Articolo metodologico

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

DOI:

10.3791/60989

⸱

2 aprile 2020

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato riferito che le dimensioni e la forma delle spine dendritiche sono legate alla loro plasticità strutturale. Per identificare la struttura morfologica dei neuroni piramidali e delle spine dendritiche, può essere utilizzata una tecnica di etichettatura balistica. Nel protocollo attuale, i neuroni piramidali sono etichettati con dilC18(3) tintura e analizzati utilizzando un software di ricostruzione neuronale per valutare la morfologia neuronale e le spine dendritiche. Per studiare la struttura neuronale, vengono eseguite analisi di ramificamento dendritiche e analisi Sholl, consentendo ai ricercatori di trarre deduzioni rispettivamente sulla complessità della ramificazione dendritica e sulla complessità neuronale del rogo. La valutazione delle spine dendritiche viene condotta utilizzando un algoritmo di classificazione automatica assistita integrale del software di ricostruzione, che classifica le spine in quattro categorie (ad esempio, sottile, fungo, tozzo, filopodia). Inoltre, vengono scelti altri tre parametri (ad esempio, lunghezza, diametro della testa e volume) per valutare le alterazioni nella morfologia della colonna vertebrale dendritica. Per convalidare il potenziale di ampia applicazione della tecnica di etichettatura balistica, i neuroni piramidali della coltura cellulare in vitro sono stati etichettati con successo. Nel complesso, il metodo di etichettatura balistica è unico e utile per visualizzare i neuroni in diverse regioni del cervello nei ratti, che in combinazione con un sofisticato software di ricostruzione, consente ai ricercatori di chiarire i possibili meccanismi alla base disfunzione neurocognitiva.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel 2000, Gan et al. ha descritto una tecnica di etichettatura rapida per singoli neuroni e glia nel sistema nervoso che combinava vari coloranti lipofilici, consentendo l'etichettatura simultanea di molte cellule cerebrali con colori diversi1,2. Più recentemente, una tecnica di etichettatura balistica è stata descritta da Seabold et al.3 che ha introdotto coloranti fluorescenti (Dil) nei neuroni delle fette cerebrali. Una tecnica di colorazione versatile, l'etichettatura balistica è apprezzata per la sua capacità di essere utilizzata in più specie animali e in un'ampia gamma di età. Inoltre, può essere combinato con l'immunostaining per identificare le sottopopolazioni di cellule cerebrali3. Rispetto alle tecniche tradizionali (ad esempio, impregnazione dell'argento Golgi-Cox, microiniezione)4, l'etichettatura balistica offre l'opportunità di distinguere più chiaramente le caratteristiche morfologiche, tra cui le spine dendritiche, una caratteristica che è fondamentale per trarre deduzioni sulla complessità neuronale e la connettività sinaptica5 .

I neuroni piramidali eccitatori sono caratterizzati da un singolo, grande dendrite apicale, più dendriti basali più brevi e migliaia di spine dendritiche6. I neuroni piramidali si trovano in più regioni del cervello legate all'elaborazione cognitiva di ordine superiore, tra cui la corteccia prefrontale (PFC) e l'ippocampo. Nel PFC, i neuroni piramidali sono osservati negli strati II/III e nello strato V, con ciascuno che mostra una morfologia unica. In particolare, i neuroni piramidali nello strato II/III del PFC hanno un dendrite apicale più breve e meno ramificati rispetto ai neuroni piramidali nello strato V6. All'interno dell'ippocampo, i neuroni piramidali si trovano sia nelle regioni CA1 che IN CA3, ognuna delle quali mostra morfologie distinte. In particolare, i neuroni piramidali nella regione CA1 presentano una dendrite apicale più distintiva, con ramificature più lontane dal soma, rispetto alla regione CA36.

