Articolo metodologico

Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti

DOI:

10.3791/61038

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16 aprile 2020

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1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la robusta generazione di macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e metodi per la loro successiva caratterizzazione. L'espressione del marcatore di superficie cellulare, l'espressione genica e i saggi funzionali vengono utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione di questi macrofagi derivati da iPSC.

Abstract

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I macrofagi sono presenti nella maggior parte dei tessuti vertebrati e comprendono popolazioni cellulari ampiamente disperse ed eterogenee con funzioni diverse. Sono i principali attori nella salute e nella malattia, agendo come fagociti durante la difesa immunitaria e mediando le funzioni trofiche, di manutenzione e di riparazione. Sebbene sia stato possibile studiare alcuni dei processi molecolari coinvolti nella funzione del macrofago umano, è stato difficile applicare tecniche di ingegneria genetica ai macrofagi umani primari. Questo ha ostacolato significativamente la nostra capacità di interrogare i complessi percorsi genetici coinvolti nella biologia dei macrofafi e di generare modelli per stati di malattia specifici. Una fonte pronta all'uso di macrofagi umani che è suscettibile al vasto arsenale di tecniche di manipolazione genetica fornirebbe, quindi, uno strumento prezioso in questo campo. Presentiamo un protocollo ottimizzato che consente la generazione di macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) in vitro. Questi macrofagi derivati da iPSC (iPSC-DM) esprimono marcatori di superficie delle cellule macrofagi umani, tra cui CD45, 25F9, CD163 e CD169, e il nostro saggio funzionale di imaging a cellule vive dimostra che mostrano una solida attività fagocitica. Gli iPSC-DM coltivati possono essere attivati in diversi stati macrofagi che mostrano un'espressione genica alterata e un'attività fagocitica mediante l'aggiunta di LPS e IFNg, IL4 o IL10. Pertanto, questo sistema fornisce una piattaforma per generare macrofagi umani che trasportano alterazioni genetiche che modellano specifiche malattie umane e una fonte di cellule per lo screening farmacologico o la terapia cellulare per il trattamento di queste malattie.

Introduzione

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Le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) rappresentano una fonte cellulare auto-rinnovante che può essere differenziata per produrre cellule di tutti e tre i lignaggi a strato germinale. Tecnologie che consentono la manipolazione genetica delle cellule staminali pluripotenti umane (PSC), come zinco Finger Nuclease, TALENS, e CRISPR-Cas9, hanno rivoluzionato la ricerca medica1,2,3,4. La manipolazione genetica dei PSC umani è una strategia particolarmente interessante quando la cellula primaria di interesse è difficile da espandere e/o mantenere in vitro, o è difficile da manipolare geneticamente, come nel caso dei macrofagi5,6,7,8,9. Poiché gli iPSC umani possono essere derivati da qualsiasi cellula somatica, eludono i limiti etici associati agli ESC e forniscono una strategia per fornire una medicina personalizzata. Questo include la modellazione della malattia specifica del paziente, il test farmacologico e la terapia cellulare autologa con un rischio ridotto di rigetto immunitario e infezione6,8,10,11.

I protocolli che descrivono la generazione di macrofagi da iPSC consistono in un processo in tre fasi che comprende: 1) Generazione di corpi embrionali; 2) Apparizione di cellule ematopoietiche in sospensione; 3) Maturazione del macrofago terminale.

La formazione di aggregati tridimensionali, noti come corpi embrionali (EB), avvia la differenziazione degli iPSC. La proteina morfogenetica ossea (BMP4), il fattore di cellule staminali (SCF) e il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) vengono aggiunti per guidare la specifica del mesodermia e supportare le cellule ematopoietiche emergenti7,8,99,11,12. Le cellule di differenziazione all'interno degli EB avviano anche l'attivazione di vie di segnalazione endogene come Wnt e Activin. Alcuni protocolli di differenziazione non passano attraverso la fase di formazione eB. In questi casi, le autorità di regolamentazione di segnalazione Wnt e Activin, come Activin A umana ricombinante e/o Chiron, vengono aggiunte agli iPSC differenzianti in un formato monostrato13,14,15. Qui, ci concentriamo su un protocollo che utilizza la formazione EB. Per la seconda fase di differenziazione, gli EB sono placcati su una superficie aderente. Queste cellule attaccate sono poi esposte a citochine che promuovono l'emergere di cellule di sospensione che includono progenitori ematopoietici e mieloidi. In queste condizioni di coltura in vitro, l'interleucina-3 (IL3) supporta probabilmente la formazione ematopoietica delle cellule staminali-progenitorie e la proliferazione16,17, così come i precursori mieloidi proliferazione e differenziazione18. Il fattore stimolante della colonia di macrofagi (CSF1) supporta la produzione di cellule mieloidi e la loro differenziazione ai macrofagi19,20. Durante la terza fase di differenziazione, queste cellule sospensioni vengono coltivate in presenza di CSF1 per supportare la maturazione terminale del macrofago.

