Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Asha  A. Philip; Jin Dai; Sarah P. Katen; John  T. Patton

doi:10.3791/61039

Articolo metodologico

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

DOI:

10.3791/61039

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17 aprile 2020

Asha A. Philip¹ , Jin Dai¹ , Sarah P. Katen¹ , John T. Patton¹

¹Department of Biology, Indiana University

In questo articolo

Sommario

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La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Abstract

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I rotavirus sono una grande e in continua evoluzione di virus segmentati dell'RNA a doppio filamento che causano una grave gastroenterite nei giovani di molte specie di mammiferi e aviari, compresi gli esseri umani. Con il recente avvento dei sistemi di genetica inversa del rotavirus, è diventato possibile utilizzare la mutagenesi diretta per esplorare la biologia del rotavirus, modificare e ottimizzare i vaccini esistenti sul rotavirus e sviluppare vettori di vaccino multitarget del rotavirus. In questa relazione, descriviamo un sistema di genetica inversa semplificato che consente il recupero efficiente e affidabile dei rotavirus ricombinanti. Il sistema si basa sulla co-trascrizione di vettori di trascrizione T7 che esprimono rotavirus a lunghezza intera e su un vettore CMV che codifica un enzima di aggancio dell'RNA nelle cellule BHK producendo constitutively produrre polimerasi T7 RNA (BHK-T7). I rotavirus ricombinanti sono amplificati sovrasseminando le cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, una linea cellulare renale delle scimmie che è altamente permissiva per la crescita del virus. In questo rapporto, descriviamo anche un approccio per generare rotavirus ricombinanti che esprimono una proteina reporter fluorescente separata attraverso l'introduzione di un elemento di stop-restart traslazionale 2A nel segmento 7 del genoma (NSP3). Questo approccio evita di cancellare o modificare uno qualsiasi dei fotogrammi di lettura aperti virali, consentendo così la produzione di rotavirus ricombinanti che mantengono proteine virali completamente funzionali e allo stesso tempo di esprimere una proteina fluorescente.

Introduzione

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I rotavirus sono le principali cause di gastroenterite grave nei neonati e nei bambini piccoli, così come i giovani di molti altri mammiferi e specie aviarie¹. Come membri della famiglia Reoviridae, i rotavirus hanno un genoma di RNA a doppio filamento (dsRNA) segmentato. I segmenti del genoma sono contenuti all'interno di un virione icosaedro non avvolto formato da tre strati concentrici di proteine². Sulla base del sequenziamento e dell'analisi filogenetica dei segmenti del genoma, sono state definite nove specie di rotavirus (A, D, F,J)³. I ceppi che comprendono la specie a rotavirus A....

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Protocollo

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1. Preparazione dei supporti e manutenzione della coltura cellulare

Ottenere cellule renali di criceto bambino che esprimono le cellule del rene T7 RNA (BHK-T7) e il rene della scimmia verde africana MA104.
NOTA: Le cellule BHK-T7 (o BSR-T7) non sono disponibili in commercio, ma sono una linea cellulare comune di laboratori che utilizzano la genetica inversa per studiare la biologia del virus dell'RNA. La linea cellulare BHK-T7 utilizzata in questo protocollo è stata ottenuta dalla Dott.ssa Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), co-sviluppatore della linea cellulare BHK originale che esprime la polimerasi T7 RNA

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Risultati

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Il protocollo di genetica inversa descritto in questo articolo procede attraverso più passaggi distinti: (1) co-trasfezione di cellule BHK-T7 con vettori di trascrizione del rotavirus pT7 e pCMV/NP868R espressione plasmid, (2) semina di cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, (3) amplificazione dei virus ricombinanti presenti nelle cellule BHK-T7/MA104 che utilizzano cellule MA104 e (4) isolamento della placca del virus ricombinante utilizzando cellule MA104(Figura 2). Nelle nostre mani, .......

