Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.
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Articolo metodologico
Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Si ritiene che le alterazioni dipendenti dall'attività nei livelli dei recettori sinaptici degli AMPA (AMPA) all'interno della densità post-sinaptica (PSD) rappresentino un meccanismo cellulare per l'apprendimento e la memoria. Palmitoylation regola la localizzazione e la funzione di molte proteine sinaptiche tra cui AMPA-R, fattori ausiliari e scaffold sinaptici in modo dipendente dall'attività. Abbiamo identificato la famiglia di geni indotti a differenziazione delle sinapsi (SynDIG) di quattro geni (SynDIG1-4) che codificano le proteine transmembrane specifiche del cervello che si associano agli AMPAR e regolano la forza della sinapsi. SynDIG1 è palmitoylated a due residui di cisteina situati nelle posizioni 191 e 192 nella regione juxta-transmembrane importante per lo sviluppo di sinapsi eccitatoria dipendenti dall'attività. Qui, descriviamo un approccio biochimico innovativo, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse e dimostrare la sua utilità con la famiglia SynDIG di proteine in lisato cerebrale del topo.
Introduzione
S-palmitoylation è una modifica post-traduzionale reversibile delle proteine bersaglio che regola l'associazione stabile della membrana, il traffico di proteine e le interazioni proteina-proteina1. Si tratta dell'aggiunta di una moiety di palmitato di 16 carbonio ai residui di cisteina tramite il collegamento di tioester catalizzato da enzimi palmitoyl acyltransferasi (PAT). Molte proteine sinaptiche nel cervello sono palmitoylated, tra cui AMPA-Rs e PSD-95, in modo dipendente dall'attività per regolare la stabilità, localizzazione, e la funzione2,3,4.....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida stabilite dai National Institutes of Health (NIH) e sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università della California, Davis.
1. Preparazione delle membrane cerebrali del topo
- Decapitare il mouse utilizzando un apparato di ghigliottina e sezionare rapidamente il cervello (in <1 min, se possibile, per ridurre al minimo i cambiamenti di palmitoylation che possono verificarsi durante la procedura di dissezione). Omogeneizzare immediatamente in 10 mL di buffer di omogeneizzazione (Tabella 1) in un omogeneizzatore di v....
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Risultati
L'immunoblorazione con anticorpi contro la proteina di interesse rivela lo stato palmitoylated (non, subente, doppiamente, ecc.) in lisa cervelli di topo come determinato da spostamento di mobilità rispetto a campioni in cui HAM non era incluso. In precedenza, avevamo dimostrato che SynDIG1 era palmitoylated in due siti utilizzando il asdetto ABE6; tuttavia, non siamo riusciti a determinare se entrambi i siti sono stati modificati nel tessuto cerebrale. Qui mostria.......
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Discussione
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo utilizzato il saggio ABE per dimostrare che SynDIG1 è palmitoylated a due residui di Cis axta-transmembrana conservati (che si trovano in tutte le proteine SynDIG) in modo dipendente dall'attività per regolare la stabilità, la localizzazione e la funzione6. Una limitazione è che l'analisi ABE richiede la purificazione dell'affinità con resine agarose coniugate alle moieties avidin e che come fase finale della procedura, con conseguente significativa perdita di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano K. Woolfrey per consigli e contributi sul saggio APEGS. Questi studi sono stati finanziati da sovvenzioni di ricerca per l'EdS della Whitehall Foundation e del NIH-NIMH (1R01MH1119347).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Idrossilammina (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Metossi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | o apparecchiatura equivalente |
| N-etilmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Altamente tossico. |
| Imager ottico per densitometria | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | o apparecchiatura equivalente |
| Provette in polipropilene con tappo | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Pipette sierologiche (vetro) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Centrifuga da tavolo | Beckman | Allegra X-15R | o attrezzatura equivalente |
| Tris(2-carbossietil) fosfina-cloridrato (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Riferimenti
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience.
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Ristampe e permessi
