È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

7.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

4 maggio 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

In questo articolo

Sommario

Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l'alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.

Abstract

La spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è un metodo potente per la caratterizzazione biofisica dei cambiamenti conformazionali enzimatici e delle interazioni enzima-substrato. Tra i suoi numerosi benefici, HDX-MS consuma solo piccole quantità di materiale, può essere eseguito in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura enzima/substrato, e può fornire informazioni risolte spazialmente sulla dinamica enzimatica conformazionale, anche per grandi enzimi e complessi multiproteina. Il metodo è iniziato dalla diluizione dell'enzima di interesse in tampone preparato in D2O. Ciò innesca lo scambio di prozio in ammidi di legame peptidico (N-H) con deuterio (N-D). Nei punti di tempo di scambio desiderati, le aliquote di reazione vengono spente, l'enzima viene proteoliizzato in peptidi, i peptidi sono separati dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC), e il cambiamento di massa di ogni peptide (a causa dello scambio di idrogeno con deuterio) è registrato da MS. La quantità di assorbimento del deuterio da parte di ogni peptide dipende fortemente dall'ambiente locale di legame idrogeno di quel peptide. I peptidi presenti in regioni molto dinamiche del deuterio di scambio enzimatico molto rapidamente, mentre i peptidi derivati da regioni ben ordinate subiscono uno scambio molto più lento. In questo modo, il tasso HDX riporta la dinamica conformazionale enzimatica locale. Le perturbazioni ai livelli di assorbimento del deuterio in presenza di diversi ligandi possono quindi essere utilizzate per mappare i siti di legame dei ligandi, identificare le reti allosteriche e comprendere il ruolo della dinamica conformazionale nella funzione enzimatica. Qui, illustriamo come abbiamo usato HDX-MS per comprendere meglio la biosintesi di un tipo di prodotti naturali peptidici chiamati lanthipeptides. I lanthipeptidi sono peptidi geneticamente codificati che vengono modificati post-traslazionemente da grandi enzimi multifunzionali, conformazionali dinamici che sono difficili da studiare con i tradizionali approcci di biologia strutturale. HDX-MS fornisce una piattaforma ideale e adattabile per studiare le proprietà meccaniche di questi tipi di enzimi.

Introduzione

Le proteine sono molecole strutturalmente dinamiche che campionano diverse conformazioni su scale di tempo che vanno dalla vibrazione del legame su scala femtoseconda ai riarrangiamenti di interi domini proteici che possono verificarsiper molti secondi 1. Queste fluttuazioni conformazionali sono spesso aspetti critici della funzione enzimatica/proteica. Ad esempio, i cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando sono spesso di fondamentale importanza per modulare la funzione enzimatica, sia organizzando i residui attivi del sito necessari per la catalisi, definendo siti di legame del substrato in meccanismi cinetici sequenziali, proteggendo gli intermedi reattivi dall'ambiente, sia modulando la funzione enzimatica attraverso reti allosteriche. Recenti studi hanno anche dimostrato che la dinamica conformazionale può essere conservata durante l'evoluzione e che le perturbazioni ai moti molecolari conservati possono essere correlate con i cambiamenti nella specificità del substrato e l'emergere di nuove funzionienzimatici 2,3.

Negli ultimi anni, la spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è rapidamente emersa come una potente tecnica per sondare come i paesaggi conformazionali proteici rispondono a perturbazioni come il legame del ligando o la mutagenesi4,5,6,7. In un tipico esperimento HDX-MS (Figura 1), una proteina di interesse viene messa in tampone preparata in D2O, che innesca la sostituzione di protoni scambiabili con solventi con deuteria. Il tasso di scambio della moietà ammide dei legami peptidici dipende fortemente dal pH, dalla sequenza amminoacidica locale e dall'ambiente strutturale locale dell'ammide8. Le ammidi impegnate nelle interazioni di legame idrogeno (come quelle presenti in α-eliche e β fogli) si scambiano più lentamente delle ammidi nelle regioni non strutturate della proteina che sono esposte al solvente sfuso. Pertanto, l'estensione dell'assorbimento del deuterio è un riflesso della struttura dell'enzima. Ci si aspetta che enzimi conformi alla dinamica, o che subiscono transizioni strutturali al legame del ligando, producano una risposta HDX misurabile.

La base meccanicistica per il lento tasso di cambio di un'ammide strutturata è illustrata nella figura 25,8,9. Per sottoporsi all'HDX, la regione strutturata deve prima campionare transitoriamente una conformazione dispiegata, in modo che le molecole di solvente che catalizzano lo scambio di HDX attraverso uno specifico meccanismo acido/base chimica abbiano accesso all'ammide scambiabile. In definitiva, le grandezze relative del tasso di cambio chimico (kchem) e i tassi di piegatura e ripiegamento (kaperto e kvicino) determinano il tasso di HDX misuratonell'esperimento 5,8. Da questo semplice modello cinetico, è chiaro che l'estensione dell'assorbimento del deuterio rifletterà la dinamica conformazionale sottostante (come definita da kopen e kclose). La maggior parte degli esperimenti HDX-MS viene eseguita in un flusso di lavoro dal basso verso l'alto in cui, a seguito della reazione di scambio, la proteina di interesse viene digerita in peptidi e l'assorbimento del deuterio da parte di ciascun peptide viene misurato come un aumento dellamassa 7. In questo modo, HDX-MS consente di mappare le perturbazioni alla dinamica enzimatica conformazionale sulla scala spaziale locale dei peptidi, consentendo al ricercatore di valutare come la perturbazione alteri la dinamica in diverse regioni dell'enzima di interesse.

