Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l'attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.
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Articolo metodologico
Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piante sono una fonte di cibo per molti animali e possono produrre migliaia di sostanze chimiche. Alcuni di questi composti influenzano i processi fisiologici nei vertebrati che li consumano, come la funzione endocrina. I fitoestrogeni, i fitochimici endocrino-attivi più studiati, interagiscono direttamente con l'asse gonadale ipotalamo-ipofisi del sistema endocrino vertebrato. Qui presentiamo il nuovo uso di un saggio a base cellulare per migliorare gli estratti vegetali per la presenza di composti che hanno attività biologica estrogenica. Questo saggio utilizza cellule di mammifero progettate per esprimere altamente il recettore degli estrogeni beta (ERβ) e che sono state trasfette con un gene luciferasi. L'esposizione a composti con attività estrogenica provoca che le cellule producano luce. Questo test è un modo affidabile e semplice per testare l'attività estrogenica biologica. Ha diversi miglioramenti rispetto ai saggi transitori di trasfezione, in particolare la facilità d'uso, la stabilità delle cellule e la sensibilità del saggio.
Introduzione
Le piante sono una fonte necessaria di cibo per molti animali, fornendo calorie e sostanze nutritive fondamentali per la sopravvivenza, la riproduzione, la crescita, lo sviluppo e ilcomportamento 1. Le piante producono migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali adattamenti per la propria crescita, manutenzione stomatica e riproduzione. Altri composti, considerati metaboliti secondari vegetali (PS), hanno funzioni meno chiare, anche se alcuni sono tossici e probabilmente utilizzati come difesa contro l'erbivoro e il parassitismo (ad esempio, alcaloidi, tannini)2,3. Alcune di queste....
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Protocollo
1. Preparazione di materiali vegetali
- Congelare gli oggetti vegetali secchi che sono stati raccolti freschi utilizzando un liofilizzatore.
- Per proteggere i campioni dalla luce, coprire le camere con un foglio di alluminio durante il processo di asciugatura.
- Per assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti, lyophilize fino a quando le camere non si sentono più fredde al tatto e i materiali vegetali non perdono più massa quando pesati.
- Conservare le piante essiccate in sacchetti sterili a basso residuo in assenza di luce fino alla macinazione.
- Macinare finemente i campioni utilizzando una rettific....
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Risultati
Ventidue estratti di frutta e verdura comunemente trovati nelle diete umane sono stati vengono vengono Una varietà di alimenti sono stati saggiati, tra cui legumi, come soia, piselli da neve e piselli, poiché la famiglia dei piselli è una fonte nota di fitoestrogeni16, così come fichi, datteri, mais, carote, mele, banane, fragole, pomodoro, cavolo e cavolo. I composti interferenti endocrini si trovano in sostanze comuni (ad esempio plastica e pesticidi) e alcuni sono biologicamente attivi attraver.......
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Discussione
Il saggio ERβ reporter sviluppato per lo screening individuale di agenti farmaceutici è adatto anche per lo screening di alimenti vegetali per fitoestrogeni biologicamente attivi attraverso l'ERβ. Importanti considerazioni nel protocollo includono il trattamento dei campioni vegetali con cura: il materiale vegetale fresco deve essere asciugato rapidamente per prevenire lo stampaggio o altre degradazioni biologiche e deve essere tenuto lontano dalla luce per prevenire la fotolisi dei composti18. Il.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Dale Leitman per la formazione iniziale nell'uso di saggi transitori di trasfezione per determinare l'attività estrogenica degli alimenti vegetali primati. Grazie a Bradford Westrich e C. Eric Johnson per aver contribuito alla creazione di attrezzature di laboratorio e alla formazione degli studenti sui metodi di estrazione. Infine, grazie all'Università dell'Indiana per aver finanziato questa ricerca.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1000 µ L pipetta | |||
| 20 & micro; L pipetta | |||
| 200 & micro; Pipetta | |||
| 37 ° bagnomaria | |||
| 37 °, umidificata 5% CO2 incubatore | |||
| 70% etanolo | |||
| bilancia analitica | |||
| a flusso | |||
| dimetilsolfossido | |||
| vasca per terreni monouso, | |||
| Palloni | 125 mL e 250 mL | ||
| Metanolo | |||
| Sistema di analisi Reporter, 1 saggio in formato 96 pozzetti | IB00411 | Indigo Biosciences | - analizza 24 campioni più |
| liofilizzatore | |||
| , pipetta | |||
| , agitatore | |||
| , luminometro | ecc. | ||
| fiasche | da 50 mL e 300 mL | ||
| o vasche sterili per terreni multicanale Puntali | |||
| 200 & micro; L e 1000 µ L | |||
| Whatman grado 1 | |||
| whirl-pak | sacchetti sterili in polietilene |
Riferimenti
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A.
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Ristampe e permessi
