per produrre uno spazio nella stringa INMC. La morte cellulare può essere rilevata mediante bebbing o un aspetto granulare nelle cellule di destinazione; anche se, questo può richiedere un breve periodo di attesa dopo il targeting laser (e in alcuni casi, figure apparentemente apoptotiche o necrotiche sono osservate poco dopo).

Una limitazione di questa procedura è che potrebbe richiedere più prove sperimentali prima che le condizioni laser siano ottimizzate e la rigenerazione INMC abbia successo. La potenza del laser e il tempo totale di dimora del laser possono richiedere una leggera regolazione per diversi campioni. È stato scoperto che un'eccessiva applicazione laser può compromettere la capacità della linea laterale di ripararsi da sola. Ciò include sia 1) la sovraesposizione delle singole cellule all'irradiazione laser, presumibilmente causando ulteriori danni ai tessuti circostanti, sia 2) l'ablazione di troppe cellule nella stringa, portando a uno spazio più ampio. Gli utilizzatori devono raggiungere un equilibrio tra cellule sufficientemente irradianti per garantirne la distruzione e non sovraesporre le cellule, il che può rallentare o impedire la rigenerazione. Con le impostazioni appropriate, è stato riscontrato che gli INMIC possono essere rimossi senza danni visibili al nervo della linea laterale posteriore, indicando che i danni collaterali sono ridotti al minimo con questo protocollo a differenza dell'elettroablazione¹¹. In nessun caso sono state osservate nuove neuromaste nello spazio, presumibilmente perché il nervo della linea laterale rimane intatto e le cellule gliali sottostanti rimangono e inibiscono la proliferazione degli INMC^6,7,8,11.

È dimostrato che questo metodo di ablazione laser confocale può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, in particolare in quelli situati superficialmente all'interno dell'animale, comprese le cellule ciliate sensoriali (Figura 4). Un protocollo simile può essere utilizzato per ablare le cellule della pelle per esaminare la riparazione delle ferite o i neuroni per studi di rigenerazione assonale, come descritto^{in precedenza 13}. Si prevede che questa tecnica diventerà un'utile aggiunta al repertorio sperimentale di laboratori che possiedono un microscopio confocale ma nessun'altra apparecchiatura specializzata per l'ablazione laser.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini stampati in PTFE a 12 pozzetti Microscopia	elettronica Scienze	63425-05
15 mM Soluzione stock di tricaina	Sigma	E10521	15 mM Tricaina in acqua ad osmosi inversa
1X E3 + 600 &; M Tricaina			Diluire 15 mM Tricaina stock 25X in 1X terreno E3
1X terreno			Diluire 60X terreno E3 in 1X in acqua ad osmosi inversa (16,7 ml/L)
60 X terreno E3	Tutti i componenti acquistati da Sigma-Aldrich		34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2.2H2O, 9,8 g di MgSO4,7H20 in acqua ad osmosi inversa da 1 litro
Microscopio composto Bx60 con lampada ad arco di mercurio a fluorescenza	Olympus
LSM 700 dotato di laser da 405 nm, 488 nm e 555 o 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Per l'ablazione è stato utilizzato un laser da 5 mW 405 nm; Le ablazioni e l'imaging sono state eseguite attraverso un obiettivo Plan-Apochromat 63x con un NA di 1,40
FIJI/ImageJ Software di elaborazione delle immagini	Collaboratori		Scaricabile all'indirizzo https://fiji.sc/
Ago da dissezione modificato in coltello per capelli	Fisher Scientific	19010	Una ciglia è stata incollata all'estremità di un ago da dissezione con manico in legno
Software Microsoft Excel	Microsoft Corp.		Fogli Google è un'alternativa gratuita a Microsoft Excel
Piastre da 35 mm con fondo in vetro n. 1,5, vetrino coprioggetti, finestra da 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1,5-20-C	Piastra di Petri da 35 mm, finestra in vetro da 20 mm
Immersol 518F Olio da immersione Fisher	Scientific	12-624-66A
Agarosio a bassa gelificazione	Sigma Life Science	A9414-256
Inserto Corning Netwell con rete in poliestere da 74 um, inserto da 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Software	Rstudio Rstudio PBC		Scaricabile da https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereomicroscopio	Pipetta a trasferimento Motic
Fisher	Scientific	13-711-7M
Software ZEN	Carl Zeiss Microscopy, LLC