I vantaggi dell'approccio HDX-MS per chiarire la dinamica strutturale delle proteine sono numerosi. In primo luogo, il metodo può essere eseguito con piccole quantità di proteine native o su complessi proteici in sistemi con struttura quaternaria10. Non è nemmeno necessario che il preparato enzimatico utilizzato nel saggio sia altamente purificato11,12, purché il flusso di lavoro HDX-MS dal basso verso l'alto fornisca un numero sufficiente di peptidi identificati con sicurezza che coprono la sequenza proteica di interesse. Inoltre, HDX-MS può fornire informazioni sulla dinamica conformazionale in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura proteica site-specific come sarebbe utilizzata negli studi di fluorescenza a singolamolecola 13e non esiste un limite di dimensione al complesso proteico o proteico che può essere studiato (il che rende impegnativi approcci come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare [NMR])7,14. Infine, i metodi HDX-MS risolti nel tempo possono essere utilizzati per studiare proteine intrinsecamente disordinate, che sono difficili da studiare con la cristallografia a raggi X15,16,17,18. La limitazione principale di HDX-MS è che i dati sono a bassa risoluzione strutturale. I dati HDX-MS sono utili per indicare dove la dinamica conformazionale sta cambiando e per rivelare cambiamenti conformazionali accoppiati, ma spesso non forniscono molte informazioni sul preciso meccanismo molecolare che guida il cambiamento osservato. Recenti progressi nella combinazione di metodi di dissociazione da cattura elettronica con dati proteina HDX-MS hanno mostrato promesse per la mappatura dei siti di scambio a singoli residui di amminoacidi19, ma gli studi biochimici e strutturali di follow-up sono ancora spesso necessari per fornire chiarezza ai modelli strutturali inoltrato dai dati HDX-MS.

Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato per lo sviluppo di un test HDX-MS20. I protocolli di preparazione del campione presentati di seguito dovrebbero essere generalmente applicabili a qualsiasi proteina che mostri una buona solubilità in tamponi acquosi. Metodi di preparazione dei campioni più specializzati e flussi di lavoro HDX-MS sono disponibili per le proteine di quanto sia necessario saggiare in presenza di detergente o fosfolipidi21,22,23,24. Le impostazioni strumentali per la raccolta dei dati HDX-MS sono descritte per uno spettrometro di massa quadrupolo ad alta risoluzione accoppiato al sistema di cromatografia liquida. Dati di complessità e risoluzione simili potrebbero essere raccolti su uno qualsiasi dei numerosi sistemi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) disponibili in commercio. Vengono inoltre forniti aspetti chiave del trattamento dei dati utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio. Presentiamo anche linee guida per la raccolta e l'analisi dei dati coerenti con le raccomandazioni formulate dalla più ampia comunità HDX-MS12. Il protocollo descritto viene utilizzato per studiare le proprietà strutturali dinamiche di HalM2, una sintetasi lanthipeptide che catalizza la maturazione multistep di un prodotto naturale peptide antimicrobico20. Illustriamo come HDX-MS può essere utilizzato per rivelare siti di legame del substrato e proprietà allosteriche che sono sfuggite alla caratterizzazione precedente. Diversi altri protocolli sulle proteine HDX-MS sono stati pubblicati negli ultimi anni25,26. Insieme al presente lavoro, questi contributi precedenti dovrebbero fornire al lettore una certa flessibilità nella progettazione sperimentale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti deuterati e soluzioni per stock enzimatici