La differenziazione degli iPSC umani in macrofagi in vitro imita l'ondata iniziale della produzione di macrofagi durante lo sviluppo. I macrofagi residenti nei tessuti sono stabiliti durante l'embriogenesi e hanno un derivato dello sviluppo distinto dai monociti adulti. Diversi studi hanno dimostrato che gli iPSC-DM hanno una firma genica che è più paragonabile ai macrofagi derivati dal fegato fetale rispetto ai monociti derivati dal sangue, suggerendo che gli iPSC-DM sono più simili ai macrofagi residenti nei tessuti. iPSC-DM esprimono livelli più elevati di geni che codificano per la secrezione di proteine coinvolte nel rimodellamento dei tessuti e nell'angiogenesi ed esprimono livelli più bassi di codifica dei geni per la secrezione citochina pro-infiammatoria e le attività di presentazione antigen21,22. Inoltre, gli iPSC-DM hanno un requisito analogo del fattore di trascrizione a quello dei macrofagi residenti in tessuto23,24. L'uso di linee cellulari iPSC a eliminazione diretta che sono carenti nei fattori di trascrizione RUNX1, SPI1 (PU.1) e MYB, Buchrieser et al. ha dimostrato che la generazione di iPSC-DM è dipendente da SPI1 e RUNX1, ma MYB è indipendente. Ciò indica che sono transcrileopzionalmente simili ai macrofagi derivati del tuorlo-sac che vengono generati durante la prima ondata di ematopoiesi durante lo sviluppo23. Pertanto, è ampiamente accettato che iPSC-DM rappresentino un modello cellulare più appropriato per studiare macrofagi residenti in tessuto come le cellule microglia14,25 e Kupffer11e una fonte più desiderabile di cellule che potrebbero essere potenzialmente utilizzate nelle terapie per riparare i tessuti. Ad esempio, è stato dimostrato che i macrofagi prodotti in vitro dagli ESC murini erano efficaci nell'migliorare la fibrosi in un modello di lesione epatica indotta da CCl4 in vivo11. Inoltre, questi macrofagi derivati dall'ESC erano più efficienti dei macrofagi derivati dal midollo osseo ai compartimenti cellulari di Kupffer impoveriti di macrofagi utilizzando clodinato liosomico11 nei topi.

Qui, descriviamo protocolli privi di siero e alimentatori per la manutenzione, il congelamento e lo scongelamento degli iPSC umani, e per la differenziazione di questi iPSC in macrofagi funzionali. Questo protocollo è molto simile a quello descritto da Van Wilgenburg et al.12, con piccole modifiche tra cui: 1) supporti di manutenzione iPSC; 2) L'inibitore ROCK non viene utilizzato nella fase di formazione eB; 3) Un approccio meccanico piuttosto che un approccio enzimatico viene utilizzato per generare EB uniformi dalle colonie iPSC; 4) Il metodo per la raccolta e la placcatura esordieria è diverso; 5) Le cellule di sospensione vengono raccolte 2 volte a settimana, piuttosto che settimanalmente; e 6) Le cellule di sospensione raccolte vengono coltivate sotto CSF1 per la maturazione dei macrofazini per 9 giorni anziché 7 giorni. Descriviamo anche i protocolli utilizzati per caratterizzare il fenotipo e la funzione del macrofago derivato da iPSC, incluse le analisi per l'espressione genica (qRT-PCR), l'espressione del marcatore della superficie cellulare (citometria di flusso) e i saggi funzionali per valutare la fagocitosi e la polarizzazione.

Protocollo

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NOT: Tutti i reagenti e le attrezzature utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali. I media devono essere a 37 gradi centigradi per la coltura cellulare. I supporti e i reagenti utilizzati nel protocollo di differenziazione devono essere sterili.

1. Scongelamento e manutenzione della linea iPSC umana

  1. Preparare il supporto di manutenzione cellulare, i fattori di crescita e altri reagenti.
    1. Preparare il supporto libero hESC-siero (hESC-SFM; vedi Table of Materials) integrando l'Eagle medium-F12 modificato di Dulbecco consupplemento hESC, 1,8% w/v bovine serum albumin (BSA) e 0,1 mM 2-mercaptoethanolo.
    2. Preparare la soluzione azionaria del fattore di crescita del fibroblasto di base umano (bFGF) (10 g/mL) sciogliendo bFGF in una soluzione sterile di accumulo di siero umano (HSA)-fosfato buffered saline (PBS). Distribuire la soluzione di stock come 200 ll aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 1 anno. Una volta sconsolato, lo stock bFGF può essere conservato a 4 gradi centigradi per 7 giorni.
    3. Preparare l'inibitore della chinasi di Rho (INibitore della fionda)-Y27632 soluzione stock (1 mg/mL) sciogliendolo in acqua sterile. Distribuire la soluzione di stock come 50 -L aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 1 anno. Una volta scongelato, il magazzino ROCK Inhibitor può essere conservato a 4 gradi centigradi per 7 giorni.
  2. Substrato di cellule staminali diluite (vedi Tabella dei materiali)1:50 nella Salina buffered fosfato di Dulbecco con calcio e magnesio.
  3. Posizionare la soluzione di substrato diluito delle cellule staminali su piastre di coltura in modo che il volume finale per superficie sia 78 l/cm2. Per rivestire il pozzo di una piastra a 6 pozze, aggiungere 750 l di soluzione.
  4. Incubare la piastra rivestita per 1 h in un'atmosfera umoristica a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
  5. Aspirare il rivestimento del substrato a cellule staminali e aggiungere 1 mL di hESC integrato con 20 ng/mL bFGF e 10 - M - Inibitore ROCK.
  6. Per scongelare una fiala di cellule iPSC umane congelate, incubare la fiala a 37 gradi centigradi fino a scongelare e trasferire le cellule in supporti hESC-SFM da 5 mL.
  7. Centrifuga refusione di 100 x g per 3 min.
  8. Risospendere in 0,5 mL hESC-SFM integrato con 20 ng/mL bFGF e 10 - M ROCK Inhibitor. Trasferire le cellule al pozzo rivestito.
  9. Celle di coltura per 24 ore.
  10. Cambia il supporto in hESC-SFM integrato con 20 ng/mL bFGF, ma senza inibitore ROCK.
  11. Per mantenere le cellule, cambiare il mezzo ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono 80% confluenza. Gli iPSC indifferenziati di solito richiedono 3-4 giorni per raggiungere l'80% di confluenza.
  12. Una volta che le cellule hanno raggiunto 80% confluenza, passare le cellule.
    1. Sostituire il mezzo di coltura esaurito con 1,5 mL di hESC-SFM fresco integrato con 20 ng/mL bFGF (senza inibitore ROCK).
    2. Tenere un recipiente di coltura in una mano e rotolare uno strumento di passaggio di cellule usa e getta (vedere Tabella dei materiali) attraverso la piastra in una direzione (cioè da sinistra a destra). Tutte le lame del rullo devono toccare la piastra. Mantenere una pressione uniforme durante la rotazione.
    3. Ripetere il rotolamento nella stessa direzione fino a quando l'intero pozzo è stato coperto.
    4. Ruotare il recipiente di coltura di 90 gradi e ripetere la rotazione come descritto nei passaggi 1.12.2 e 1.12.3.
    5. Eliminare lo strumento di passaging dopo l'uso.
    6. Con una pipetta sterile, utilizzare i supporti nel pozzo per spostare le colonie tagliate.
    7. Trasferire le cellule a un rapporto 1:4 su pozzi di substrato di cellule staminali pre-rivestite (passi 1.2–1.5) a un volume di supporto finale (hESC -SFM integrato con 20 ng/mL bFGF) di 1,5 mL per pozzo.