Spine dendritiche sui neuroni piramidali sia nel PFC che nell'ippocampo sono il sito primario di sinapsi eccitatorie7. Le caratteristiche morfologiche delle spine dendritiche, che sono classicamente caratterizzate in tre categorie primarie (cioè sottili, tozze o funghi8), sono state correlate alla dimensione della sinapsi eccitatoria9. Le spine sottili, caratterizzate da un collo lungo e sottile, una piccola testa bulbosa e densità post-sinaptiche più piccole, sono più instabili e sviluppano connessioni più deboli. Tuttavia, le spine di funghi, che hanno una testa dendritica più grande della colonna vertebrale, sono riconosciute per la formazione di connessioni sinaptiche più forti, un effetto derivante dalle loro dimensioni più grandi. In netto contrasto, le spine tozze sono prive di un collo della colonna vertebrale, mostrando un rapporto di volume testa e collo approssimativamente uguale8. All'interno dell'ippocampo, possono anche essere osservate spine ramificate, per cui la colonna vertebrale ha più teste che emergono dallo stesso collo dendritico della colonna vertebrale10. Pertanto, i cambiamenti morfologici delle spine dendritiche potrebbero riflettere la funzionalità e la capacità strutturale. Inoltre, studi hanno dimostrato che le dimensioni e la forma delle spine dendritiche si riferiscono alla loro plasticità strutturale, portando all'idea che piccole spine sono coinvolte nell'apprendimento e nell'attenzione, mentre le spine più grandi e più stabili, sono coinvolte in processi a lungo termine, compresa la memoria11. Inoltre, la distribuzione delle spine dendritiche lungo la dendrite può essere associata alla connettività sinaptica5,12.

Così, l'attuale carta metodologica ha tre obiettivi: 1) Presentare il nostro protocollo per l'etichettatura balistica, che è stato utilizzato con un tasso di successo (cioè neuroni che soddisfano i criteri di selezione e appropriato per l'analisi) di 83.3%5,12,13 e attraverso più regioni del cervello (cioè, PFC, nucleo accumbens, ippocampo); 2) dimostrare la generalizzabilità della tecnica e la sua applicazione ai neuroni cresciuti in vitro; 3) Dettaglio la metodologia utilizzata nel software di ricostruzione neuronale e le deduzioni che possono essere tratte da tali dati.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università della Carolina del Sud (numero di garanzia federale: D16-00028).

1. Preparazione del tubo di perline DiI/Tungsten

  1. Sciogliere 100 mg di polivinylpyrrolidone (PVP) con 10 mL di ddH2O. Vortex la soluzione PVP leggermente.
  2. Riempire il tubo con la soluzione PVP (vedere Tabella dei materiali) e lasciarlo per 20 min. Quindi, espellere la soluzione PVP attraverso l'altra estremità del tubo utilizzando una siringa da 10 mL.
  3. Unire 170 mg di microcarrier di tungsteno con 250 -L di cloruro di metilene. Vortice accuratamente la sospensione del perline di tungsteno.
  4. Unire 6 mg di tintura lipofilo DilC18(3) con 300 l di cloruro di metilene. Vortex la soluzione di tintura DilC18(3) accuratamente.
    NOTA: eseguire i passaggi da 1.3 a 1.4 in una cappa di fumi.
  5. Pipette 250 -L della sospensione perna di tungsteno su uno scivolo di vetro. Attendere che le sospensioni si asciughino (3 min).
  6. Aggiungere 300 L di DilC18(3) soluzione di tintura sulla parte superiore dello strato di sospensione del tallone di tungsteno. Mescolare accuratamente la soluzione di tintura DiIC18(3) e la sospensione del perline di tungsteno con una punta di pipetta e lasciare asciugare il composto all'aria (3 min).
  7. Una volta essiccata, utilizzare una lama di rasoio per dividere il composto in due tubi di centrifuga da 1,5 ml. Riempire i tubi con acqua.
  8. Sonicare in un bagno d'acqua (Amp I, 100%) fino a quando è omogeneo (5 min). Assicurarsi che la punta del sonicatore si trovi direttamente sui tubi con la sospensione del tallone.
  9. Unire i due 1,5 mL di miscela omogeneizzata in un tubo conico da 15 mL. Sonicare la miscela per altri 3 min.
  10. Disegnare la miscela di tintura di tungsteno-DilC18(3) nel tubo rivestito in PVP utilizzando una siringa da 10 mL. Alimentare il tubo nella stazione di preparazione (vedere Tabella dei materiali).
  11. Ruotare per 1 min sulla stazione di preparazione. Rimuovere con attenzione tutta l'acqua dal tubo utilizzando una siringa da 10 mL.
  12. Accendere il gas di azoto e regolare il flusso di azoto a circa 0,5 litri al minuto (LPM), ruotare il tubo nella stazione di preparazione e asciugare con azoto per 30 minuti.
  13. Rimuovere il tubo dalla stazione di preparazione e tagliarlo in lunghezze di 13 mm (corrispondente alla dimensione di carico della cartuccia) utilizzando una taglierina per tubi. Mantenere le lunghezze di 13 mm in fiale scintillanti al buio.