  1. Preparare i reagenti necessari per le reazioni HDX (inclusi eventuali tamponi, sali, substrati, ligandi, ecc.) come soluzioni di stock concentrato 100−200x in D2O (frazione atomica 99,9% D). Preparare almeno 50 mL di soluzione di scorta stabilizzatrice.
    NOTA: Per la caratterizzazione di HalM2, sono state preparate le seguenti soluzioni: 500 mM MgCl2, 100 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP), 750 mM ATP (nel buffer HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 e 500 mM AMPPNP.
  2. Congelare e liofilizzare le soluzioni stock alla secchezza.
  3. Ri-dissolvenza in D2O, e ripetere il ciclo di liofilizzazione almeno un tempo in più per sostituire il maggior numero possibile di protoni scambiabili con deuteroni.
  4. Regolare il pD della scorta stabilizzatrice HEPES deuterata al valore desiderato con NaOD/DCl concentrato, tenendo presente la seguente relazione27:
    figure-protocol-1
    NOTA: Il tasso di ammide HDX dipende fortemente dal pL della soluzione (pL = pH o pD)5. Diversi lotti di soluzioni di scorta stabilizzatrice devono essere preparati, immagazzinati e utilizzati in modo identico per evitare una leggera deriva pL tra gli esperimenti.
  5. Calcolare la quantità di ogni reagente necessaria per un saggio HDX da 300 μL e conservare come aliquote ad uso singolo a -80 °C.
  6. Preparare una soluzione concentrata di stock enzimatico (~100−200 μM) in tampone di stoccaggio enzimatico protiato utilizzando un filtro centrifugo(Tabella dei materiali)o un dispositivo equivalente.
    NOTA: L'esatto tampone e il taglio del peso molecolare del filtro centrifugo dipenderanno dalla proteina /enzima di interesse. HalM2 è conservato in HEPES da 50 mM, pH 7,5, 100 mM KCl e 10% glicerolo. Per preparare l'enzima concentrato sono stati utilizzati filtri da 10 kDa.
  7. Aliquota l'enzima in porzioni monoutilizzazioni e conservare a -80 °C.
    NOTA: questo può essere un punto di arresto. Tutte le soluzioni stock descritte nella sezione 1 possono essere preparate prima delle reazioni HDX. Se conservato a -80 °C, la maggior parte degli enzimi/soluzioni di stock deuterato sarà stabile per molti mesi.

2. Calibrazione del volume di tempra HDX

  1. Preparare una reazione HDX da 300 μL in D2O utilizzando i reagenti deuterati e le scorte enzimatiche concentrate preparate nella sezione 1.
    1. Utilizzare una concentrazione enzimatica finale di 1−5 μM.
    2. Utilizzare una concentrazione finale di tampone HEPES deuterato di almeno 50−100 mM.
    3. Assicurarsi che le concentrazioni di altri componenti siano sufficienti per mantenere l'attività/funzione enzimatica desiderata.
  2. Preparare 1 L di soluzione di tempra HDX (fosfato da 100 mM, 0,8 M guanidina-HCl, pH 1,9). Congelare e conservare sia in porzioni da 50 mL (per stock a lungo termine) che in porzioni da 1 mL (per aliquote monoutilizzi).
    NOTA: La composizione esatta del buffer di tempra dipenderà dall'enzima utilizzato nella fase di proteolisi del flusso di lavoro HDX-MS dal basso verso l'alto (passaggio 3.3.3). Il buffer di tempra qui fornito è compatibile con la pepsina, la proteasi più comunemente usata per HDX-MS. Se viene utilizzata una proteasi diversa, verificare con il fornitore di proteasi per garantire la compatibilità del buffer.
  3. Calibrare il volume del buffer di tempra necessario per regolare il pL finale della miscela di reazione HDX spenta su un valore di lettura del misuratore di pH pari a 2,3.
    NOTA: Il tasso di cambio H/D del solvente ammide N-H è un processo dipendente dal pH soggetto sia alla catalisi acida che a quella di base. Il tasso di cambio minimo si verifica ad un valore di pH 2,5 (lettura pH metro = 2,3 per una miscela 50:50 H2O:D2O). Pertanto, un valore finale di pL vicino a 2,5 ridurrà al minimo lo scambio di ritorno dell'idrogeno che si verifica durante l'analisi LC-MS dal basso verso l'alto, preservando così l'etichetta del deuterio nei peptidi.
    1. Mescolare 50 μL della miscela di reazione HDX dal passo 2.1 con 50 μL di tampone di tempra e misurare il pL della miscela temprato con un elettrodo microtip.
    2. Aumentare il volume della soluzione di tempra in base alle esigenze per regolare la lettura finale del misuratore di pH su un valore di 2,3.
    3. Una volta determinato il volume di tempra appropriato, ripetere più volte il processo di tempra utilizzando aliquote fresche da 50 μL dalla reazione HDX (fase 2.1) per assicurarsi che un pL finale coerente sia raggiunto dopo l'aggiunta di una quantità fissa di tampone di tempra.