2. Congelamento della linea iPSC umana

  1. Per congelare le cellule iPSC, sostituire i supporti di un pozzo confluente 70%–80% di una piastra 6 pozzo con hESC-SFM integrato con 20 ng/mL bFGF e 10 - M ROCK Inhibitor.
  2. Incubare bene a 37 e 5% CO2 per 1 h.
  3. Tagliare le colonie con l'attrezzo di passaggio cellulare e posizionare le colonie slomonate in un tubo di centrifuga.
  4. Centrifuga refusione di 100 x g per 3 min.
  5. Aspirati i supporti e sospendono nuovamente le cellule in 1 mL di supporti di crioconservazione cellulare (vedere Tabella dei materiali).
  6. Dividere le cellule equamente in due crioviali e metterle in un contenitore di crioconservazione cellulare pre-raffreddato a 4 gradi centigradi.
  7. Conservare le celle a -80 gradi centigradi per 24-48 h.
  8. Trasferire le fiale in un congelatore -135 o in un serbatoio di azoto liquido.

3. Differenziazione iPSC umana ai macrofagi

NOT: Un riepilogo schematico del protocollo di differenziazione dei macrofali è illustrato nella Figura 1.

  1. Preparazione dei fattori di crescita della differenziazione cellulare e di altri reagenti
    1. Preparare il supporto hESC-SFM (vedere la sezione precedente).
    2. Preparare lo 0,1% w/v soluzione di gelatina di porcine sciogliendo la gelatina in acqua sterile. La soluzione di gelatina può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 anni.
    3. Preparare la soluzione di stock umano BMP4 (25 g/mL) sciogliendo BMP4 in una soluzione BSCl (4 mM di cloruro di idrogeno)-0,2%. Distribuire la soluzione di stock come 50 -L aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 1 anno. Una volta sconsolato, lo stock BMP4 può essere conservato a 4 gradi centigradi per 5 giorni.
    4. Preparare la soluzione di stock UOMO VEGF (100 g/mL) sciogliendo il VEGF in una soluzione PBS BSA dello 0,2%. Distribuire la soluzione di stock come 10 l-l aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 1 anno. Una volta sconsolato, il VEGF può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per 7 giorni.
    5. Preparare la soluzione di stock SCF umana (100 g/mL) dissolvendo SCF in una soluzione PBS BSA dello 0,2%. Distribuire la soluzione di stock come 5 aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 1 anno. Una volta scongelato, lo stock SCF può essere conservato a 4 gradi centigradi per 10 giorni.
    6. Preparare la soluzione di stock HUMAN IL3 (10 g/mL) dissolvendo IL3 in una soluzione BSA PBS dello 0,2%. Distribuire la soluzione di stock come 500 ll aliquote in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 2 anni. Una volta scongelato, lo stock SCF può essere conservato a 4 gradi centigradi per 15 giorni.
    7. Preparare la soluzione di stock CSF1 umana (10 g/mL) dissolvendo CSF1 in una soluzione PBS BSA dello 0,2%. Distribuire la soluzione stock come 1 mL in criotubi. Le soluzioni di stock possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi fino a 2 anni. Una volta scongelato, lo stock SCF può essere conservato a 4 gradi centigradi per 15 giorni.
    8. Preparare soluzioni separate separate per 10 g/mL di interferone-gamma (IFNg), interleuchino 4 (IL4) e interleuchino 10 (IL10) dissolvendosi in soluzioni BSS dello 0,2%. Preparare il lipopolioaccharide (LPS) in una soluzione stock di (100 U/mL) dissolvendosi in una soluzione BSA PBS dello 0,2%. Distribuire ogni soluzione di stock come 35 aliquote. Conservare a -80 gradi centigradi fino a 2 anni. Una volta scongelato, le scorte possono essere immagazzinate a 4 gradi centigradi per 7 giorni.
  2. Fase 1: Generazione di corpi embrionali (giorno 0–giorno 3)
    1. Il giorno 0, aggiungere 2,25 mL di stage 1 media (hESC-SFM integrato con 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF e 20 ng/mL SCF) in due pozze di un attacco ultrabasso 6 piastra.
    2. Sostituire i supporti di manutenzione di un pozzo confluente dell'80% di iPSC in una piastra 6 con 1,5 mL di supporti Stage 1.
    3. Tagliare le colonie utilizzando lo strumento di passaggio cellulare e trasferire colonie tagliate con una pipetta nei due pozzi di un attacco ultrabasso 6 ben piastra (vedi Tabella dei materiali).
    4. Il giorno 2, portare le citochine a una concentrazione finale di 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF e 20 ng/mL SCF utilizzando 0,5 mL di supporti hESC-SFM.
      NOT: Le colonie IPSC diventeranno EBs(Figura 2A).
  3. Fase 2: Apparizione di cellule ematopoietiche in sospensione
    1. Il giorno 4, rivestire 4 pozze di una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozzelsi con 0,1% di gelatina w/v e incubare per almeno 10 min.
