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Articolo metodologico

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

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DOI:

10.3791/60996

⸱

10 aprile 2020

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.

Abstract

I modelli di xenotrapianto derivati dal paziente sono fondamentali per definire il modo in cui i diversi tipi di cancro rispondono al trattamento farmacologico in un sistema in vivo. I modelli murini sono lo standard sul campo, ma il pesce zebra è emerso come un modello alternativo con diversi vantaggi, tra cui la possibilità di alta produttività e screening farmacologico a basso costo. Il pesce zebra consente anche lo screening farmacologico in vivo con un numero elevato di replica che in precedenza erano ottenibili solo con sistemi in vitro. La capacità di eseguire rapidamente schermi di farmaci su larga scala può aprire la possibilità di medicina personalizzata con rapida traduzione dei risultati in clinica. I modelli di xenotrapianto di pesce zebra potrebbero anche essere utilizzati per esaminare rapidamente le mutazioni utilizzabili sulla base della risposta del tumore a terapie mirate o per identificare nuovi composti anti-cancro provenienti da grandi librerie. L'attuale principale limitazione nel campo è stata la quantificazione e l'automazione del processo in modo che gli schermi di droga possano essere eseguiti su scala più ampia ed essere meno laboriosi. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo xenotrapianto di campioni di pazienti primari in larve di pesce zebra ed eseguendo schermi di farmaci su larga scala utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata. Questo metodo consente la standardizzazione e la quantificazione dell'area tumorale innestata e la risposta al trattamento farmacologico in un gran numero di larve di pesce zebra. Nel complesso, questo metodo è vantaggioso rispetto allo screening farmacologico tradizionale della coltura cellulare in quanto consente la crescita delle cellule tumorali in un ambiente in vivo durante il trattamento farmacologico ed è più pratico e conveniente rispetto ai topi per schermi di farmaci in vivo su larga scala.

Introduzione

Lo xenotrapianto dei tumori primari dei pazienti primari o delle linee cellulari del cancro umano negli organismi modello è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la progressione e il comportamento del tumore in vivo, la risposta del tumore al trattamento farmacologico e l'interazione delle cellule tumorali con il microambiente, tra gli altri. Tradizionalmente, le cellule sono xenotrapinged in topi immunocompromessi, e questo rimane lo standard nel campo. Tuttavia, questo sistema modello ha diverse limitazioni, come ad esempio ad alto costo, bassi numeri di replica, difficoltà nel quantificare con precisione il carico tumorale in vivo e il tempo prolungato necessario per il completamento dei tumori e dei test antidroga. Negli ultimi anni, il pesce zebra è emerso come un modello alternativo di xenotrapianto, con il primo segnalato nel 2005, con linee cellulari di cellule di melanoma umano etichettate con proteina fluorescente verde (GFP) trapiantate in embrioni di stadio blastula1,2. Più recentemente, 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) larve di pesce zebra sono state utilizzate come destinatari di xenotrapianto per consentire il controllo della posizione anatomica dell'iniezione e per l'uso nell'imaging in vivo ad alta risoluzione dell'interazione tumorale con il microambiente circostante3,4.

Il pesce zebra offre molti vantaggi come modello xenotrapianto. In primo luogo, il pesce zebra adulto può essere alloggiato e rapidamente allevato in grandi quantità ad un costo relativamente basso. Ogni coppia di accoppiamento di pesce zebra adulto può produrre centinaia di pesci larva alla settimana. A causa delle loro piccole dimensioni, questi pesci zebra larva possono essere mantenuti in piastre di 96 pozze per lo screening farmacologico ad alto rendimento. Le larve non devono essere nutrite nel corso di un tipico esperimento di xenotrapianto, poiché il loro tuorlo-sac fornisce i nutrienti per sostenerle per la loro prima settimana di vita. Inoltre, i pesci zebra non hanno un sistema immunitario completamente funzionale fino a 7 dpf, il che significa che non richiedono irradiazione o regimi immunosoppressivi prima dell'iniezione di xenotrapianto. Infine, le linee di pesci zebra otticamente chiare consentono l'imaging ad alta risoluzione delle interazioni tumora-microambiente.

