L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.
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Articolo metodologico
Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ECLIA è un metodo versatile che è in grado di quantificare le quantità di proteine endogene e ricombinanti in un formato di 96 pozze. Per dimostrare l'efficienza dell'ECLIA, questo test è stato utilizzato per analizzare i livelli intrinseci di MeCP2 nel tessuto cerebrale del topo e l'assorbimento del TAT-MeCP2 nei fibroblasti dermici umani. Il MeCP2-ECLIA produce misurazioni altamente accurate e riproducibili con basso errore intra-e inter-ssay. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per la valutazione delle varianti proteiche MeCP2 che possono essere utilizzate in schermi ad alta velocità.
Introduzione
L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) si basa su un processo che utilizza etichette progettate per emettere luminescenza quando stimolata elettrochimicamente. Si tratta di una tecnica ampiamente applicabile per il rilevamento quantitativo di analiti biologici nell'industria di base e nella ricerca accademica, nell'industria alimentare e nella diagnostica clinica1. Comunemente, viene utilizzata una piastra usa e getta 96 pozze con elettrodi di inchiostro di carbonio. Questi elettrodi agiscono come un vettore solido per l'immunoassay. Un anticorpo secondario viene coniugato a un'etichetta elettrochemiluminescente e quando l'elettricità v....
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Protocollo
L'approvazione per l'approvvigionamento di biopsia cutanea a scopo di ricerca è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Ospedale pediatrico di Westmead, Australia. Il consenso per gli esperimenti sugli animali è stato ottenuto dal Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia, che sono stati effettuati in conformità con le normative locali sul benessere degli animali (G: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: il principio del sistema ECLIA è illustrato nella figura 1.
1. Selezione anticorpale
- Valutare il rapporto segnale-rumore per una....
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Risultati
Il principio del sistema ECLIA è descritto nella Figura 1. Le curve standard per due varianti MeCP2 sono mostrate nella Figura 2. La quantificazione accurata è stata possibile su un'ampia gamma di concentrazioni (1,800 ng/mL). Nella Figura 3,sono stati analizzati i livelli MeCP2 di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF. Espressione MeCP2 in lisati nucleari cerebrali da topi eterozici, wildtype e knockout sono stati confront.......
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Discussione
Per misurare i livelli endogeni MeCP2, ricombinanti MeCP2 e TAT-MeCP2, è stato sviluppato un ECLIA a 96 pozzetti. È stato dimostrato che la perdita della funzione della proteina MeCP2 porta alla sindrome RTT6, per la quale il trattamento è attualmente limitato alla gestione dei sintomi e alla terapia fisica. Un promettente viale di trattamento è la cosiddetta terapia sostitutiva delle proteine, dove i livelli di MeCP2 possono essere titolati fino alla loro concentrazione necessaria
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo molto grati alla dott.ssa Brigitte Sturm per il suo sostegno con lo strumento ECLIA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,4-Ditiotreitolo (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reagente di lisi ipotonica, Tampone di estrazione |
| Bio-Rad Protein Assay Reagente colorante concentrato | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Rilevamento della preparazione del campione |
| Diagnostica su scala Meso | marcata AB SULFO-TAG | R32AB-1 | |
| scoperta | 4.0 | ||
| DMEM (1X) | gibco di Life Technologies | 41966-029 | Preparazione del campione |
| Dulbecco' s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Preparazione del campione, soluzione di lavaggio, soluzione di rivestimento |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Tampone di estrazione |
| Fetale Siero bovino fetale | Sigma-Aldrich | F9665 | Preparazione del campione |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G2025 | Tampone |
| estrazione Gold Read Buffer T (1x) con tensioattivo | Meso Scale Diagnostica | R92TG | MeCP2 Protocollo ECLIA |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Reagente per lisi ipotonica, tampone di estrazione |
| KIMBLE Dounce set di macinatori di tessuti | Sigma-Aldrich | D8938 | Preparazione del campione |
| Agitatore di laboratorio, movimento oscillante (bassa velocità) | GFL | 3014 | MeCP2 Protocollo ECLIA |
| Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Reagente per lisi ipotonica, tampone di estrazione |
| MeCP2 (umano) Proteina ricombinante (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Trattamento cellulare |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | per sigillatura su piastra |
| Monoclonale Anti-MeCP2, prodotto nel topo, clone Mec-168, immunoglobulina purificata | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID: | AB_262075 Anticorpo, soluzione di rivestimento |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA Protocollo |
| Multi-Array a 96 pozzetti Piastra | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 Protocollo ECLIA |
| Penicillina-Streptomicina | gibco di Life Technologies | 15140122 | Preparazione del campione |
| Policlonale Anti-MeCP2, prodotto nel coniglio | Eurogentec S.A. | anticorpo | progettato su misura |
| Cloruro di potassio (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Reagente di lisi ipotonica |
| Primario AB Topo, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Anticorpo |
| AB primario di topo, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Anticorpo |
| primario AB Topo, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Anticorpo |
| primario AB Topo, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Anticorpo |
| AB primario di coniglio, anti-MeCP2 (D4F3) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 3456S; RRID:AB_2143849 | Cocktail |
| inibitori della proteasi anticorpale (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Reagente per lisi ipotonica, Tampone di estrazione |
| secondario AB, Coniglio, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | personalizzato Anticorpo | |
| AB, coniglio, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Anticorpo |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Tampone di estrazione |
| SULFO-TAG marcato Anticorpo anti-coniglio (capra) | Diagnostica su scala meso W0015528S | Anticorpo | |
| Produzione | proteina di fusione TAT-MeCP2 | Trattamento cellulare | |
| Tripsina EDTA 0,25% (1X) | gibco di Life Technologies | 25200-056 | Trattamento cellulare |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Soluzione di lavaggio |
Riferimenti
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
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Ristampe e permessi