    2. Rimuovere la gelatina e aggiungere 2,5 mL di supporti Stage 2 (X-VIVO15 integrati con 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicillina-streptomycin e 0,055 mM 2-mercaptoetanolo).
    3. Raccogliere gli EB formati in un tubo di centrifuga di 50 mL e permettere loro di stabilirsi nella parte inferiore del tubo per gravità. Aspirare attentamente i media.
    4. Risospendere le EB in 2 mL dei supporti della fase 2.
    5. Trasferire 10-15 EB (non più di 15) in un pozzo rivestito di gelatina contenente 2,5 mL di supporti Stage 2.
    6. Incubare gli EB a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 aria.
    7. Cambia i media sugli EB placcati ogni 3-4 giorni per 2-3 settimane.
    8. Dopo 2-3 settimane, gli EB iniziano a rilasciare cellule ematopoietiche non aderenti in sospensione.
      NOT: Questo periodo di rilascio delle celle di sospensione può variare ed è dipendente dalla linea cellulare. Le cellule in questa sospensione possono essere raccolte e maturate in macrofagi (vedere Fase 3) (Figura 2A).
  4. Fase 3: maturazione del macrofago terminale
    1. Raccogli le celle ematopoietiche delle sospensioni e rifornisci i supporti (supporti di fase 2) sulla piastra EB.
    2. Centrifuga resiede resione a 200 x g per 3 min.
    3. Risospendere le celle di sospensione nei supporti Stage 3 (X-VIVO15 integrate con 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax e 1% penicillina-streptomica).
    4. Piastra raccolta e filata cellule su plastica non trattata 10 cm di qualità batteriologica (10 mL) o piastre di coltura dei tessuti di pozzo non rivestite (3 mL) ad una densità di 0,2 x 106 cellule/mL.
    5. Mantieni le celle nel supporto della fase 3 per 9-11 giorni, cambiando i supporti ogni 5 giorni.
      NOT: I passaggi da 3.4.1 – 3.4.5 della Fase 3 possono essere ripetuti ogni 3-4 giorni e le cellule di sospensione raccolte dalla piastra EB originale per un massimo di 3 mesi.
  5. Polarizzazione dei macrofaci
    1. Per attivare i macrofagi a un fenotipo M(LPS - IFNg), stimolare le cellule con LPS (concentrazione finale: 100 ng/mL) e IFNg (concentrazione finale: 10 U/mL) per 48 h. Per attivare le cellule a un fenotipo M(IL4), stimolare le cellule con IL4 (concentrazione finale: 20 ng/mL). Per attivare un fenotipo M(IL10), stimolare i macrofagi con IL10 (concentrazione finale: 5 ng/mL).

4. Controllo qualità Macrofaages derivato da iPSC

  1. Determinare il numero di cellule di sospensione ematopoietiche prodotte per 6 piastra di pozzo di EB contandoli con un ematocitometro.
  2. Valutare la morfologia dei macrofagi come descritto in precedenza (ad es. colorazione del kit commerciale)8,9.
  3. Rilevare l'espressione di marcatori specifici di macrofaci e marcatori di polarizzazione utilizzando analisi dell'espressione genica e citometria di flusso come descritto in precedenza8,9.
    1. Per gli esperimenti di citometria di flusso su un pozzo di un 6 pozzo di macrofagi, raccogliere le cellule aspirando i loro mezzi di maturazione, lavare con 2 mL di PBS e incubarle con 2 mL di buffer di dissociazione cellulare senza enzima per 5 min a temperatura ambiente (RT). Pipetta su e giù ripetutamente per staccare e raccogliere macrofagi.
    2. Contare le cellule con un ematocitometro e sospenderle nuovamente in 80 gradi di una soluzione di acido etilenediaminetraacetico (EDTA) da 0,5 mm.
    3. Aggiungete 20 - MacS umano FC bloccante.
    4. Incubare sul ghiaccio per 20 min e proteggere dalla luce.
    5. Aggiungere un volume appropriato di 2% SOLUZIONE BSTA, 0,5 mM EDTA PBS per portare la concentrazione cellulare a 1 x 106 macrofagi/mL.
    6. Macchia 1 x 105 cellule in 100 -L del 2% BSA, 0,5 mM della soluzione EDTA PBS con anticorpo corrispondente (vedi NOTA sotto) e incuba per 15 min a RT protetto dalla luce.
    7. Lavare 1x con almeno 100 -L del 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    8. Risospendere le celle in 200 : L del 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    9. Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, diluito 1:1,000) come un colorante vivo. Incubare 3 min.
    10. Per le analisi della citometria a flusso, si passa alla popolazione principale, quindi alle singole cellule e infine alle cellule vive. Nella popolazione di cellule vive, l'espressione del marcatore correlato al macrofago è evidente (Figura 3A).
      NOT: Gli anticorpi devono essere attentamente titolati per ogni linea cellulare utilizzata per derivare i macrofagi. Gli anticorpi presentati nella sezione dei risultati sono nella Tabella dei Materiali. È incluso anche il fattore di diluizione per i saggi di ciclica derivanti da SFCi555.