Forse l'applicazione più promettente del pesce zebra come modello di xenotrapianto è la capacità di eseguire screening farmacologico ad alto rendimento su campioni di cancro umano in un modo che non è possibile utilizzando qualsiasi altro organismo modello. Le larve assorbono farmaci dall'acqua attraverso la pelle, migliorando la facilità di somministrazione della droga5. Poiché gli animali sono mantenuti in piastre di 96 pozze, in genere in 100-300 - l of water, gli schermi richiedono quantità di droga più piccole rispetto ai topi. Attualmente, esistono diversi metodi per la standardizzazione e la quantificazione dell'effetto dei farmaci sul carico tumorale umano nel pesce zebra, alcuni dei quali sono più pratici di altri per aumentare il test di singolo farmaco per lo screening ad alto throughput. Ad esempio, alcuni gruppi dissociano i pesci in sospensioni a singola cellula e quantificano le cellule tumorali fluorescenti etichettate o macchiate mediante l'imaging di singole goccioline della sospensione e quantificando la fluorescenza utilizzando una macro ImageJ semi-automatica4. È stato sviluppato un metodo semiautomatico di imaging a larve intere in cui i pesci larvali sono stati fissati in piastre di 96 pozzetti e immagini utilizzando un microscopio fluorescente invertito prima del riallineamento delle immagini composite e della quantificazione dei foci delle cellule tumorali6. Entrambi questi saggi sono metodi abbastanza laboriosi per la quantificazione, che ha reso impraticabili lo screening dei farmaci ad alto consumo nei modelli di xenotrapianto di pesce zebra.

Questo problema è stato affrontato dallo sviluppo del Bioimager And -VAST (Pregerato) Di Vertebrate Automated Screening Technology (VAST), un campionatore di particelle di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzato (Figura 1 e Tabella dei materiali), che è un metodo veramente automatizzato per l'imaging ad alta velocità delle larve di pesce zebra7,8,9. Con questa unità, i pesci vengono anestesizzati, campionati automaticamente da una piastra di 96 pozzetti, posizionati in un capillare e ruotati nell'orientamento impostato in base a una preferenza utente preimpostata, immagini e quindi riposti nello stesso pozzo di una nuova piastra da 96 pozzetti per ulteriori studi o scartati. La combinazione di questa tecnologia di imaging con xenografti di pesce zebra può consentire la possibilità di una medicina personalizzata che utilizza lo screening farmacologico ad alta produttività di grandi librerie di composti farmacologici contro i tumori dei singoli pazienti. Gli xenograforti di pesce zebra offrono anche un metodo su larga scala e a basso costo per testare sia la tossicità che l'efficacia di nuovi composti in vivo. Il pesce zebra può essere utilizzato come fase di screening preliminare prima di procedere ai modelli di xenotrapianto del topo.

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplificato per lo xenotrapianto delle cellule di leucemia primaria del paziente nel pesce zebra e l'esecuzione di schermi di farmaci ad alta velocità con imaging e quantificazione automatizzati, che possono essere applicati a qualsiasi altra cellula tumorale primaria del paziente o linea cellulare del cancro. Questo flusso di lavoro ha utilizzato un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata per migliorare gli attuali metodi di standardizzazione e quantificazione e offre un'alternativa automatizzata ai precedenti metodi più laboriosi per quantificare la massa tumorale in vivo.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Kentucky (protocollo 2015-2225). I campioni di pazienti sono stati raccolti nell'ambito del Institutional Review Board dell'Università del Kentucky (protocollo 44672). Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati seguendo questo protocollo devono essere approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