2. Preparazione delle sezioni cerebrali

NOTA: I ratti maschi adulti F344/N sono stati alloggiati in un ambiente controllato sotto un ciclo di luce 12/12: scuro con accesso ad libitum al cibo e all'acqua. Tutti gli animali sono stati curati per l'utilizzo di linee guida stabilite dai National Institutes of Health nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

  1. Anestesizza profondamente i ratti usando il 5% di sevoflurane.
  2. Procedere al passo successivo quando i ratti non rispondono agli stimoli nocivi e i riflessi sono assenti.
  3. Fissare il ratto in posizione supina all'interno di una cappa di fumi chimici.
  4. Fare un'incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana toracica. Separare il diaframma e aprire il petto con le forbici. Inserire un ago da 20 G e 25 mm nel ventricolo sinistro.
  5. Tagliare immediatamente l'atrio destro con le forbici. Perfusione di 50 mL di 100 mM PBS con 5 mL/min di portata. Perfuso 100 mL del 4% di paraformaldeide tamponato in 100 mM PBS.
  6. Rimuovere l'intero cervello di ratto subito dopo la perfusione.
  7. Suffisso l'intero cervello per 10 min con 4% paraformaldeide.
    NOTA: Non suffissare in 4% paraformaldeide per più di 30 min, perché influenzerà l'etichettatura.
  8. Tagliare 500 sezioni coronariche spesse 500 m utilizzando una matrice cerebrale di ratto (vedere Tabella dei materiali). Fare il primo taglio e mantenere la lama in posizione. Fare un secondo taglio utilizzando una seconda lama e rimuovere verticalmente la prima lama, mantenendo il tessuto sulla superficie della lama.
  9. Mettere le fette cerebrali in una piastra di 24 pozze con 1 mL di 100 m PBS in ogni pozzo. Ripetere questo processo fino a quando tutte le sezioni sono state tagliate.

3. Etichettatura balistica e visualizzazione delle sezioni del cervello

  1. Rimuovere il PBS da ogni pozzo mirato.
  2. Caricare la cartuccia con un pezzo di tubo di perline DiI/Tungsten e posizionarlo nell'applicatore.
  3. Inserire un pezzo di carta da filtro tra due schermi mesh. Collegare l'applicatore al tubo di elio. Regolare la pressione di uscita di elio a 90 libbre per pollice quadrato (psi).
  4. Posizionare l'applicatore verticalmente a mano sul centro del pozzo mirato ad una distanza di 1,5 cm tra il campione e lo schermo mesh. Fuoco il diI/Tungsten perline tubi.
    NOTA: Assicurarsi di rimuovere tutti i PBS dai pozzi mirati prima di scattare.
  5. Caricare la cartuccia con il prossimo tubo di perline DiI/Tungsten. Sparare continuamente le perline DiI/Tungsten dal tubo sulle fette rimanenti.
  6. Riempire la piastra 24 con 100 mM di PBS. Lavare con 500 litri di fresco 100 mM di PBS 3x. Non lasciare che le fette si capovolgano durante il lavaggio con PBS.
  7. Aggiungete 500 l di PBS fresco da 100 mM e tenetele a 4 gradi centigradi al buio per 3 h.
  8. Trasferire le fette di cervello su vetrini di vetro utilizzando un pennello fine.
    NOTA: Tre sezioni cerebrali possono essere trasferite su ogni vetrino di vetro.
  9. Aggiungere immediatamente 1 mL di supporto di montaggio antisbidisca su ogni sezione. Posizionare uno scivolo di 22 mm x 50 mm sulle sezioni cerebrali. Asciugare i vetrini di vetro al buio per 2 giorni.
  10. Accendere il sistema di microscopio confocale e passare a un obiettivo di 60 o più.
  11. Impostare il sistema di microscopio confocale in modo che abbia un ingrandimento di 60 o più (A/1.4, olio) e un intervallo piano z di 0,15 m (dimensione del foro pino 30 m, raggio del foro stenopeico retroproiettato 167 nm). Utilizzare una lunghezza d'onda di 543 nm per acquisire immagini dei neuroni di interesse.
  12. Ottenere immagini di stack z per il tipo di neurone mirato in base ai confini della regione del cervello e caratteristiche morfologiche dei neuroni.
    NOTA: Acquisire almeno tre immagini da ogni animale.

