Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Summary

Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l'attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.

Abstract

Le piante sono una fonte di cibo per molti animali e possono produrre migliaia di sostanze chimiche. Alcuni di questi composti influenzano i processi fisiologici nei vertebrati che li consumano, come la funzione endocrina. I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, interagiscono direttamente con l'asse gonadale ipotalamo-ipofisi del sistema endocrino vertebrato. Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule di mammifero progettate per esprimere altamente il recettore degli estrogeni beta (ERβ) e che sono state trasfette con un gene luciferasi. L'esposizione a composti con attività estrogenica provoca che le cellule producano luce. Questo test è un modo affidabile e semplice per testare l'attività estrogenica biologica. Ha diversi miglioramenti rispetto ai saggi transitori di trasfezione, in particolare la facilità d'uso, la stabilità delle cellule e la sensibilità del saggio.

Introduction

Le piante sono una fonte necessaria di cibo per molti animali, fornendo calorie e sostanze nutritive fondamentali per la sopravvivenza, la riproduzione, la crescita, lo sviluppo e il^{comportamento 1}. Le piante producono migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali adattamenti per la propria crescita, manutenzione stomatica e riproduzione. Altri composti, considerati metaboliti secondari vegetali (PS), hanno funzioni meno chiare, anche se alcuni sono tossici e probabilmente utilizzati come difesa contro l'erbivoro e il parassitismo (ad esempio, alcaloidi, tannini)^2,3. Alcune di queste sostanze chimiche hanno la capacità di influenzare i processi fisiologici a lungo termine negli animali, come il funzionamento endocrino, anche se il motivo per cui questi fitochimici attivi dal punto di vista endocrino interagiscono con il sistema endocrino vertebrato non è^{ancora chiaro 2,4}.

I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, sono le PS polifenoliche che imitano strutturalmente e funzionalmente gli estrogeni, interagendo direttamente con l'asse gonadale ipotalomo-ipofisario del sistema endocrino vertebrato⁵. L'ingestione di fitoestrogeni nella dieta umana è associata alla protezione contro alcuni tumori, malattie cardiache e sintomi della menopausa, sebbene altri effetti includano problemi di fertilità. Infatti, gli effetti fisiologici di questi composti sono stati scoperti negli anni '40 quando l'infertilità negli ovini è stata attribuita al loro pascolo su trifoglio ricco di fitoestrogeni(Trifolium subterrareum)⁶. Quando ingeriti, i fitoestrogeni possono passare nelle cellule e imitare gli effetti degli estrogeni. Mentre i fitoestrogeni hanno avuto effetti negativi sulla fertilità delle pecore, la relazione tra fitoestrogeni e fisiologia non è semplice. Come le pecore, i rinoceronti bianchi meridionali mostrano sensibilità ai composti estrogenici nei mangimi derivati da elevate quantità di soia e erba medica. Le figlie di femmine nutrite con questa dieta durante la gravidanza hanno meno probabilità di riprodursi⁷. Tuttavia, altri studi hanno dimostrato che anche i fitoestrogeni possono avere effetti positivi, tra cui la maturazione dei follicoli ovarico nei^{topi più anziani 8,}la prevenzione di alcuni tumori, l'attività antiossidante e gli effetti antiproliferativi⁹.

L'ampiezza degli effetti dei fitoestrogeni non è sorprendente dato che gli estrogeni influenzano una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui crescita, sviluppo e regolazione del sistema nervoso riproduttivo e centrale¹⁰. Sebbene ci siano molti meccanismi di azione, i fitoestrogeni hanno spesso la capacità di modificare, migliorare o interrompere la segnalazione degli estrogeni attraverso la loro capacità di agire come ligandi per i recettori degli estrogeni intranucleari alfa e beta (ERα ed ERβ). Molti fitoestrogeni hanno una struttura ad anello fenolica simile agli estrogeni che consente loro di legare i recettori degli estrogeni. Quelli con attività estrogenica agonistica funzionano come estrogeni, formando un complesso ER-ligando attivato che può dimerizzare e legarsi a un elemento di risposta estrogenica (ERE) e innescare la trascrizione genica¹¹. Pertanto, estrogeni e fitoestrogeni regolano l'attività cellulare e il sistema funziona attraverso le loro azioni come fattori di trascrizione.

Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule cho dell'ovaio criceto cinese progettate per esprimere molto ERβ, che sono state trasfette con il gene della lucciola (Photinus pyralis) luciferasi collegato a un promotore ERE¹². Quando i composti estrogenici sono presenti, si legano al ER, dimerizzano e si legano all'ERE, portando alla trascrizione del gene della luciferasi. Dopo l'aggiunta di una soluzione di substrato, la luciferasi catalizza una reazione che porta all'emissione di fotoni. Pertanto, i campioni positivi producono campioni leggeri e negativi no.

