Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Sommario

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Abstract

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per eradicare il virus variola (VARV), l'agente causale del vaiolo, dalla natura. Dal suo primo utilizzo come vaccino, VACV è stato sviluppato come vettore per i vaccini terapeutici e come virus oncolitico. Queste applicazioni sfruttano il genoma facilmente manipolabile di VACV e l'ampia gamma di host come una piattaforma eccezionale per generare virus ricombinanti con una varietà di applicazioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare VACV ricombinante, tra cui metodi di selezione dei marcatori e selezione dominante transitoria. Qui, presentiamo un perfezionamento di un metodo di selezione dell'intervallo host accoppiato con l'identificazione visiva dei virus ricombinanti. Il nostro metodo sfrutta la pressione selettiva generata dalla proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) accoppiata con un gene di fusione fluorescente che esprime E3L con tag mCherry, uno dei due antagonisti VACV PKR. La cassetta, compreso il gene di interesse e la fusione mCherry-E3L, è affiancata da sequenze derivate dal genoma VACV. Tra il gene di interesse e mCherry-E3L c'è una regione più piccola che è identica ai primi 150 nucleotidi del braccio da 3', per promuovere la ricombinazione omologa e la perdita del gene mCherry-E3L dopo la selezione. Dimostriamo che questo metodo consente una generazione efficiente e senza soluzione di continuità di rVACV in una varietà di tipi di cellule senza richiedere la selezione di farmaci o uno screening completo per i virus mutanti.

Introduzione

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per la prima eradicazione di successo di un patogeno umano, il virus variola (VARV), dalla natura. Fin dallo sterminio del virus della variola, i poxvirus tra cui VACV hanno continuato ad essere utili virus terapeutici sia per la medicina umana che per quella animale. Ad esempio, un vaccino contro il virus della rabbia basato su VACV è stato molto efficace nel prevenire la trasmissione della rabbia silvatica in Europa¹ e negli Stati Uniti². Più recentemente, i poxvirus ricombinanti che esprimono una varietà di molecole antitumorali (ad esempio, anticorpi a catena singola o er....

Protocollo

1. Generazione del vettore di ricombinazione

1. Progettare i numeri primi per generare la cassetta di selezione. Progettare ogni singolo amplificatore con sequenze sovrapposte con amplificatori vicini e il vettore per facilitare l'assemblaggio enzimatico isotermico di molecole di DNA, chiamato anche assemblaggio Gibson, utilizzando uno dei diversi strumenti di progettazione primer online.
   NOTA: questo protocollo può essere completato anche utilizzando i metodi tradizionali di clonazione basati su endonuclease. In tal caso, progettare i numeri di prima livello con i siti di restrizione appropriati anziché con sequenze sovrapposte.
2. Utilizzando i prim....

Risultati

Abbiamo usato la procedura illustrata nella Figura 1 per generare un VACV privo sia di PKR antagonisti E3L che di K3L, sostituendo E3L con EGFP in un virus già eliminato per K3L (vP872). La figura 2 mostra le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 competenti di PKR che indicano l'espressione virale di mCherry-E3L, nonché EGFP espresse nelle cellule RK13-E3L-K3L che confermano la perdita di E3L e il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L.

Discussione

Qui presentiamo una variazione di una strategia di selezione dei marcatori ^{transitoria 32} per generare virus della vaccino ricombinante senza trattenere il DNA estraneo nel virus ricombinante finale. La nostra strategia utilizza una pressione selettiva mediata dalla proteina antivirale ospite PKR piuttosto che da altre forme di pressione selettiva come gli antibiotici. L'uso di geni antivirali ospiti elimina la possibilità di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente nelle cellule o un aumento d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Polimerasi ad alta fedeltà utilizzata nella PCR
Ampicillina	ThermoFisher Scientific	11593027	Agente selettivo batterico
Raschietti cellulari monouso	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Raschietto cellulare per raccogliere cellule infette
EVOS FL Auto 2 Sistema di imaging cellulare	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscopio a fluorescenza
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Reagente di trasfezione
Luria Bertani (LB) Brodo	Gibco	10855021	Terreno di crescita batterica
Kit di estrazione	del gel di DNA MonarchNEB	T1020L	Kit di purificazione del gel utilizzato per purificare ampliconi e vettori linearizzati Kit
di minipreparazione del plasmide Monarch	NEB	T1010L	Kit di miniprep utilizzato per purificare i plasmidi
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	Spettrofotometro ND-ONE-W	utilizzato per misurare la concentrazione di RNA e DNA
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Kit di montaggio enzimatico isotermico utilizzato per generare il vettore di ricombinazione
Q500	Sonicatore Qsonica	Q500-110	Sonicatore per lisati virali
Cellule RK13	ATCC	CCL-37	Cellule renali di coniglio
VWR Piastre per colture cellulari multipozzetto VWR		10062-892	Piastre per colture cellulari