4. Uso della metodologia con la coltura cellulare

  1. Isolare i neuroni corticali primari dai ratti F344/N al primo giorno postnatale utilizzando la metodologia precedentemente riportata14.
  2. Cultura neuroni corticali primari in un piatto di fondo di vetro 35 mm per una settimana. Cambiare la metà del mezzo di coltura con mezzo di crescita del neurone fresco al terzo giorno dopo l'isolamento. Lavare il piatto inferiore in vetro 2x con 1 mL di 100 mM PBS.
  3. Fissare con 4% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi da 3,2 a 3,6 per etichettare in modo elitico le celle.
  4. Lavare con 1 mL di 100 mM PBS 3x. Aggiungete 500 l di PBS fresco 100 mM e conservatelo a 4 gradi centigradi al buio per 3 h.
  5. Aggiungete 200 l di supporto di montaggio anti-dissolvenza.
  6. Ottenere le immagini di stack z per ogni neurone mirato utilizzando i parametri nel passaggio 3.10.

5. Analisi neuronale e quantificazione della colonna vertebrale dendritica

  1. Neuroni ciechi che utilizzano numeri di codice per prevenire la distorsione dello sperimentatore.
  2. Stabilire criteri di selezione per i neuroni in base alla regione del cervello di interesse.
    NOTA: I criteri di selezione per i neuroni includono la colorazione dendritica continua, lo sfondo basso, nessun gruppo di coloranti all'interno delle cellule, la diffusione minima del colorante DiI nello spazio extracellulare, la corretta morfologia dei neuroni piramidali (Figura 1).
  3. Aprire il software di ricostruzione neuronale (vedere il video1 collegato ).
  4. Caricare un file di immagine facendo clic sull'immagine "File Folder" nell'angolo in alto a sinistra.
  5. Fare clic su "Soma" e contrassegnare il soma dei neuroni sull'immagine.
  6. Fare clic su "Albero" e selezionare "Guidata dall'utente".
  7. Traccia tutti i rami dendritici di interesse.
    NOTA: Per i neuroni piramidali, che sono caratterizzati da un dendrite apicale e più dendriti basilari, viene tracciata solo la dendrite apicale. Assicurarsi che tutti i rami di collegamento siano collegati l'uno all'altro.
  8. Fare clic su "Spina ".
  9. Definire i parametri di rilevamento e fare clic su "Rileva tutto".
    NOTA: per le sezioni cerebrali, i parametri coerenti utilizzati nelle regioni del cervello sono: 2.0 (Intervallo esterno), 0.3 (Altezza minima), 100% (Sensibilità rivelatore) e 10 (Conteggio minimo). Per la coltura cellulare, è necessario aumentare la sensibilità del rilevatore e diminuire il conteggio minimo.
  10. Classificare le spine selezionando "Classifica tutto".
    NOTA: le spine dendritiche sono classificate utilizzando un algoritmo integrale al software di ricostruzione neuronale15.
  11. Salvare la traccia selezionando l'immagine del disco nell'angolo in alto a sinistra.
  12. Eseguire analisi morfologiche della colonna vertebrale neuronale e dendritiche.
    1. Aprire il software di analisi quantitativa della ricostruzione neuronale (vedere Video collegato 2).
    2. Caricare l'immagine facendo clic su "File" e "Apri file di dati".
    3. Fare clic su "Analisi" e "Analisi della Struttura Ramificata" per analizzare la morfologia neuronale e la morfologia dendritica della colonna vertebrale.
    4. Per la morfologia neuronale, fare clic su "Totali albero" e selezionare la casella per "Totali dendriti".
    5. Per la morfologia dendritica della colonna vertebrale, fare clic su "Spine" e quindi selezionare la casella per "Dettagli spina dorsale".
    6. Salvare l'output come file di testo (.txt) facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella di output e selezionando "Salva su file".
    7. Fare clic su "Analizza" e "Sholl Analysis".
    8. Impostare Raggio iniziale su 10 m e Incremento raggio su 10 m.
    9. Fare clic sulla casella "Dendrites" e fare clic su "Visualizza".
    10. Salvare l'output come file di testo (txt) facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella di output e selezionando " Salvasu file".