5. Alta throughput Phagocytosis Assay

  1. Raccogliere macrofagi derivati da iPSC (iPSC-DM) aspirando i media, aggiungendo buffer di dissociazione cellulare libera enzima ghiacciato e incubando per 5 min.
  2. Piastra 8 x 104 iPSC-DM in un pozzo di una coltura di tessuto di imaging grado 96 lastre di pozzo (ad esempio, Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) almeno 2 giorni prima dell'imaging ad alta produttività in 200 - L di Stage 3 media.
  3. Preparare le bioparticelle pHrodoGreen zemosan-A ricommettendo una fiala in 2 mL di PBS ("Soluzione 1"). Soluzione Vortex per 10 s.
  4. Diluire i 2 mL di sospensione del tallone PBS 1:5 con più PBS ("Soluzione 2").
  5. Soluzione Sonicate 2 per 8 s e vortice per 10 s. Tenerlo a 4 gradi centigradi. Questa soluzione verrà utilizzata nel passaggio 5.11.
  6. Rimuovere il supporto su iPSC-DM placcati e lavare con PBS.
  7. Macchia iPSC-DM con una soluzione PBS contenente Hoechst 33342 diluito 1:20. Incubare per 20 min a 37 .
  8. Lavare le cellule con PBS.
  9. Macchia con una soluzione PBS contenente macchie di membrana plasmatica rossa profonda diluita 1:1,000 (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 min a 37 .
  10. Lavare le cellule con PBS.
  11. Aggiungete 100 l di perline tenute a 4 gradi centigradi in ogni pozzetto di iPSC-DMs. Le piastre sono ora pronte per l'imaging.
  12. Immagine della piastra utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e acquisire tre o più campi in tutto il pozzo per ottenere una buona rappresentazione del pozzo.
  13. Quantificare la fagocitosi utilizzando il software Columbus (software di analisi High-Content Imaging). È possibile sviluppare un algoritmo specifico per un'analisi batch di immagini non ambigua:A specific algorithm can be developed for unambiguous image batch analysis:
    1. Misurare l'intensità blu e definire nel software che il segnale blu indica i nuclei.
    2. Misurare l'intensità rossa e definire nel software che il segnale rosso indica il citoplasma.
    3. Definire che nucleo e citoplasma insieme corrisponde a una cella.
    4. Misurare l'intensità verde nelle celle e stabilire un valore di soglia/taglio rigoroso per considerare una cella come fagocitica.
    5. Quantificare la frazione di cellula fagocitica e l'indice fagocitico medio per cellula. Poiché l'intensità del colore del tallone è proporzionale al numero di perline, l'attività fagocitica può essere misurata dal numero di perline ingerite.
    6. Applica l'algoritmo/pipeline a tutte le immagini all'interno di ogni campo e in tutti i punti temporali acquisiti, consentendo un approccio batch robusto e imparziale per determinare le capacità fagocitiche delle cellule.
      NOT: Columbus è un software di analisi dei contenuti ad alto contenuto, che offre analisi di segmentazione cellulare per la fenotipizzazione cellulare e test funzionali.

Risultati

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Progressione della differenziazione, numero di macrofago e morfologia
I risultati presentati derivano dalla differenziazione della linea IPSC umana SFCi55 che è stata descritta e utilizzata in una serie di studi8,9,10,26. Il processo di differenziazione IPSC verso i macrofagi potrebbe essere monitorato mediante microscopia ottica. Le colonie iPSC, i corpi embrionali (EB), le cellule di sospensione ematopoietiche e i macrofagi maturi erano morfologicamente distinti (Figura 2A). La morfologia matura dei macrofagi potrebbe essere ulteriormente convalidata dalla colorazione dei preparati citospin centrifugati. I macrofagi derivati dall'IPSC erano grandi, e avevano singoli piccoli nuclei a forma ovale e abbondanti citoplasma contenenti molte vescicoli (Figura 2B).

Le prime 2 settimane di raccolta di celle a sospensione ematopoietica (giorni 16-28) di un pozzo pieno 6 di EB contenevano, in media, 2,59 x 106 x 0,54 celle. Dopo il giorno 28, è stata prodotta una media di 4,64 x 106 x 0,94 delle celle di sospensione per 6 pozzetti di EB. Dal giorno 80 in poi, il numero di celle di sospensione ha iniziato a diminuire con l'esaurimento degli EB (Figura 2C). Si raccomanda di fermare il protocollo di differenziazione dopo che i numeri scendono al di sotto di 3 x 106 precursori per raccolto per 6 pozzetti di EB.

Espressione dei marcatori di superficie delle cellule macrofano derivata da IPSC
La citometria di flusso rimane il metodo più comune utilizzato per valutare il fenotipo dei macrofagi umani. La strategia di gating per valutare l'espressione del marcatore di superficie cellulare consiste nel gating la popolazione principale di celle utilizzando parametri fisici come dimensioni e granularità, seguita da gating singole celle e quindi celle vive (Figura 3A). I macrofagi maturi derivati da iPSC devono esprimere il marcatore di maturazione CD45 e il marcatore di maturazione del macrofalo 25F9 ed essere negativi per il marcatore di macrofago monocito/immaturo CD93. Questo è coerente con le nostre osservazioni (Figura 3A). I macrofagi derivati da IPSC sono stati positivi anche per i marcatori mieloidi di lignaggio CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 e CD169 (Figura 3B). Sono stati positivi per il marcatore di modulazione immunitaria CD86, e una piccola percentuale di loro ha espresso recettori chemiochine CX3CR1, CCR2, CCR5 e CCR8 allo stato ingenuo (Figura 3B). Le trame sono state ottenute da dati precedentemente pubblicati dal nostro laboratorio8.