Questo saggio disponibile in commercio elimina la necessità per i laboratori di trasfetto le cellule di mammifero con il gene reporter e il recettore degli estrogeni^13,14, che era instabile e variabile nell'efficacia. Il saggio fornisce una piattaforma di trasfezione stabile che consente di determinare rapidamente e semplicemente se una pianta ha attività estrogenica tramite legame del recettore.

Testiamo l'ipotesi che la soia abbia un'attività estrogenica più elevata rispetto a tutti gli altri alimenti date le loro concentrazioni conosciute di isoflavoni estrogenici^{15 usando} alimenti umani di generi alimentari locali.

Protocol

1. Preparazione di materiali vegetali

1. Congelare gli oggetti vegetali secchi che sono stati raccolti freschi utilizzando un liofilizzatore.
   1. Per proteggere i campioni dalla luce, coprire le camere con un foglio di alluminio durante il processo di asciugatura.
   2. Per assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti, lyophilize fino a quando le camere non si sentono più fredde al tatto e i materiali vegetali non perdono più massa quando pesati.
   3. Conservare le piante essiccate in sacchetti sterili a basso residuo in assenza di luce fino alla macinazione.
2. Macinare finemente i campioni utilizzando una rettificatrice con schermo a rete da 0,85 mm.
   1. Conservare i campioni macinati nei sacchetti in assenza di luce fino all'estrazione.

2. Estrazione di metaboliti secondari vegetali

1. Per estrarre i metaboliti vegetali secondari, utilizzare un rapporto di 1 g di campione essiccato a 10 mL di metanolo di grado HPLC.
   1. Pesare il campione su una bilancia analitica e aggiungerlo a un pallone Erlenmeyer di dimensioni appropriato (125 - 250 mL). Quindi aggiungere un volume appropriato di metanolo. Registrare la massa del campione estratto.
   2. Coprire la soluzione pianta-metanolo con un foglio di alluminio, quindi impostare per ruotare a 100 giri/min di velocità a temperatura ambiente (RT) per 3 giorni su uno shaker orbitale, consentendo ai composti potenzialmente estrogenici di dissolversi nel metanolo.
   3. Decantare il supernatante in un sistema di filtrazione a goccia utilizzando carta da filtro (125 mm).
   4. Utilizzando un evaporatore rotante, asciugare l'estratto vegetale fino a quando il campione non viene ispessito, ma versabile, in un pallone a fondo rotondo da 300 ml. Versare il campione in un pallone a fondo rotondo da 50 ml, risciacquando il pallone grande con una piccola quantità di metanolo. Continuare ad asciugare il campione nel piccolo pallone fino a quando il metanolo non viene completamente evaporato.
   5. Pesare il residuo del campione utilizzando una bilancia analitica. Registrare la massa dei residui.
   6. Sciogliere l'estratto vegetale in solfossido di dimetile (DMSO) ad una concentrazione di 0,1 g di estratto a 2 mL di DMSO. Vortice fino all'omogeneizzazione.
   7. Conservare la soluzione di estratto vegetale-DMSO a 4 °C in fiale di vetro ambrato fino al dosaggio.

ATTENZIONE: Le piante possono produrre sostanze chimiche biologicamente attive sconosciute e DMSO è un veicolo in grado di trasportarle attraverso le membrane cellulari. Utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati e prestare attenzione durante la manipolazione di questi campioni.

3. Recettore degli estrogeni umani β saggio di trasfezione¹²

NOTA: La tecnica aseptica e una cappa di flusso laminare sono necessarie per il primo giorno del protocollo di dosaggio.

