Articolo metodologico

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

DOI:

10.3791/61037

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1 maggio 2020

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1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive l'uso dell'affollamento macromolecolare per creare un modello di tessuto ipertrocico umano in vitro che assomiglia in condizioni di vivo. Quando coltivati in un ambiente macromolecolare affollato, i fibroblasti della pelle umana presentano fenotipi, biochimica, fisiologia e caratteristiche funzionali simili al tessuto cicatriziale.

Abstract

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È stato dimostrato che i tessuti in vivo sono molto affollati da proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine, polisaccharide, ecc. Il seguente protocollo applica una tecnica di crowding macromolecolare (MMC) per imitare questo affollamento fisiologico attraverso l'aggiunta di polimeri neutri (crowders) alle colture cellulari in vitro. Studi precedenti che utilizzano Ficoll o dextran come crowder dimostrano che l'espressione del collagene I e della fibronectina nelle linee cellulari WI38 e WS-1 è notevolmente migliorata utilizzando la tecnica MMC. Tuttavia, questa tecnica non è stata convalidata nei fibroblasti cutanei umani ipertrofici primari (hHSF). Poiché le cicatrici ipertrofiche derivano dall'eccessiva deposizione di collagene, questo protocollo mira a costruire un modello di cicatrice ipertrotro ricco di collagene applicando la tecnica MMC con hHSFs. Questo modello MMC ottimizzato ha dimostrato di possedere più somiglianze con il tessuto cicatriziale in vivo rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare 2-D. Inoltre, è conveniente, efficiente in termini di tempo ed eticamente desiderabile rispetto ai modelli animali. Pertanto, il modello ottimizzato riportato qui offre un modello avanzato "in vivo" per studi ipertrofici correlati alle cicatrici.

Introduzione

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Il tessuto cicatriziale rappresenta il punto finale della riparazione dei tessuti. Tuttavia, in molti individui, specialmente quelli che soffrono di ustioni o traumi1, le cicatrici possono essere eccessive e impongono effetti indesiderati sulla morfologia e sul funzionamento della pelle guarita. Anche se i meccanismi esatti di formazione di cicatrici patologiche (cicatrici ipertrofiche e cheloidi) non sono completamente compresi, l'eccessiva deposizione di collagene durante la guarigione delle ferite è stata dimostrata essere un contributo essenziale2.

È ben noto che la trasformazione del fattore di crescita beta 1 (TGF-1) e dell'actina muscolare liscia alfa (ZMA) svolge un ruolo chiave nella formazione di cicatrici ipertrofiche. L'evidenza suggerisce che l'elevato TGF-1 stimola direttamente l'eccessiva deposizione di collagene regolando il percorso di segnalazione SMAD3. Inoltre, è stato trovato che l'sMA contribuisce alla formazione di cicatrici ipertrofiche regolando la contrazione cellulare e la reetilizzazione nel processo di guarigione della ferita4. La mancanza di modelli in vitro e in vivo adatti è un grave ostacolo allo sviluppo e alla valutazione di interventi e terapie per la correzione delle cicatrici. Lo scopo di questo studio è quello di utilizzare la tecnica MMC esistente per costruire un modello di cicatrice ipertrofica "in vivo" adatto per la valutazione di nuovi ed emergenti interventi legati alla cicatrice.

Riprodurre tessuto vivente al di fuori del corpo è stato un obiettivo per anni nella comunità scientifica. Lo sviluppo di tecniche in vitro all'inizio del ventesimo secolo ha in parte raggiunto questo obiettivo. Le attuali tecniche in vitro si sono leggermente evolute rispetto alla dimostrazione originale di Roux che le cellule embrionali possono sopravvivere all'esagono per diversi giorni in calda salina5. Tuttavia, le metodologie in vitro sono per lo più limitate atipi di cellule singole coltivati in 2D e non ricapitolano accuratamente i tessuti in vivo. Sebbene siano utili per esaminare la biochimica cellulare, la fisiologia e la genetica, i tessuti nativi sono 3D e incorporano più tipi di cellule. I sistemi in vitro 2D semplici sottopongano le cellule dei mammiferi ad ambienti altamente artificiali in cui l'architettura nativa specifica del tessuto viene persa6 . A sua volta, questo colpisce eventi intracellulari ed extracellulari, con conseguente morfologia cellulare anormale, fisiologia e comportamento7.