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Discussione

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Nel nostro laboratorio, ci affidiamo regolarmente al protocollo di genetica inversa descritto qui per produrre rotavirus SA11 ricombinanti. Con questo approccio, gli individui con poca esperienza nelle tecniche di biologia molecolare o che lavorano con i rotavirus recuperano i virus ricombinanti anche al loro primo tentativo. Abbiamo generato quasi 100 virus ricombinanti seguendo questo protocollo, compresi quelli con genomi che sono stati riprogettati per esprimere proteine estranee (ad esempio, SP) e che contengono agg.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni R03 AI131072 e R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, e il Lawrence M. Blatt Endowment. Ringraziamo i membri del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, e Guido Papa per i loro numerosi contributi e suggerimenti nello sviluppo del protocollo di genetica inversa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Rene di criceto - Cellule			Contatto: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel	Bio-Rad	45608105
Cellometro AutoT4 contatore di cellule vitali	Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System	Bio-Rad
Cloroformio	MP	194002
Substrato di chemiluminescenza potenziata occidentale (ECL)	Bio-RAD	170-5060
Batteri E.coli DH5alpha competenti	Lucigen	60602-2
Inibitore completo della proteasi	Pierce	A32965
Pipette di trasferimento monouso, punte estese ultrafini	MTC Bio	P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Terreno essenziale minimo di Eagle, 2x (2xEMEM)	Biologico di qualità	115-073-101
Etanolo, assoluto (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Soluzione di bromuro di etidio (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
Siero fetale bovino (FBS),	M2 Corning	35-011-CV
inattivato a caldo, monoclonale di topo	Sigma-Aldrich	F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit	Sigma	NA0200-1KT
Geneticin (G-418)	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM con fondo basso fluorescenza
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710-035
IgG anti-coniglio di capra, perossidasi di rafano (HRP)	tecnologia di segnalazione cellulare	7074S
cavia Anti-NSP3 Antisiero	Patton lotto di laboratorio	55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum	Patton lotto di laboratorio	53963
IgG anti-porcellino d'India di cavallo, perossidasi di rafano (HRP) coniugata	KPL	5220-0366
IgG anti-topo di cavallo, eroxidasi di rafano (HRP)	tecnologia di segnalazione cellulare	7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Kit di rilevamento JH	Science	25235
Alcool isopropilico	Macron	3032-02
Soluzione di L-glutammina ( 100x)	Gibco	25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)	Prodotti di ricerca RPI	L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Terreno di coltura	Hyclone	Sh30253.01
Medium essenziale minimo -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)	Lonza	04-719Q
Rene di scimmia (MA104) Cellule	ATCC	ATCC CRL-2378.1
Spettrofotometro NanoDrop One	Soluzione Rossa Neutra TermoScientifica
(0,33%)	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
Soluzione di Amminoacidi Non Essenziali (100x)	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-Glicina Poliacrilammide Mini-Gel	Invitrogen	XP00102BOX
Acqua di Biologia Molecolare Senza Nucleasi	Invitrogen	10977-015
Kit di pulizia NucleoSpin Gel e PCR	Takara	740609.25
Opti-MEM Siero ridotto Medium	Gibco	31985-070
Pestello a pellet (senza RNasi, usa e getta)	Fisher	12-141-368
Soluzione di penicillina-streptomicina, (100x penn-strep)	Corning	30-002-Cl
Fosfato Soluzione salina tamponata (PBS), 10x	Fisher Bioreagents	BP399-20
Tripsina suina, tipo IX-S	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Qiagen Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAprep Spin Miniprep	KitQiagen	27104
SA11 pT7 Vettori di trascrizione	Addgene	89162-89172
SA11 pT7 / NSP3 Vettori di trascrizione che esprimono proteine			Contatto: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarosio	Lonza	50000	Per elettroforesi su gel
SeaPlaque agarosio	Lonza	50100	Per il saggio
della placcaKit RT-PCR in un solo passaggio Superscript III	Invitrogen	12574-035
Kit di trasferimento di nitrocellulosa turbo Trans-Blot	Bio-Rad	170-4270
Sistema di trasferimento turbo Trans-Llot	Bio-Rad
TransIT-LTI Reagente di trasfezione	Mirus	MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)	Bio-Rad	161-0772
Triton X 100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA Reagente per l'estrazione	Ambion	15596026
Trypan blue	Corning	25-900-CI
Tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) Qualità della soluzione di dissociazione cellulare	Biologico	118-087-721
Brodo di triptosio fosfato	Gibco	18050-039
Tween-20	VWR	0777-1L
Vertrel VF solvente	Zoro	G0707178
Zoe Imager fluorescente per cellule vive	Bio-Rad

T7 RdRP (BHK-T7) anticorpo coniugata coniugata fluorescenti

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
Intern....

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Cellule BHKT7 Cellule MA104 Trasfezione plasmidica Reporter fluorescente Elemento 2A Saggio di placche Amplificazione virale Estrazione di RNA

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