3. Preparazione di campioni di riferimento e ottimizzazione del flusso di lavoro LC-MS dal basso verso l'alto

  1. Preparare campioni di riferimento non deuterati per la proteina di interesse per il triplicato in tubi da 0,5 ml. Assicurarsi che le condizioni della miscela di reazione finale siano identiche a quelle utilizzate nelle reazioni HDX autentiche (fase 2.1), tranne per il fatto che le reazioni sono preparate in H2O utilizzando soluzioni di materiale reagente preparate anche in H2O.
  2. Spegnere i campioni come nel passaggio 2.3 aggiungendo il volume appropriato di tampone di tempra per regolare il pH finale a 2,5. Flash congelare i campioni in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a quando non sono pronti per l'analisi.
  3. Analizzare i campioni di riferimento enzimatici protiati utilizzando un flusso di lavoro LC-MS dal basso verso l'alto.
    NOTA: Prima di eseguire questi passaggi, il sistema LC-MS da utilizzare per l'acquisizione dei dati deve essere calibrato correttamente e pronto per l'uso. La tempistica e la temperatura di tutti i passaggi del flusso di lavoro LC-MS dal basso verso l'alto devono essere rigorosamente controllate al fine di ridurre al minimo le differenze nello scambio posteriore tra campioni. Con la strumentazione MS utilizzata in questo protocollo (Tavola dei materiali e Informazioni di supporto), la maggior parte dei passaggi può essere controllata attraverso il software dello strumento. Per garantire la raccolta di repliche precise, si consiglia di automatizzare il maggior numero possibile di passaggi nel flusso di lavoro.
    1. Rimuovere un singolo campione di riferimento enzimatico (preparato come al passaggio 3.2) dal congelatore e scongelare a 37 °C per 1 minuto in un bagno d'acqua.
    2. Esattamente 2 minuti dopo aver rimosso il campione dal congelatore e scongelato, iniettare una porzione di 40 μL del campione di riferimento temprato in una colonna di cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) contenente una fase stazionaria funzionalizzata con pepsina (una proteasi acido-stabile).
    3. Digerire il campione ad una portata di 100 μL/min per 3 min a 15 °C utilizzando lo 0,1% di acido formico in H2O (pH = 2,5) come solvente.
    4. Raccogliere i peptidi peptici mentre eludono dalla colonna di pepsina su una colonna trappola C18 tenuta a 0,4 °C per ridurre al minimo lo scambio posteriore.
    5. Passare i peptidi peptici dissalati dalla colonna trappola a una colonna analitica C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) tenuta e operata a 0,4 °C per la separazione dei peptidi peptici.
      NOTA: I passaggi 3.3.3−3.3.5 possono essere automatizzati da alcuni sistemi LC-MS utilizzati per l'acquisizione di dati HDX-MS. In alternativa, questi passaggi possono essere eseguiti in modo indipendente, tenendo presente che la tempistica e la temperatura di ogni passaggio devono essere attentamente controllate per ottenere uno scambio di schiena costantemente basso.
    6. Elute la colonna C18 con un sistema di solvente acido formico acetonitrile/acqua/0,1%. Ottimizzare il gradiente LC per la proteina di interesse al fine di massimizzare la separazione e preservare l'etichetta del deuterio nei peptidi peptici.
      NOTA: i dettagli sull'eluizione del gradiente sono disponibili nelle informazioni di supporto.
    7. Sottoseminare il digest peptico alla spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI).
      NOTA: Le condizioni di origine fornite nelle informazioni di supporto forniranno una ionizzazione sufficiente per la maggior parte dei peptidi peptici.
      1. Una volta ionizzato nello strumento MS, eseguire una separazione della mobilità ionica in fase gassosa utilizzando l'azoto come gas tampone per migliorare la capacità di picco del metodo.
      2. Dopo la separazione della mobilità ionica, sottosostire gli ioni precursori pepticipeptidici ad un flusso di lavoro MS E che comporta cicli alternati di bassa energia di collisione (4 V) e alta energia di collisione (21−40 V).
        NOTA: I regimi alternati di energia a bassa e alta collisione consentono la raccolta di dati MS (bassa energia di collisione) contemporaneamente ai dati MSMS (alta energia di collisione). Questo, a sua volta, consente la correlazione del tempo degli ioni precursori con i rispettivi ioni frammentare. Questa correlazione è essenziale per un'identificazione peptidica sicura descritta nella sezione 4.
      3. Rilevare il precursore peptidico e gli ioni di frammento utilizzando un analizzatore di massa con un potere di risoluzione di almeno 20.000.
      4. In contemporanea con l'acquisizione dei dati, acquisire i dati MS per uno standard esterno [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        NOTA: il flusso di lavoro MS descritto nel passaggio 3.3.7 viene definito protocollo MSE. Le impostazioni strumentali complete per un protocollo MSE adatto per HDX-MS dal basso verso l'alto sono fornite nelle informazioni di supporto.
    8. Valutare la qualità dei dati LC-MS.
      NOTA: Utilizzando il protocollo sopra descritto e le impostazioni strumentali fornite nelle informazioni di supporto, i campioni di riferimento devono produrre un cromatogramma ionici totale con un'intensità massima del segnale di circa 1 x 108. Dovrebbero esserci molti peptidi peptici che eluicolano tra 3−9 min(Figura 3A−C).
    9. Iniettare 40 μL di campioni vuoti (0,1% di acido formico in acqua) per pulire la pepsina e le colonne analitiche C18.
      NOTA: In generale, 2−3 spazi vuoti dovrebbero essere sufficienti.
    10. Ripetere i passaggi 3.3.1−3.3.9 per ciascuno dei campioni di proteine di riferimento triplicati.