1. Thawing Pazienti primari Cellule linfoblastiche acute

  1. Scongelare le cellule mononucleari del sangue periferiche del paziente (PBMC) da scorte congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Immediatamente dopo che le cellule si sono scongelate, trasferire le cellule nei loro mezzi di congelamento (90% FBS - 10% di zolfo dimetile [DMSO]) a un tubo conico da 15 mL con pipettatura lenta, evitando bolle d'aria. Aggiungete 10 mL di mezzi di scongelamento preriscaldati da 37 s (25% di siero bovino fetale [FBS] nel mezzo di Dulbecco modificato di Iscove [IMDM]) a goccia (circa 2-3 s per mL) alle cellule del tubo conico da 15 mL.
    NOTA: I PBMC sono stati raccolti da campioni di sangue del paziente al momento della diagnosi. Il mantello buffy è stato separato da centrifugazione di densità e le cellule sono state lavate 2x in RPMI 1640 - 10% FBS. Le cellule sono state contate e 107 cellule sono state congelate per crioviale in 1 mL di supporti di congelamento, e conservate a -80 gradi centigradi.
  2. Centrifugare le cellule a 100 x g per 10 min e aspirare i supporti dal pellet cellulare. Ripetere l'aggiunta di supporti di disgelo, centrifugazione e aspirazione un'altra volta per rimuovere qualsiasi DMSO residuo.
  3. Risospendere le cellule in 5 mL di salina con buffer fosfato (PBS) e rimuovere 10 -L per il conteggio su un contatore cellulare automatico o su un emocitometro. Aggiungere 10 l di trypan blu a 10 -L di cellule rimosse per il conteggio. Contare il numero di celle per mL e registrare per calcolare in un secondo momento il volume in cui rispendere le celle per lo xenotrapianto (vedere il passaggio 2.5).
    NOT: Tipicamente, 500 cellule sono xenotrapfted per pesce zebra larva. Ad esempio, sono necessarie 5 x 105 cellule per iniettare 1.000 pesci zebra. La viabilità dovrebbe essere >85% da utilizzare per lo xenotrapianto. In questo esperimento, la vitalità cellulare è stata del 96% dopo lo scongelamento, valutata dalla colorazione blu trypan.

2. Celle di etichettatura fluorescente con DiI

  1. Centrifugare il numero di cellulare desiderato in 5 mL di PBS a 200 x g per 5 min e aspirato supernatante. Macchiare un minimo di 2 x 106 cellule in caso di agglomerazione o problemi di caricamento dell'ago durante l'iniezione.
  2. Fare una soluzione di colorazione perclorrate (DiI) da 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) e risospendere il pellet cellulare nella soluzione di colorazione. Table of Materials
    NOT: La densità cellulare non deve superare 2 x 106 celle/mL quando viene risospesa nella soluzione di colorazione.
  3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi protette dalla luce per 20 min, vorticare delicatamente, quindi incubare le cellule sul ghiaccio per 15 min protette dalla luce.
  4. Centrifuga cellule a 200 x g per 5 min e aspirato supernatante. Lavare le cellule con 5 mL di PBS, centrifugare a 200 x g per 5 min e aspirato super-natante. Ripetere il lavaggio, la centrifugazione e l'aspirazione un'altra volta.
  5. Risospendere le cellule in 1 oL di PBS per 250.000 cellule vive e trasferirle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Tenere le cellule risospese sul ghiaccio al buio e continuare immediatamente a microiniezioni.
    NOT: Questo assicura che 500 cellule del paziente vengono iniettate nel pesce zebra con ogni pompa di iniezione di 2 nL di volume.

3. Microiniettamento larve di pesce zebra

NOT: Le microiniezioni devono essere completate entro 1/3 h di colorazione per migliorare la vitalità delle cellule.