Fagocitosi e polarizzazione dei macrofagi derivati da iPSC
Una delle caratteristiche chiave dei macrofagi nella difesa dell'ospite e l'omeostasi dei tessuti è la loro capacità di fagocitosi patogeni, cellule apoptotiche e detriti27. Il tasso di fagocitosi è strettamente associato a specifici stati fenotipici28. Per valutare la capacità fagocistica iPSC-DM, abbiamo utilizzato un sistema di imaging ad alto contenuto avvicinarsi8,9,11 che fa uso del microambito PerkinElmer Operetta e pHrodo zemosan (coniugato color tintura sensibile al pH). Le bioparticelle non erano fluorescenti quando venivano aggiunte alle colture (Figura 4A), ma fluorescente di verde brillante nel pH acido intracellulare (Figura 4B). Il microscopio Operetta di imaging dal vivo è stato impostato per l'immagine ogni 5 min dopo l'aggiunta di perline per un tempo totale di 175 min. Un'elevata produttività e una pipeline di analisi delle immagini imparziale è stata quindi utilizzata nella piattaforma Columbus per quantificare l'attività in termini di frazione fagocitica che rappresenta la proporzione di cellule che fagocitosi perline e l'indice fagocitico che è una misura del numero di perline che ogni cellula ingerito.

I macrofagi possono rispondere e cambiare il loro fenotipo a seconda dei segnali ambientali. Per valutare la loro capacità di reagire e cambiare in base agli stimoli ambientali, gli iPSC-DM possono essere trattati con LPS e IFNg, IL4 o IL10. Dopo 48 h di trattamento, hanno cambiato fenotipo, qui indicato come M (LPS - IFNg), M (IL4) e M (IL10), rispettivamente29. L'analisi dell'espressione genica è uno strumento utile per testare lo stato di polarizzazione dei macrofagi. Su stimolazione LPS e IFNg, i macrofagi hanno aumentato l'espressione mRNA dei geni CD40, VCAM1e TNFA (Figura 5A). Dopo la stimolazione il4, le cellule hanno regolato l'espressione mRNA dei geni CD68, CD84e MRC1 (Figura 5B). Dopo la stimolazione IL10, iPSC-DMs ha aumentato l'espressione di MRC1 (Figura 5B). In termini di fagocitosi, i macrofagi trattati con LPS - IFNg o IL4 hanno mostrato una percentuale significativamente inferiore di cellule fagocitiche rispetto ai macrofagi ingenui. Gli iPSC-DM trattati con IL10 hanno mostrato un aumento della percentuale di cellule fagocitiche e indice fagocitico (Figura 5C–E).