4. Elaborazione dei dati di riferimento e definizione di un elenco peptidico

  1. Analizzare i dati MSE grezzi (passaggio 3.3.7) utilizzando il software di proteomica (Table of Materials). Utilizzando il software di proteomica, passare a Librerie | Protein Sequence Databanks per definire il database proteico importando la sequenza di amminoacidi della proteina di interesse.
    NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è quello di cercare i dati MS di riferimento per i peptidi peptici derivati dalla proteina di interesse e di utilizzare i dati MSMS (acquisiti contemporaneamente ai dati MS) per convalidare eventuali identificazioni peptidiche putative.
  2. Dare un nome alla sequenza proteica di interesse. Importare la sequenza proteica (in formato FASTA). Il software eseguirà una digestione in silico della proteina del database per generare un elenco di peptidi che verranno utilizzati per cercare i dati LC-MS.
  3. Definite i parametri di elaborazione (trovati nel menu Libreria). Selezionare Electrospray MSE come tipo di acquisizione dati. Nel campo Massa di blocco per carica 2 immettere 785.8426 per m/z per lo ione 2+ di [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) e fare clic su fine.
  4. Definire i parametri del flusso di lavoro (che si trovano nel menu Libreria).
    1. Selezionare Electrospray MSE per il tipo di ricerca. In Workflow | Intestazione Query di ricerca database, selezionare la proteina del database creata nel passaggio 4.2 nel campo Banca dati.
    2. Impostare Reagente digest primario su non specifico e deselezionare il campo Reagente modificatore fisso tenendo premuto ctrl mentre si fa clic su Carbamidomethyl C.
  5. Specificare la directory di output passando alle opzioni | configurazione dell'automazione | Identità E. Selezionare le caselle relative all'output 3D 3D e peptidico e all'output contabile ionio Apex e specificare la directory desiderata.
  6. Elaborare i dati di esempio di riferimento.
    1. Sulla barra degli strumenti sinistra dello spazio di lavoro della piattaforma proteomica, creare una nuova piastra facendo clic con il pulsante destro del mouse su Microtiter Plate. Evidenziare tre pozzi nella piastra del microtitoro (uno per ogni campione di riferimento raccolto nella sezione 3). Fare clic a sinistra in un pozzo, tenere premuto e trascinare su tre pozzi.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Aggiungi dati non elaborati. Nella finestra visualizzata passare alla directory contenente i tre file di riferimento della sezione 3 e selezionarli contemporaneamente.
    3. Fare clic su avanti e scegliere i parametri di elaborazione definiti nel passaggio 4.3. Fare clic su Avanti e selezionare i parametri del flusso di lavoro definiti nel passaggio 4.4. Quindi clicca su fine.
  7. Una volta che i dati grezzi, i parametri di elaborazione e i parametri del flusso di lavoro sono stati assegnati a ciascun pozzo sulla piastra, i pozzi appariranno blu. Selezionare i pozzi, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare i dati grezzi più recenti del processo. Fare clic nell'angolo inferiore destro della finestra per tenere traccia dell'elaborazione dei dati. Una volta visualizzato il messaggio Nessun processo da eseguire, l'elaborazione viene eseguita completamente.
  8. Al termine dell'elaborazione dei dati, i pozzi nella piastra diverranno verdi. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzi e scegliere Visualizza risultati flusso di lavoro. Si aprirà una finestra separata per ogni file di dati di riferimento.
  9. Ispezionare i dati per assicurarsi che la maggior parte dei segnali MS nei dati del campione di riferimento siano stati mappati con successo ai peptidi previsti dalla digestione in silico della proteina di interesse. I peptidi abbinati saranno colorati di blu nello spettro di uscita (Figura 4). Fare doppio clic sul filtro OK e verificare che la copertura percentuale sia maggiore del 99%.
    NOTA: al momento dell'elaborazione, l'output dei dati verrà salvato automaticamentecon l'estensione delfile (raw_data_file_name _IA_final_peptide) nella directory specificata nel passaggio 4.5.
  10. Importare l'uscita software proteomica nel software di elaborazione HDX (Table of Materials) per una maggiore soglia.
    1. Fare clic su Dati nell'angolo sinistro della finestra del software di elaborazione HDX. Fare clic su importa risultati PLGS e fare clic sull'icona aggiungi. Scegliere i file di dati elaborati dal passaggio 4.9 passando alla directory appropriata.
    2. Fare clic su Avanti e specificare i seguenti parametri: ioni consecutivi minimi ≥ 2, errore di massa = 5 ppm e soglia file = 3. Clicca al termine.
  11. Una volta soddisfatti i parametri di soglia, salvare il progetto HDX. Tutti i dati HDX verranno importati in questo progetto per l'analisi e la visualizzazione.
    NOTA: il deuterio scambiato campioni descritti nella sezione successiva dovrà essere elaborato con un flusso di lavoro LC-MS identico. Pertanto, prima di procedere con i test HDX (sezione 5), assicurarsi che la preparazione del campione (sezione 2), il flusso di lavoro LC-MS dal basso verso l'alto (sezione 3) e i flussi di lavoro di elaborazione dei dati (sezione 4) forniscano la riproducibilità e la copertura sequenziale desiderate della proteina target. Se uno di questi processi deve essere modificato per migliorare la copertura, si consiglia di tornare al passaggio 2.1, preparare nuovi campioni di riferimento in triplice copia e ripetere le sezioni 2−4 (mentre si apporta le modifiche necessarie al protocollo) per garantire che ogni peptide possa essere generato e rilevato in modo riproducibile.