L'interesse alla base di questo protocollo sta nello sviluppo e nella gestione clinica di cicatrici e cheloidi ipertrofi. Mentre è ben noto che i fibroblasti dermici sono in gran parte responsabili dell'abbondante produzione di collageni presenti nel tessuto cicatriziale, coltivando fibroblasti dermici utilizzando sistemi 2D in vitro non riesce a riprodurre il turnover di collagene osservato in vivo8. I metodi in vitro contemporanei usano ancora essenzialmente la "calda salina", un ambiente completamente diverso da quello dei tessuti viventi. I tessuti in vivo sono estremamente affollati, con proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine e polisaccaridi, che occupano il 5-40% del volume totale. Poiché non ci sono due molecole che possono occupare lo stesso spazio allo stesso tempo, c'è poco spazio libero disponibile e una quasi completa assenza di acqua libera9.

La tecnica MMC impone vincoli che influenzano le proprietà termodinamiche del citosol e dei fluidi interstiziali. Le interazioni molecolari, i complessi di segnalazione recettore-ligando, gli enzimi e gli organelli sono confinati e limitati dall'interazione libera9. Anche le interazioni all'interno dell'ambiente pericellulare (cioè l'interstizio) sono vincolate. Recenti evidenze confermano che alte concentrazioni di macromolecole ineret in soluzioni affollate perturbno la diffusione, l'associazione fisica, la viscosità e le proprietà idrodinamiche10.

È interessante notare che diversi agenti di affollamento popolari (ad esempio, Ficoll, dextran, poliviglierino-PVP] e sodio 4-styrenesulfonate [PSS]) non sono equivalenti se applicati a diversi tipi di cellule e in diverse impostazioni. In uno studio precedente, Ficoll è stato segnalato per essere meno citotossico per le cellule staminali mesenchymiche rispetto al PVP. Questi risultati sono stati interpretati come la conseguenza della sua carica neutra e del raggio idrodinamico relativamente piccolo11. Al contrario, un secondo studio ha trovato che dextran è più efficace nello stimolare il collagene I deposizione da fibroblasti polmonari umani rispetto a Ficoll12. I dati del nostro studio suggeriscono che Ficoll migliora la deposizione di collagene da fibroblasti ipertrofici derivati da cicatrici, mentre il PVP è tossico per queste cellule13.

È stato dimostrato che la conversione del procollagene al collagene è più veloce in un ambiente in vivo molto affollato14, mentre il tasso di reazioni biologiche è ritardato in un sistema di coltura 2D diluito15. Abbiamo ottimizzato il protocollo in vitro qui, incorporando MMC per mostrare la coltivazione di fibroblasti dermici che servono come un modello più "in vivo" per la fibrosi dermica e la formazione di cicatrici. In contrasto con il sistema di coltura 2D comune, coltivare hHSF con MMC stimola significativamente la biosintesi e la deposizione di collagene13. In particolare, altre caratteristiche della fibrosi (cioè una maggiore espressione delle metalloproteine di matrice [MMP] e delle citochine infiammatorie) sono evidenti anche in questo protocollo MMC ottimizzato13. Quando coltivate con questo metodo, si ha dimostrato che le cellule dermiche ricapitolano i parametri fisiologici, biochimici e funzionali misurati in vivo.

Il protocollo MMC in vitro ottimizzato è stato utilizzato per valutare l'espressione del collagene e di altre proteine ECM da fibroblasti dermici isolati da dermi cicatrici ipertrofi e dermi sconnessi adiacenti non coinvolti. Quando viene coltivato in ambienti MMC in vitro, è stato osservato che hHSF esprimono determinate caratteristiche (ad esempio, mRNA, biochimica, fisiologia e fenotipo) simili al tessuto lecito ipertrofico dermifico in vivo. Le prove indicano che le proprietà fisiche e chimiche sono considerazioni importanti quando si selezionano i crowder e si ottimizzano le condizioni MMC per la coltivazione in vitro.

Per il proof-of-principle, il protocollo MMC viene qui applicato per valutare qualitativamente e quantitativamente la capacità di Shikonin e dei suoi analoghi di indurre l'apoptosi. Ciò consente di valutare le potenziali applicazioni di questi composti di medicina tradizionale cinese (TCM) derivati naturalmente per la gestione delle cicatrici dermiche13. Nonostante ciò, la semplicità, l'efficacia in termini di costi e la tempestività di questo protocollo MMC in vitro soddisfano anche le recenti normative volte ad eliminare la sperimentazione nei mammiferi da parte della direttiva UE 2010/63/EU e dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA).

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Protocollo

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1. Cultura cellulare

  1. Mantenere hHSF e normali fibroblasti dermici derivati da tessuto non patologico (hNSF) nel mezzo modificato dell'Aquila (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS) e l'1% v/v di soluzione di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 gradi centigradi in un incubatore con 5% di CO2/95%.
  2. Acquistare Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico dalle società appropriate.