  1. Prima di colorare le cellule e l'iniezione, fare piastre di agarose per l'iniezione versando 25 mL di 3% agarose in 1x Tris/borate/EDTA (TBE) in una parabola Petri e lasciarlo solidificare. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
  2. Anche prima di colorare le cellule e iniettare, dechorionate 2 dpf pesce zebra utilizzando pinze al microscopio dissezioso. Per la dechorionazione manuale, tirare da estremità opposte del chorion protettivo del pesce zebra con pinze fino a quando le lacrime di chorion e il pesce zebra diventa svelto10.
    NOT: La dechorionazione può essere eseguita anche utilizzando un trattamento ezimatico con pronase, come descritto in precedenza10. Per questiesperimentisono stati utilizzati pesci zebra Casper (roy-/;;nacre-/-). Qualsiasi ceppo larvale di pesce zebra può essere utilizzato per lo xenotrapianto. Se il pigmento interferisce con l'imaging o la visualizzazione, il trattamento del propylthiouracil (PTU) può essere utilizzato per bloccare la sintesi della melanina se i ceppi di pesce zebra otticamente chiari non sono disponibili12.
  3. Aghi prechill a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio per prevenire l'agglomeramento delle cellule durante la microiniezione. Caricare 5 -L di celle colorate in un ago di vetro borosilicato refrigerato non filato utilizzando punte di pipetta microloader.
    NOT: I metodi di impostazione del microiniettore e dell'ago sono stati precedentemente pubblicati13.
  4. Caricare l'ago nel braccio del microiniettore. Smussare la punta dell'ago con una lama sterile. Misurare la dimensione delle goccioline in olio minerale utilizzando un micrometro a stadi, mantenendo il volume delle goccioline in modo coerente a 2 nL (diametro di 0,15 mm) in tutto.
  5. Utilizzare 350 -L l di 4 mg/mL tricaine-S per anesthetizzare 30 dechorioned 2 dpf zebrafish in a Petri dish containing 25 mL of E3 media. Dopo 1 min di trasferimento delle larve anestesizzate in una piastra di iniezione superficiale piatta (3% agarose in una parabola di Petri) e iniettare larve con una pompa di cellule colorate nel sito di iniezione desiderato (ad esempio, il tuorlo o il pericardio; vedi Figura 2A,B).
    NOT: Il sito di iniezione deve essere scelto in base all'obiettivo dell'esperimento. Il sito di iniezione più comune è il tuorlo. Per far circolare le cellule nel flusso sanguigno, il pericardio, il condotto di Cuvier, lo spazio perivitelline o lo spazio retroorbitale possono essere utilizzati come siti di iniezione. Siti di iniezione ortotopica possono anche essere utilizzati, come il cervello.
  6. Lavare le larve dalla piastra di iniezione in una piastra Petri di 10 cm2 (30 larve per piatto) contenente mezzi E314 senza blu di metilene e incubare a 28 gradi centigradi per un periodo di recupero di 1 h. Continuare l'iniezione fino a quando non è stato iniettato un numero desiderato di larve.
    NOT: Idealmente, inietta 2,5 volte il numero di larve necessarie per gli esperimenti. Ci sarà qualche die-off di larve a causa dello stress da iniezione e l'aumento della temperatura di incubazione. Tipicamente, dopo la pratica con la tecnica, 800,1500 larve di pesce zebra possono essere iniettate da una sola persona all'interno di 1/3 h quando le cellule macchiate devono essere iniettate.
  7. Spostare le piastre delle larve iniettate in un'incubatrice di 34 gradi centigradi. Non posizionare i piatti Petri delle larve direttamente su una mensola metallica nell'incubatrice per evitare il surriscaldamento dell'acqua E3. Ad esempio, posizionare un piatto Petri vuoto tra lo scaffale e il piatto Petri delle larve per fungere da tampone. Rimuovere le larve di pesce zebra morte dopo 24 e 48 ore dopo l'iniezione (hpi).