5. Conduzione di reazioni HDX

  1. Preparare lo spazio di lavoro per le reazioni HDX.
    1. Tampone di tempra pre-aliquota in tubi da 0,5 ml correttamente etichettati. Preparare un tubo diverso per ogni punto di tempo, ogni replica e ogni stato biochimico da analizzare. Utilizzare il volume appropriato di tampone di tempra del passaggio 2.2 necessario per regolare la lettura finale del misuratore di pH di una porzione di 50 μL della reazione HDX a un valore di 2,3.
    2. Centrifugare brevemente le vasche da 0,5 ml per trasferire tutto il tampone di tempra sul fondo del tubo. Metti i tubi sul ghiaccio.
    3. Riempire un piccolo Dewar con azoto liquido e tenerlo adiacente allo spazio di lavoro.
  2. Preparare le reazioni HDX. Assicurarsi che vi sia un volume di reazione sufficiente per raccogliere il numero desiderato di punti di tempo di scambio (un'aliquota di 50 μL per ogni punto di tempo desiderato). Raccogliere almeno 4−5 punti di tempo su 3−4 ordini di grandezza in scala di tempo (ad esempio, tempi di tempra di 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min] e 14.400 s [4 h] forniscono un'adeguata copertura delle dinamiche di scambio per la maggior parte degli enzimi).
    1. Pre-mescolare tutti i componenti deuterati (meno enzima) dal passo 1.1 in D2O.
    2. Per ogni stato biochimico da esaminare (enzima libero, enzima + ligando, enzima + inibitore, ecc.), preparare le reazioni HDX in almeno triplicato.
    3. Incubare le miscele di reazione in un bagno d'acqua a temperatura controllata a 25 °C per 10 minuti prima dell'aggiunta dell'enzima.
      NOTA: L'enzima deve essere preparato come soluzione stock concentrata (~100−200 μM, passo 1.6) in modo da ridurre al minimo l'aggiunta di prozio nel saggio HDX.
    4. Dopo aver aggiunto l'enzima ad una concentrazione finale di 1−5 μM, avviare il timer. Mescolare con cura e rapidità la soluzione utilizzando una pipetta da 200 μL per garantire che l'enzima sia distribuito uniformemente nel campione.
    5. Nei punti di tempo di scambio desiderati, rimuovere le aliquote di 50 μL dalla reazione HDX e mescolare rapidamente e uniformemente con il tampone di tempra ghiacciato pre-aliquotato in un tubo da 0,5 ml.
      NOTA: I volumi di miscelazione e la procedura di miscelazione devono essere il più precisi e riproducibili possibile per garantire che il pL finale di tempra desiderato di 2,3 sia raggiunto rapidamente in tutti i campioni. Mantenere freddo il ghiaccio tampone di tempra aiuterà a ridurre al minimo lo scambio posteriore dopo la denaturazione dell'enzima.
    6. Immediatamente dopo aver spento il campione HDX, limitare il tubo e congelare il flash nell'azoto liquido.
    7. Continuare a raccogliere i punti di tempo fino al completamento di tutti i test, quindi trasferire i campioni nel congelatore -80 °C per la conservazione.
      NOTA: questo può essere un punto di arresto. Dopo aver raccolto tutti i punti di tempo HDX, i campioni possono essere conservati a -80 °C fino a quando non sono pronti per l'analisi LC-MS. Idealmente, le reazioni HDX triplicate devono essere eseguite per tutti gli stati biochimici di interesse lo stesso giorno. Come minimo, tutte le reazioni HDX replicate per un dato stato biochimico dovrebbero essere eseguite in parallelo lo stesso giorno.
  3. Dopo aver raccolto tutti i punti di tempo HDX spenti, sottosostire i campioni al flusso di lavoro LC-MS ottimizzato dal basso verso l'alto sviluppato come descritto nel passaggio 3.3. Iniettare campioni HDX in ordine casuale con un numero appropriato di spazi vuoti tra i campioni per garantire che qualsiasi riporto peptidico sia minimo.
    NOTA: i dati HDX non devono essere raccolti in modalità MSE. Pertanto, il segmento dell'energia ad alta collisione (fase 3.3.7.2) dovrebbe essere rimosso dal ciclo di servizio ms. Questa dovrebbe essere l'unica modifica apportate al flusso di lavoro descritto nel passaggio 3.3.
  4. Valutare la qualità dei dati HDX durante la raccolta.
    1. Assicurarsi che i picchi cromatografici presenti nel cromatogramma ionico totale dei campioni di riferimento non deuterati appaiano contemporaneamente nel tempo di ritenzione nei campioni deuterati (come nella figura 3D−F).
    2. Assicurarsi che gli spettri di massa sommati su intervalli di tempo specifici da campioni di riferimento e deuterati mostrino prove di deuterazione (cioè uno spostamento dell'involucro isotopico dei singoli peptidi a valori m/z più elevati nei campioni deuterati [Figura 6]).