2. Costruzione del modello MMC di cicatrici ipertrofice

  1. Seme le hHSFs o hNSF (50.000/bene) in una piastra da 24 pozze contenente 1 mL di supporti in ogni pozzo.
  2. Mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi al 5% di CO2 e lasciare la notte.
  3. Preparare i supporti MMC. Sulla base del volume totale richiesto per l'esperimento, produrre 10% supporti FCS/DMEM mescolando Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) e acido ascorbico (100 M).
  4. Collocare il composto in un bagno d'acqua a 37 gradi per 1 h per disperdere i crowder nella soluzione, quindi sterilizzare i supporti MMC utilizzando un filtro da 0,2 m.
  5. Aspirare i supporti spesi e sostituirli con i media MMC appena fatti.
  6. Incubare le cellule per 6 giorni a 37oC e 5% CO2, cambiando i media ogni 3 giorni.

3. Espressione della quantità totale di collagene

  1. Preparare la soluzione rossa Disius (0,1% w/v). Sciogliere 0,2 g di polvere Direct Red 80 in 200 mL di acqua distillata deionizzata (ddH2O) con 1 mL di acido acetico.
  2. Aspirati il supporto MMC e aggiungete la soluzione 300 L di Sirius Red in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 90 min.
  3. Sciacquare delicatamente la soluzione Sirius Red con acqua di rubinetto e lasciare asciugare all'aria durante la notte.
  4. Estrarre la macchia di Sirio Red aggiungendo 200 l' di idrossido di sodio (0,1 M) in ogni pozzo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 5-10 min per estrarre completamente la macchia rosso di Sirio.
  5. Trasferire 100 l della macchia Sirius Red estratta in una piastra 96 ben trasparente e misurare l'assorbimento a 620 nm utilizzando un lettore di microplacche.

4. Espressione di collagene I (immunostaining)

  1. Lavare i pozzi utilizzando 200 gradi di salina con buffer fosfato (PBS, pH - 7,35).
  2. Fissare le cellule utilizzando metanolo (500 l/pozzetto) a 4 gradi centigradi per 10 min.
  3. Blocca le interazioni non specifiche con il 3% di albumina del siero bovino per 30 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Aspirare la soluzione di blocco e incubare con 200 l of anticorpo i anti-collagen (10 g/mL) per 90 min a RT.
  5. Aspirare l'anticorpo primario e lavare 3x con PBS per 5 min ciascuno.
  6. Incubazione con 200-L di anticorpo secondario capra anti-Rabbit-FITC (1:400 diluizione) e 4 ',6-diamidino-2-fenilondole (DAPI; 1: 2000 diluizione) per 30 min a RT. Coprire la piastra con foglio di alluminio.’
  7. Eliminare sia l'anticorpo secondario che IL DAPI e lavare 3x con PBS per 5 min ciascuno.
  8. Visualizza la colorazione a fluorescenza direttamente al microscopio.

5. Gonfiore occidentale

  1. Lavare le cellule 2x con PBS.
  2. Aggiungere 40 l' l di tampone di lisi in ogni pozzo e raschiare lo strato cellulare con una punta di pipetta. Il buffer di lisi contiene buffer RIPA, cocktail inibitore proteasi (PIC), 2 mM di sodio vanadate e 10 mM di fluoruro di sodio.
  3. Trasferire il lisato proteico in tubi di microcentrismo e misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico come base delle istruzioni del produttore16.
  4. Caricare 10 g di proteine di ciascun gruppo nei pozzi del 4%–12% dei gel proteici Bis-Tris. Eseguire l'elettroforesi gel di sodio solfato sodio poliacrilamide (SDS-PAGE) a 200 V per 30 min.
  5. Trasferire la proteina nella membrana di nitrocellulosa eseguendo una macchia occidentale a 90 V per 90 min. Evitare la formazione di bolle d'aria tra la membrana del gel e la nitrocellulosa.
  6. Bloccare la membrana con 10 mL di buffer di blocco.
  7. Incubare con anticorpi primari a 4 oC durante la notte. Gli anticorpi primari sono: anti-collagene I, anti-collagene III, anti-collagen IV, anti-sMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 e dehydrogenassi 3-fosfatide anti-gliceraldedede 3-fosfati (GAPDH).
  8. Lavare la membrana con 0,1% TBS-Tween 20 (5 x per 5 min ciascuno). TBS/Tween 20 (1 L) contiene quanto segue: 50 mL di 1 M Tris (pH - 7,4), 30 mL di 5 M di cloruro di sodio, 1 mL di Tween 20 e 920 mL di ddH2O.
  9. Incubare con una specie appropriata anticorpo secondario a RT per 1 h.
  10. Ripetere il passaggio 5.8 e visualizzare la fluorescenza utilizzando un sistema di imaging.