differenziamento delle iPSC in macrofagi; diagramma di flusso; Protocolli BMP4, VEGF, SCF, IL3, CSF1.
Figura 1: Riepilogo grafico della differenziazione di iPSC a macrofagi funzionali maturi. Diagramma disegnato con Biorender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Processo di differenziamento cellulare: immagini al microscopio, colture cellulari; Il grafico di crescita mostra i numeri dei precursori.
Figura 2: differenziazione iPSC verso macrofagi e numero e morfologia iPSC-DM. (A) Immagini di campo luminoso ottenute da (da sinistra a destra): una colonia IPSC, corpi embrionali (EB), cellule sospensioni raccolte e macrofagi maturi. Barra della scala: 100 m. (B) Immagine di citospin macrofaschi macchiati con kit Kwik-diff. Barra della scala: 25 m. (C) Numero di celle di sospensione raccolte per raccolto per una piastra 6 di EB. La trama mostra la media di SEM; (n - 6 esperimenti biologicamente indipendenti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di citometria a flusso con processo di smistamento cellulare e istogrammi marcatori di lineage per l'analisi immunitaria.
Figura 3: Fenotipo del marcatore di superficie della cellula macrofago. (A) Strategia di Gating per l'analisi dei macrofagi maturi derivati da iPSC. Le cellule singole e vive sono state gated, quindi analizzate per l'espressione dei marcatori di superficie cellulare CD45, CD93 e 25F9. I cancelli per i marcatori di superficie delle celle sono stati disegnati utilizzando i controlli di fluorescenza meno uno (FMO). (B) Istometrie di flusso rappresentative per le singole macchie di iPSC-DM (blu) e controlli isotipici (grigio) per marcatori di lignaggio e mieloide, marcatori di modulazione immunitaria, marcatori di maturazione e recettori chemiochine. I grafici sono rappresentativi di n 5 esperimenti biologicamente indipendenti per tutti i marcatori di lignaggio e mieloide, ad eccezione di CD105 e CD206 (n - 3); marcatori di maturazione (n x 5); marcatori di modulazione immunitaria (n x 3); recettori della chemiochina (n . I grafici utilizzano dati pubblicati in precedenza8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Processo di fagocitosi con immagini microscopiche, frazione fagocitaria e grafici indice nel tempo.
Figura 4: analisi della polarizzazione e della fagocitosi IPSC-DM. Immagini rappresentative di iPSC-DM (A) subito dopo l'aggiunta di perline verdi pHrodo e (B) 175 min dopo l'aggiunta di perline. Il blu rappresenta i nuclei delle cellule; il rosso rappresenta il citoplasma delle cellule. Il verde rappresenta perline ingerite (barra di scala di 20 m). (C) Frazione dei macrofagi fagocitici e (D) indice fagocitico/intensità verde per macrofago fagocitico nel tempo nello stato ingenuo (n . 6 esperimenti biologicamente indipendenti). I grafici mostrano il valore medio e le barre8rappresentano i grafici SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi dell'espressione genica nei macrofagi; grafici a barre, microscopia confocale, grafici di attività fagocitaria.
Figura 5: Valutazione degli stati di polarizzazione iPSC-DM. Quantificazione relativa delle analisi RT-PCR di iPSC-DM ingenue e polarizzate per valutare l'espressione di (A) M(LPS-IFN) ; (( B)M(IL4) e M (IL10) -associati geni (n : 6 esperimenti biologicamente indipendenti; Post-test di unidirezionale ANOVA e Holm-Sidak. I gruppi polarizzati sono stati statisticamente confrontati solo con il gruppo ingenuo. I grafici mostrano il valore medio e le barre di errore rappresentano la deviazione standard. ND nei grafici: trascrizione non rilevata. I dati relativi a questi appezzamenti sono stati precedentemente pubblicati8. (C) Immagini rappresentative di iPSC-DMs 175 min dopo l'aggiunta di perline di pHrodo da iPSC-DM trattate con (da sinistra a destra): senza citochine, LPS-IFN-Y, IL-4 e IL-10 (barra di scala - 20 m). (D) Frazione dei macrofagi fagocitici e (E) indice fagocitico/intensità verde per macrofago fagocitico nei trattamenti di macrofagi ingenui e polarizzati 175 min dopo l'aggiunta di perline (n - 12 esperimenti biologicamente indipendenti, macrofagi multipli di ANOVA e Holm-Sidak post-test di Holm-Sidak. I gruppi polarizzati sono stati statisticamente confrontati solo con il gruppo ingenuo. I grafici mostrano il valore medio e le barre di errore rappresentano la deviazione standard (Lt; 0,05, < 0,01, < 0,01, < 0,001, < 0,001, < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il protocollo per la generazione di iPSC-DM qui descritto è robusto e consente la produzione di un gran numero di cellule omogenee da un numero relativamente ridotto di iPSC. Dopo la differenziazione iniziale di circa 1 x 106 iPSC, le colture successive possono essere raccolte ogni 4 giorni per un massimo di 2-3 mesi, con conseguente produzione di almeno 6,5 x 107 macrofagi in quel periodo. Questi macrofagi umani generati in vitro sono morfologicamente simili ai macrofagi umani primari, esprimono i principali marcatori di superficie delle cellule dei macrofagi e mostrano attività fagocitiche. Il protocollo per la differenziazione dei macrofazini è riproducibile e può essere applicato ad altre linee cellulari hiPSC e hESC, ma la tempistica precisa del primo raccolto dei precursori dei macrofagini e il numero assoluto di cellule che possono essere generate varia tra le linee iPSC.

È stato dimostrato che i macrofagi possono essere generati da iPSC che sono stati geneticamente manipolati. Ad esempio, una cassetta transgene composta dal reporter fluorescente sGreen sotto il controllo del promotore CAG di stitutive è stata inserita nel locus AAVS1 della linea iPSC SFCi55, ed è stato successivamente dimostrato che questa linea iPSC potrebbe essere differenziata in macrofagi che esprimono il verde8. Questi macrofagi fluorescenti potrebbero essere utilizzati in futuro per monitorare la migrazione e la stabilità dei macrofagi terapeutici nei modelli di malattia. In un altro studio, i macrofagi sono stati generati da una linea iPSC che era stata geneticamente manipolata per esprimere un fattore di trascrizione indotta da tamoxifene, KLF1. L'attivazione di KLF1 nei macrofagi derivati da iPSC ha portato alla produzione di macrofagi con un fenotipo paragonabile ai macrofagi dell'isola eritroide9. Potenzialmente, questa strategia potrebbe essere utilizzata per programmare geneticamente i macrofagi derivati da iPSC in fenotipi associati ad altre popolazioni di macrofagi specifici del tessuto come le cellule di Kupffer del fegato o le cellule di Langerhans della pelle. Ciò sarebbe possibile una volta identificati i fattori chiave di trascrizione che definiscono questi tipi di cellule.

In termini di protocollo, è molto importante notare che la condizione della popolazione iniziale di iPSC è fondamentale per il successo della differenziazione. Le colture iPSC umane possono essere invase da sottopopolazioni cariotipicamente anormali su diversi passaggi, quindi si raccomanda una robusta cura delle scorte di iPSC e di grandi stock master in lotti sottoposti al controllo della qualità del genoma. Nelle nostre mani, i protocolli di manutenzione qui descritti possono mantenere gli iPSC cariotipici che sono normali per un massimo di 2 mesi in continua coltura, ma questo può variare per diverse linee cellulari e in diversi laboratori. Se si verificano problemi, si consiglia di utilizzare una fiala fresca di ipPOC indifferenziati per ogni esperimento di differenziazione. Inoltre, la cultura iniziale degli iPSC indifferenziati non dovrebbe essere superiore all'80% confluente. Nella fase di placcatura EB, solo 10-15 EB dovrebbero essere placcati per pozzo di una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozzetti, ed è fondamentale che questi EB siano distribuiti uniformemente attraverso il pozzo. Un numero maggiore di EB e/o l'agglomerazione di EB al centro del pozzo ha avuto un effetto negativo sul numero di macrofagi generati. Occorre prestare attenzione quando si ricostituiscono i mezzi di comunicazione e si raccolgono cellule di sospensione progenitrici simili a monociti provenienti dalle colture EB per evitare di disturbare l'adesione degli EB alla superficie delle piastre di coltura rivestite. Il numero di celle di sospensione ematopoietiche prodotte aumenta gradualmente ad ogni raccolto, con una produzione ottimale tra i giorni 40-72 di differenziazione (Figura 2). La produzione diminuisce progressivamente dopo il giorno 68 e le piastre tendono a esaurirsi dopo 2,5 mesi, anche se la tempistica precisa può variare a seconda della linea iPSC.