6. Elaborazione dei dati HDX

  1. Importare i dati HDX nel progetto HDX creato nel passaggio 4.11 facendo clic su Data | FILE MS nella barra degli strumenti superiore.
    1. Fare clic su Nuovo Stato e Nuova Esposizione in base alle esigenze per definire gli stati biochimici (ad esempio, enzima libero, enzima + ligando, ecc.) e i tempi di esposizione al deuterio, rispettivamente, pertinenti all'analisi.
    2. Fare clic su Nuovo raw per selezionare i file di dati HDX da analizzare. Assegnare i tempi di scambio e lo stato biochimico appropriati a ogni file di dati non elaborati importato.
      NOTA: I dati possono essere importati ed elaborati in batch o tutti in una volta. L'aggiunta di dati al progetto non annulla alcuna analisi eseguita in precedenza all'interno di tale progetto.
  2. Una volta aggiunti i file di dati, fare clic su Fine per iniziare l'elaborazione dei dati. Dopo un breve ritardo, il software chiederà se l'utente desidera salvare i dati prima di continuare. Fare clic su sì.
    NOTA: L'elaborazione iniziale può richiedere fino a diverse ore a seconda del numero di campioni analizzati, del numero di peptidi nell'elenco peptidico finale (passaggio 4.10), delle dimensioni della finestra cromatografica e della frequenza di acquisizione spettrale.
  3. Se lo si desidera, modificare i parametri di elaborazione nel menu Configurazione per modificare i parametri di ricerca degli ioni. Assicurarsi di utilizzare gli stessi parametri di ricerca ioni per tutti i dati in un determinato progetto.

7. Analisi e visualizzazione dei dati HDX

NOTA: Una volta completata l'elaborazione iniziale dei dati grezzi (fase 6.2), il software di elaborazione HDX avrà individuato peptidi dall'elenco peptidico (generato nel passaggio 4.10) in ciascuno dei file di dati grezzi analizzati. Una volta che la distribuzione isotopica per un peptide nell'elenco si trova in un file di dati grezzo, il software di elaborazione HDX rappresenta ogni isotopo con un "bastone" (come nella figura 6C−E). Le intensità relative dei bastoncini per un dato peptide vengono quindi utilizzate per calcolare l'assorbimento del deuterio rispetto agli spettri di riferimento. Mentre il software di elaborazione HDX fa un lavoro ammirevole nell'assegnare correttamente i "bastoncini" alla maggior parte dei peptidi, sarà comunque necessaria una significativa cura manuale dei valori di assorbimento del deuterio.