1. Preparare diluizioni di 17β-estradiolo per la curva standard.
   1. Trasferire il mezzo di recupero cellulare e il mezzo di screening composto (CSM) dallo stoccaggio e dal disgelo del congelatore in un bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Etichettare i tubi a microcentrifugo Intermedio 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.
   3. Riempire INT1 con 995 μL di CSM, INT2 con 615 μL di CSM, tubo 1 con 900 μL di CSM e tubi 2-8 con 600 μL di CSM. Mettere da parte il tubo 8.
   4. Trasferire 5 μL di 100 μM 17β-Estradiolo Stock in INT1. Scartare la punta. Vortice.
   5. Prima di ogni trasferimento, sciacquare la pipetta 3 volte, quindi trasferire 10 μL da INT1 in INT2. Scartare la punta.
   6. Risciacquare pipetta 3 volte, quindi trasferire 100 μL da INT2 nel tubo 1. Scartare la punta. Trasferire 300 μL dal tubo 1 nel tubo 2. Ripetere per i tubi da 3 a 7. Scartare 300 μL dal tubo 7 nel contenitore dei rifiuti. Il tubo 8 è uno Zero e non riceve estradiolo. Le concentrazioni finali di standard placcati sono: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 e 0 pM estradiolo.
2. Preparare composti campione.
   1. Campioni di vortice.
   2. Prendere 4 μL di ogni campione vegetale in DMSO e aggiungere a 496 μL di CSM per produrre una soluzione DMSO allo 0,8%.
3. Scongelare rapidamente reporter cells.
   1. Recuperare il tubo di Cell Recovery Medium dal bagno d'acqua a 37 °C. Disinfettare la superficie esterna utilizzando il 70% di etanolo.
   2. Recupera reporter cells da -80 °C di stoccaggio e disgelo trasferendo 10 ml del CRM pre-riscaldato nel tubo delle celle congelate.
   3. Chiudere il tubo di Reporter Cells e trasferirlo in un bagno d'acqua a 37 °C per 5-10 minuti.
   4. Recupera il tubo di Reporter Cell Suspension dal bagno d'acqua. Invertire il tubo delle cellule più volte delicatamente per rompere gli aggregati di cellule e produrre una sospensione omogenea. Pulire la superficie del tubo con il 70% di etanolo.
4. Placcatura del saggio
   1. Distribuire 100 μL della sospensione reporter cell in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
   2. Distribuire 100 μL di campioni in triplice copia in pozzi di dosaggio appropriati.
   3. Trasferire la piastra in un incubatore di CO₂ da 37 °C, umidificato al 5% per 22-24 ore.
5. Scongelare il substrato di rilevamento e il buffer di rilevamento in un frigorifero scuro durante la notte per prepararsi al secondo giorno.
6. Appena prima della fine dell'incubazione della piastra, rimuovere il substrato di rilevamento e il buffer di rilevamento dal frigorifero e posizionarsi in un'area in condizioni di scarsa illuminazione fino a raggiungere l'equilibrio con RT. Una volta a RT, invertire delicatamente ogni tubo più volte per mescolare accuratamente le soluzioni.
   1. Immediatamente prima del completamento dell'incubazione, versare l'intero contenuto del buffer di rilevamento nel tubo del substrato di rilevamento per creare il reagente di rilevamento luciferasi. Mescolare delicatamente in modo da non produrre schiuma.
   2. Una volta completata l'incubazione, invertire la piastra per scartare il contenuto in un contenitore di rifiuti appropriato. Toccare delicatamente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente pulito per rimuovere le ultime goccioline dai pozzi.
   3. Aggiungere 100 μL del reagente di rilevamento luciferasi ad ogni pozzo. Lasciare riposare la piastra di dosaggio a RT per 15 minuti. Non scuotere il piatto.
7. Quantificare la luminescenza utilizzando un luminometro a lettura della piastra a 96 po'.

Results

Ventidue estratti di frutta e verdura comunemente trovati nelle diete umane sono stati vengono vengono Una varietà di alimenti sono stati saggiati, tra cui legumi, come soia, piselli da neve e piselli, poiché la famiglia dei piselli è una fonte nota di fitoestrogeni¹⁶, così come fichi, datteri, mais, carote, mele, banane, fragole, pomodoro, cavolo e cavolo. I composti interferenti endocrini si trovano in sostanze comuni (ad esempio plastica e pesticidi) e alcuni sono biologicamente attivi attraver...

Discussion

Il saggio ERβ reporter sviluppato per lo screening individuale di agenti farmaceutici è adatto anche per lo screening di alimenti vegetali per fitoestrogeni biologicamente attivi attraverso l'ERβ. Importanti considerazioni nel protocollo includono il trattamento dei campioni vegetali con cura: il materiale vegetale fresco deve essere asciugato rapidamente per prevenire lo stampaggio o altre degradazioni biologiche e deve essere tenuto lontano dalla luce per prevenire la fotolisi dei composti¹⁸. Il...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µ L pipetta
20 & micro; L pipetta
200 & micro; Pipetta
37 ° bagnomaria
37 °, umidificata 5% CO2 incubatore
70% etanolo
bilancia analitica
a flusso
dimetilsolfossido
vasca per terreni monouso,
Palloni			125 mL e 250 mL
Metanolo
Sistema di analisi Reporter, 1 saggio in formato 96 pozzetti	IB00411	Indigo Biosciences	- analizza 24 campioni più
liofilizzatore
, pipetta
, agitatore
, luminometro			ecc.
fiasche			da 50 mL e 300 mL
o vasche sterili per terreni multicanale Puntali
			200 & micro; L e 1000 µ L
Whatman grado 1
whirl-pak	sacchetti sterili in polietilene