Una limitazione del nostro protocollo è che non è stato possibile crioconservare le cellule di sospensione ematopoietiche generate alla fine della fase 2. I protocolli che si basano sull'attivazione esogena di WNT riportano circa un tasso di recupero del 40% dopo la crioconservazione, ma questi protocolli riportano solo un raccolto di celle, quindi il numero assoluto di macrofagi generati è basso30. Il protocollo qui descritto, che induce la segnalazione endogena attraverso la formazione di EB, può essere raccolto bisettimanale, producendo una resa totale di macrofafia molto più alta.

In sintesi, presentiamo un protocollo dettagliato per la produzione di macrofagi funzionali derivati da iPSC. La creazione di esperimenti in vitro con macrofagi derivati da iPSC per studiare la biologia dei macrofagi in salute e malattia ha molti vantaggi rispetto agli esperimenti con macrofagi derivati da monociti (MDM). Questi vantaggi includono la facilità di accessibilità al materiale (ad esempio, non sono necessari donatori), si possono produrre grandi quantità di macrofagi ed è fattibile e relativamente semplice produrre macrofagi geneticamente modificati. Inoltre, i macrofagi derivati da iPSC potrebbero essere una risorsa migliore per lo studio della biologia dei macrofagi residente ai tessuti.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Fiona Rossi e Claire Cryer per l'assistenza con la citometria di flusso, Eoghan O'Duibhir e Bertrand Vernay con microscopia. Questo lavoro è stato finanziato da CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) e Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M),MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. e J.W.P. sono stati supportati da Wellcome Trust (101067 / s/13 / ) , Medical Research Council (MR/N022556/1), e COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Mercaptoetanolo (50 mM)Invitrogen31350010
Abtibody CD64-APC -CY7Biolegend305026Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo 25F9-EFLUOR 660Ebioscience15599866Fattore di diluizione: 1:20
Anticorpo CCR2-PE-Cy7Biolegend357212Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CCR5 PEBiolegend313707Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CCR8 PEBiolegend360603Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD11b-PEBiolegend301305Fattore di diluizione: 1:50
Anticorpo CD14-APCEbioscience10669167Fattore di diluizione: 1:20
Anticorpo CD163-PE-CY7BIolegend333614Fattore di diluizione: 1:25
Anticorpo CD169-APCBiolegend346007Fattore di diluizione: 1:25
Anticorpo CD206-PEBiolegend321106Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD209-PE-CY7 Biolegend3310114Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD274-PE-CY7Biolegend329718Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD43-PEEbioscience10854419Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD45-APCEbioscience15577936Fattore di diluizione: 1:20
Anticorpo CD86-APCBiolegend305412Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CD93-PEEbioscience10804637Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo CX3CR1-PEBiolegend307650Fattore di diluizione: 1:100
Anticorpo HLA-DR-BV650Biolegend307650Fattore di diluizione: 1:100
Antiboy CD115-PEBiolegend347308Fattore di diluizione: 1:40
Tampone di dissociazione cellulare, privo di enzimiThermofisher13151014
Tampone di dissociazione cellulare, privo di enzimi, PBSGibco13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, trattamento per coltura tissutale, nero, 96 pozzettiPerkinElmer6055302
CellMask Colorazione della membrana plasmatica rosso intensoThermofisherC10046Terreno di crioconservazione
Cryostor CS10SigmaC2874
CTS CELLstart SubstratoInvitrogenA1014201Substrato di cellule staminali
DAPIMerckD9542-1MGConcentrazione finale 1 μ g/mL
DPBS, calcio, magnesio (500 mL)Thermofisher14040091
Reagente bloccante FcR,umano MACS Miltenyi Biotec130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Proteina umana ricombinanteThermofisherPHG0021
GlutaMAX IntegratoreThermofisher35050061
ricombinante umano IFNYThermofisher14-8319-80
Albuminum sierico umanoIrvine Scientific9988
Lipopolisaccaride (LPS) da E. ColiSigmaL2630
NucBlue (Hoechst33342)ThermofisherR37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticelle coniugate per fagocitosiThermofisherP35365
Gelatina per pelle suinaSigmaG9136
Proteina BMP4 umana ricombinanteR& D314-BP-010
Umano ricombinante IL10Preprotech200-10
Umano ricombinante IL3Preprotech200-03-10
Umano ricombinante IL4Preprotech200-04
Ricombinante Umano MCSF (senza carrier) 100 μ gBiolegend574806
Proteina VEGF umana ricombinanteR& D293-VE-010
Inibitore della roccia Y-27632MerckSCM075
SCF (C-Kit Ligando) Proteina umana ricombinanteThermofisherPHC2111
StemPro hESC SFMThermofisherA1000701
StemPro EZPassage Strumento di passaggio delle cellule staminali monousoThermofisher23181010
Piastre di fissaggio ultrabasse: Piastra multipozzetto per colture cellulari, 6 pozzetti, superficie repellente per cellule a stella cellulareGreiner657970
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
X-Vivo 15 flacone da 500 mLLonzaBE02-060F

Riferimenti

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