4. Impostazione dello schermo del farmaco con il pesce zebra Xenoinfted

  1. A 48 hpi, larve di pesce zebra dello schermo per l'innesto fluorescenza/tumore e la salute(Figura 2C,D). Rimuovi qualsiasi pesce zebra morto o malformato e seleziona il pesce zebra con un innesto simile (Figura 2C, D, 1'3 e 1'3'). Rimuovere il pesce zebra senza engrafted(Figura 2C,D, 5 e 5').
    1. Per il tuorlo iniettato pesce, rimuovere i pesci dove i bordi del tuorlo non possono essere visti intorno massa cellulare innestata (Figura 2C, 4) come rende difficile la quantificazione. Per i pesci iniettati pericardio, rimuovere i pesci dove la massa cellulare iniettata invade nel sacco del tuorlo (Figura 2D, 4').
  2. Aggiungere il pesce zebra a una piastra da 96 pozze. Per fare questo, tagliare la punta di una punta di pipetta 200, abbastanza grande per un pesce zebra 4 dpf per adattarsi attraverso. Aspirate 150 - L di supporto E3 con un pesce zebra dalla piastra utilizzando una pipetta P200, e aggiungere ad un pozzo vuoto di un fondo piatto 96-bene piastra.
  3. Diluire il farmaco da testare nel volume richiesto dei supporti E3, a 150 . Preparare il farmaco a 2 volte la concentrazione desiderata. Ad esempio, preparare 20 M di droga in E3 se la concentrazione finale desiderata è di 10 M, poiché la metà del volume totale in ogni pozzo è costituita dalla soluzione del farmaco. Per il gruppo di controllo DMSO, aggiungere DMSO allo stesso volume del farmaco.
  4. Aggiungete 150 l di 2 x soluzione di droga diluita ad ogni pozzo contenente larve di pesce zebra in 150 gradi l di E3, per un volume finale di 300 l con 1x soluzione farmacologica per pozzo.
  5. Incubare la piastra a 34 gradi centigradi. Controllare il pesce zebra morto ogni giorno. Dopo 2 giorni, se lo si desidera, rinfrescare il farmaco rimuovendo 200 l' di liquido da ogni pozzo della piastra da 96 pozze e sostituendocon 200 -L di 1x soluzione farmacodicosa diluita o DMSO nei supporti E3.
    NOT: I migliori risultati sono stati trovati dopo 3 giorni di trattamento farmacologico per questo esperimento; tuttavia, la durata del trattamento farmacologico può variare da 2 a 4 giorni e potrebbe essere necessario ottimizzarla in base all'esperimento o all'uso di farmaci.

5. Imaging Xenoinfted pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio di fluorescenza e unità campionatore automatizzato

  1. Preparare 1 L di tricaina fresca 4 mg/mL e 1,5 L di supporti E3. Riempi il fbere da supporto 1 con i supporti E3 e la bottiglia media 2 con tricaina.
  2. Rimuovere tutti i canali fluorescenti indesiderati nel software di imaging e aggiungere il canale desiderato (DiI per questo esperimento). Controllare il canale fluorescente desiderato in quanto un'immagine verrà scattata solo per i canali con un segno di spunta. Inoltre, selezionare come le immagini saranno prese (z-stack, automazione, loop in serie, ecc.).
    NOT: Per questo esperimento, la messa a fuoco è stata impostata manualmente per ogni pesce fotografato per ottenere il maggior numero di immagini con messa a fuoco ottimale.
  3. Immagina il pesce di controllo DMSO prima del pesce trattato con il farmaco in modo che sia possibile impostare il tempo di esposizione appropriato nel software di imaging. Una volta impostata l'esposizione, non modificare il tempo di esposizione per la durata dell'esperimento.
    NOT: La messa a fuoco può essere regolata manualmente per ogni pesce zebra per garantire che non ci siano immagini fuori fuoco, o per l'imaging completamente automatizzato, lo stesso fuoco può essere utilizzato tra i pesci con immagini fuori fuoco scartate o il pesce ri-imaged prima di eseguire l'analisi. Inoltre, questo esperimento potrebbe essere condotto utilizzando qualsiasi imager fluorescente seguito da quantificazione della fluorescenza utilizzando il software ImageJ.