6. RT-PCR

  1. Raccogliere l'RNA totale utilizzando il buffer di lisi mescolato con 2-mercaptoetanolo incluso nel kit di analisi di estrazione dell'RNA.
  2. Purificare l'RNA come indicato nelle istruzioni del produttore17.
  3. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
  4. Eseguire la sintesi cDNA primo filamento utilizzando un kit di sintesi cDNA come istruzioni del produttore.
  5. I primer oligonucleotidi RT-PCR sono forniti (precoated) in piatti personalizzati 96 well. Mescolare 100 ng di campioni di cDNA con 10 .L di supermix verde SYBR nella piastra personalizzata.
  6. Aumentare il volume totale a 20 /l utilizzando ddH2O.
  7. Eseguire RT-PCR utilizzando un ciclore termico seguendo le istruzioni del produttore: 40 cicli di denatura a 98 gradi per 15 s e annealing/estensione a 60 gradi centigradi per 60 s. I geni testati in RT-PCR includono: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 e VEGF.

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Risultati

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Sono stati eseguiti campioni triplicati in ogni esperimento e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte utilizzando cellule di tre singoli pazienti. I dati sono espressi come percentuali del gruppo di controllo. Il test post-hoc di ANOVA e Tukey è stato applicato unidirezionale per analizzare le differenze statistiche(p .0,05).

MMC utilizzando Ficoll al 9% FVO (occupazione del volume frazionario) migliora la quantità totale di collagene e collagene I deposizione in hHSF

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Discussione

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Questo protocollo mira a ottimizzare e autenticare un modello in vitro migliorato:scar-in-a-jar per il tessuto cicatriziale cutaneo umano. Studi precedenti hanno segnalato l'applicazione della tecnica MMC ai fibroblasti polmonari umani12, cellule staminali mesenchymiche del midollo osseo umano23e fibroblasti dermici umani23 utilizzando dextran12, Ficoll12e PVP23 come crowder. Nel...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca di Singapore "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" e della "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Gli autori riconoscono con gratitudine i consigli e l'assistenza del Dr. Paula Benny e del Dr. Michael Raghunath.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 μ m filtroSartorius16534
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
alfa actina muscolare liscia (&alfa;SMA) anticorpo primarioAbcamab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (termociclatore)Thermo Fisher Scientific4351106
Acido ascorbicoWako#013-12061
Albumina sierica bovinaSigma-Aldrich#A2153
Bradford protein assayBio-Rad500-0006
Anticorpo primario del collagene I (per l'immunocolorazione)Abcam6308
Anticorpo primario del collagene I (per western blot)Abcamab21286
Anticorpo primario del collagene IIIAbcamab7778
Anticorpo primario del collagene IVAbcamab6586
Rosso diretto 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
Siero fetale di vitello (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
GAPDH anticorpo primarioSigma-AldrichG8795
Anticorpo secondario anti-coniglio di capraAbcamab97050
Cicatrice ipertrofica umana/fibroblasti normali (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
Kit di sintesi iScript cDNABio-Rad#1708890
Anticorpo primario MMP-1Abcamab38929
Anticorpo primario MMP-13Abcamab39012
Anticorpo primario MMP-2Abcamab37150
Anticorpo primario MMP-9Abcamab38898
Spettrofotometri per microvolumi NanoDropThermo Fisher ScientificN/A
Membrana nitrocellulosicaBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12% Gel proteici Bis-TrisThermo Fisher ScientificNP0321BOX
Tampone bloccante OdysseyLI-COR Biosciences927– Sistema di imaging Fc 40000
OdysseyLI-COR BiosciencesN/A Microscopio
Olympus IX-81 HCS (per immunocolorazione)OlympusN/A
Soluzione di penicillina/streptomicina (P/S)Life Technologies15140-122
Saggi PrimePCRBio-RadPrimer personalizzati pre-rivestiti in piastre a 96 pozzetti in base alle esigenze
Cocktail di inibitori della proteasi (PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
tampone RIPAMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
Vanadato di sodioSigma-Aldrich450022
sodio vanadatoSigma-Aldrich 450243
SpectraMax M5 Lettore di micropiastre multimodaleMolecular DevicesN/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Riferimenti

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