6. Analisi dei dati

  1. Analizzare i dati di morfologia neuronale (cioè, complessità di ramificazione dendritica).
    1. Aggiungere il numero di dendriti in ogni ordine di ramo e dividere per il numero totale di dendriti. Moltiplicare per 100 per calcolare le frequenze relative per il numero di dendriti in ogni ordine di ramo.
  2. Analizzare i dati di analisi Sholl per esaminare la complessità neuronale del pergolato e la connettività dendritica della colonna vertebrale.
    1. Calcolare la media e l'errore standard della media per il numero di intersezioni in ogni raggio.
    2. Sommare il numero di spine dipendenti dal tipo di colonna vertebrale (cioè sottile, tozzo, fungo) ad ogni raggio e dividere per il numero totale di spine per quel tipo di colonna vertebrale. Moltiplicare per 100 per calcolare le frequenze relative per il numero di spine in ogni raggio.

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Risultati

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Nella Figura 2A , i neuroni piramidali tipici nella regione dell'ippocampo nelle sezioni cerebrali del ratto sono stati identificati dalla tecnologia di etichettatura balistica,caratterizzata da una grande dendrite apicale e diversi dendriti basali più piccoli intorno al soma. La figura 2B mostra il neurone nel software di analisi quantitativa della ricostruzione neuronale dopo che il soma è stato rilevato, sono stati tracciati rami dendritici e sono state rilev...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, descriviamo una tecnica di etichettatura versatile per i neuroni sia dal cervello del ratto che da quelli cresciuti in vitro. Inoltre, riportiamo la metodologia per l'utilizzo di software di ricostruzione neuronale e software di analisi quantitativa di ricostruzione neuronale per valutare la morfologia neuronale e le spine dendritiche. La valutazione della morfologia neuronale e delle spine dendritiche offre l'opportunità di determinare le alterazioni della complessità della ramificazione dendritica...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da NIH sovvenzioni HD043680, MH106392, DA013137, e NS100624.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago PrecisionGlide 20Gx25mmBD305175
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiCostar3562
Piastre con fondo in vetro da 35 mm MatTekCorporationP35G-1.5-20-C
Soluzione antibiotica-antimicoticaSupplemento Cellgro30004CI100X
B-27Life Technologies17504-04450X
Rivestimento del barilottoBIO-RAD165-2417
BoraceSigmaB9876
Acido boricoSigmaB0252
Supporto cartucciaBIO-RAD165-2426
Software di imaging confocaleNikonEZ-C1versione 3.81b
Microscopio confocaleNikonTE-2000E
Coperchio vetroVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
GlucosioVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Schermi di diffusione HeliosBIO-RAD165-2475
Kit pistola genetica HeliosBIO-RAD165-2411
Sistema pistola genica HeliosBIO-RAD165-2431
Tubo flessibile per elioBIO-RAD165-2412
Pinze per irideWorld Precision Instruments15914
Forbici per irideWorld Precision Instruments500216
Cloruro di metileneFisher ScientificD150-1
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf bioscienceanalisi della colonna vertebrale dendritica
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldeideSigmaP6148
Poli-L-LisinaSigmaP9155
PolivinilpirrolidoneFisher Scientific5295
Reagente antisbiadimento ProLong GoldFisher ScientificP36930mezzo di montaggio
Matrice cerebrale di ratto, 300 - 600 g, coronale, 0,5 mmTed Pella15047
SevofluranoMerritt Veterinary Supply347075
Bicarbonato di sodioLife Technologies25080
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154%
Kit siringheBIO-RAD165-2421
Tubo in tefzelBIO-RAD165-2441
Tripsina-EDTALife Technologies15400-054
TagliatubiBIO-RAD165-2422
Stazione di preparazione dei tubiBIO-RAD165-2418
Tungsteno M-25 Microcarrier 1.7 &; mBIO-RAD165-2269
Vannas ForbiciWorld Precision Instruments500086

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).
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  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).

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Spine dendriticheRicostruzione neuronaleAnalisi di ShollMicroscopia confocaleColorante DilC18 3Microsfere di tungsteno con supporto

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