  1. Analisi dei valori di assorbimento del deuterio peptidico
    1. Selezionate il primo peptide nell'elenco peptidico e aprite il plottaggio spettrale impilato dal menu Viste (Views). Scorrere verso l'alto e verso il basso nella finestra del plottaggio degli spettri impilati per vedere gli spettri di massa per il peptide selezionato in funzione del tempo di scambio del deuterio (Figura 7D,E).
    2. Assegnare e annullare l'assegnazione dei bastoncini in base alle esigenze utilizzando i clic del mouse per assicurarsi che la corretta distribuzione isotopica sia stata localizzata nei dati e che ogni picco isotopico sia stato assegnato (i bastoncini assegnati appariranno blu). Facendo clic su uno qualsiasi degli spettri nel tracciato spettrale in pila (Figura 7D,E) sarà possibile assegnare/annullare l'assegnazione di bastoncini nella finestra del visualizzatore dati attivo (Figura 7C).
    3. Controllare le assegnazioni del bastone per ogni stato di carica attivando lo stato di carica nella parte superiore della finestra del tracciato spettrale impilato.
    4. Ripetere i passaggi 7.1.1−7.1.3 per ogni stato biochimico di interesse. Lo stato biochimico può anche essere disattivato nella parte superiore della finestra del tracciato spettrale impilato. Per le misurazioni più accurate della differenza di assorbimento del deuterio, assicurarsi che i bastoncini siano assegnati per lo stesso insieme di stati di carica per ogni stato biochimico.
    5. Ripetere i passaggi 7.1.1−7.1.4 per ogni peptide nella lista dei peptidi.
    6. Controllare la deviazione standard dei valori di assorbimento del deuterio peptidico utilizzando la mappa di copertura.
      1. Accedere alla mappa di copertura dal menu Viste, che visualizza ogni peptide nell'elenco peptidico mappato lungo la sequenza di amminoacidi della proteina di interesse (Figura 8C). Colorare i peptidi in base alla deviazione standard relativa (unità di Da).
      2. Cerca visivamente nella mappa peptidi anomali con deviazione standard relativa elevata. Fare clic sui peptidi anomali nella mappa di copertura per popolare i grafici spettrali impilati (Figura 8B) e la finestra del visualizzatore di dati (Figura 8A) con il peptide di destinazione.
      3. Utilizzando il grafico spettrale impilato, controllare attentamente che tutti gli stati di carica e tutti i punti di tempo del peptide outlier abbiano assegnato in modo appropriato bastoncini.
        NOTA: Molto spesso, i peptidi con grandi deviazioni standard (>0.3 Da) hanno picchi isotopici che non sono stati assegnati in modo appropriato dai bastoncini dal software (come indicato nella figura 8B). L'assegnazione di eventuali bastoncini mancanti consentirà generalmente di ridurre la deviazione standard relativa di un peptide a <0,3 Da.
      4. Nascondere il peptide dall'elenco se la deviazione standard relativa non può essere ridotta a meno di 0,3 Da.
  2. Esportare i dati sulla differenza HDX tra due stati biochimici per la mappatura su un modello strutturale della proteina di interesse.
    1. Visualizzare la differenza di interesse nella mappa di copertura. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla mappa di copertura per esportare i dati delle differenze in .csv file. Esportare i dati sullo stato (.csv formato) passando a Dati | Esportare i dati sullo stato nella barra degli strumenti principale.
      NOTA: la formattazione appropriata dei dati delle differenze e dei file di dati sullo stato viene fornita in Informazioni di supporto.
    2. Importare i dati di differenza, i dati sullo stato e il file pdb della proteina di interesse in Deuteros28. Scegliere l'intervallo di confidenza del 99%, selezionare Abilita sommaed elaborare i dati.
      NOTA: MATLAB deve essere installato sul PC per eseguire Deuteros. Deuteros utilizzerà le misurazioni replicate nel set di dati per calcolare la deviazione standard dei dati di assorbimento per ogni peptide. Questa deviazione standard verrà utilizzata per definire l'intervallo di confidenza per uno scambio significativo, che verrà visualizzato sui grafici.
    3. In Opzioni PyMOL selezionare Esporta adozione | esportare per generare uno script Pymol per mappare regioni di significativa differenza di scambio sulla struttura pdb della proteina di interesse utilizzando il software PyMOL.
      NOTA: Utilizzando il flusso di lavoro descritto in questo protocollo, l'intervallo di confidenza del 99% per una differenza significativa di assorbimento del deuterio per un dato peptide in un singolo punto di tempo è in genere 0,3−0,5 Da. L'intervallo di confidenza del 99% per la differenza sommata su tutti i punti di tempo di scambio è in genere 0,7−1,0 Da.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

È necessario valutare la qualità della digestione proteolitica e la riproducibilità del flusso di lavoro per ogni serie di iniezioni di campioni. Pertanto, prima di eseguire test HDX-MS, è essenziale stabilire condizioni efficaci per la proteolisi della proteina di interesse, per la separazione dei peptidi utilizzando la cromatografia liquida in fase inversa e la mobilità ionica in fase gassosa e per il rilevamento di peptidi che utilizzano la SM. A tal fine, i campioni di riferimento per la proteina di interesse (raccol...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il flusso di lavoro HDX-MS presentato in questo protocollo fornisce una piattaforma straordinariamente robusta per mappare la distribuzione spaziale di elementi strutturalmente dinamici nelle proteine e per indagare come queste dinamiche cambiano in risposta alla perturbazione (legame del ligando, mutagenesi enzimatica, ecc.). L'HDX-MS presenta diversi vantaggi distinti rispetto ad altri approcci di biologia strutturale che sono comunemente usati per studiare la dinamica conformazionale. In particolare, sono necessarie s...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dal Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, dalla Canadian Foundation for Innovation e dai fondi di start-up della McGill University.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)BioBasicNA
0,5 mL Dispositivo di filtrazione centrifuga Amicon Ultracel 10k (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
acetonitrileFisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
acido formicoThermo Fisher28905
guanidina-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
Cloruro di magnesioSiGMA-Aldrich63068-250G
Cloruro dipotassioBioBasicPB0440
fosfato di potassioBioBasicPB0445
TCEP cloridratoTRC CanadaT012500peptide è stato sintetizzato su richiesta
Nome del materiale/ AttrezzaturaCompanyNumero di catalogoComments/Description
software
DeuterosAndy M C Lau, et alversione 1.08
DynamXWatersversione 3.0
MassLynxWatersversione 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersversione 3.0.3
PyMOLSchrö dingerversione 2.2.2
Nome del materiale/ AttrezzaturaAziendaNumero di catalogoComments/Description
Strumento e attrezzature
ACQUITY UPLC BEH C18 analitico ColonnaAcque 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-colonnaAcque186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX SystemWaters
HDX ManagerWaters microtip
Elettrodo pHThermo Fisher13-620-291
Waters Enzymate BEH colonna o Pepsina solumnWaters186007233
Waters Synapt Acque G2-Si

Riferimenti

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Dinamica conformazionale delle proteineInterazioni enzima substratoCromatografia liquida a ultra alte prestazioniAnalisi mediante spettrometria di massaMisurazione dell assorbimento di deuterioBiosintesi dei lantipeptidiCaratterizzazione strutturale delle proteine
Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.