6. Quantificare la fluorescenza utilizzando ImageJ

  1. Aprire il software ImageJ.
  2. Vai a File . Aprire e selezionare il file .czi desiderato. Il software aprirà una finestra delle opzioni di importazione.
    1. Per la visualizzazione dello stack selezionare Hyperstacks, selezionare Apri file singolarmente, selezionare Scala automaticae selezionare Dividi canali. Per l'opzione colore, selezionare Colore.
  3. Fare clic su Plugins Macros Registra.
  4. Fare clic su Immagine . Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Selezionare il tipo di immagine in rosso nel menu a discesa sul lato destro della finestra di soglia. Regolare la soglia minima fino a quando il software evidenzia solo le aree con fluorescenza (Figura 3A) e fare clic su Applica. Il software convertirà la foto in bianco e nero, con l'area selezionata in nero.
    NOT: Utilizzare la stessa soglia per ogni immagine nella schermata del farmaco per mantenere i risultati standardizzati e confrontabili.
  5. Fare clic su Analizza . Misurare. Il software tirerà su una finestra dei risultati contenente l'area fluorescente per quell'immagine.
  6. Fare clic su Crea nella finestra Registratore macro. Si aprirà una nuova finestra con il codice per la macro. Evidenziare tutte le immagini desiderate per l'analisi e aprirle come nel passaggio 6.2.
  7. Selezionare Esegui nella finestra con la macro. La finestra dei risultati conterrà ora l'area per ogni immagine.
    NOT: L'analisi dell'immagine può essere eseguita singolarmente senza registrare ed eseguire una macro, nonché ripetendo i passaggi precedenti per ogni immagine.
  8. Copiare i dati misurati in un foglio di calcolo. Media della fluorescenza totale di tutti i campioni di controllo (DMSO). Calcolare la differenza percentuale utilizzando la seguente formula: –[(area Media DMSO – area sperimentale)/area DMSO media] x 100% (Figura 3B).

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Risultati

Seguendo il protocollo descritto sopra, il pesce zebra è stato xenotraping nel tuorlo e nel pericardio con PFC del paziente primario che sono stati originariamente isolati da un paziente a cutoblastico acuto a cellule T (T-ALL) alla diagnosi e incassati come un campione vitale e congelato. A 48 hpi, i pesci xenotrapianto sono stati sottoposti a screening per cellule tumorali con etichettafluere fluorescenti (Figura 2C,D) e trattati con chemioterapia (dexamethasone o vincrist...

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Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo standardizzato per scongelare e iniezione di cellule leucemiche primarie del paziente nel pesce zebra come modello di xenotrapianto. Abbiamo anche stabilito un protocollo per lo screening farmacologico ad alta produttività del pesce zebra xenotrapianto utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata. In precedenza, gli xenografi sono stati segnalati con linee cellulari umane, e la quantificazione dei tumori xenotrapi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata da un V Foundation V Scholar Award e NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) e NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x TBE Liquid Concentrate VWR0658-5L
Piastra a 96 pozzetti, fondo piattoCELLTREAT229195VAST è compatibile con una varietà di piastre standard o a pozzetti profondi da 24, 48 o 96 pozzetti
AgarosioFisher ScientificBP160-500
Capillare in vetro borosilicato senza filamentoSutter Instrument CompanyB100-50-10
DesametasoneEnzo Life SciencesBML-EI126-0001
DMSOSigma-AldrichD2438-5X10ML
E3 mediaN/A5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Femtotips Punte per microloaderEppendorf930001007
Siero fetale bovino (Premium Heat Inactivated)Atlanta BiologicalsS11150H
ImageJFIJIN/A
Dulbecco's MediumSTEMCELL Technologies36150
Campionatore di particelle di grandi dimensioni (LP)Union BiometricaN/AUnità di campionamento automatizzata http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
MethotrexateSigma-AldrichA6770-10MG
Olio mineraleFisher ScientificBP26291
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)Caisson labsPBL06-6X500ML
Stage Micrometer (400-Stage)Hausser Scientific400-S
Tricaine-SPentair AquaticTRS1
Trypan BlueThermo FisherT10282
VAST BioimagerUnion BiometricaN/ Un'unità diimaging per microscopio dotata di fluorescenza https://www.unionbio.com/vast/
Vincristina SolfatoEnzo Life SciencesBML-T117-0005
Vybrant DiI StainThermo FisherV22885
https://imagej.net/Fiji

Riferimenti

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