Gli astrociti piastrellano uniformemente la corteccia cerebrale, rendendo difficile l'analisi della loro complessa morfologia a livello cellulare. Il protocollo qui fornito utilizza l'etichettatura multicolore basata sull'elettroporazione in utero per singolo astrociti corticali e analizzarne il volume e la morfologia con una pipeline di analisi delle immagini intuitiva.
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Articolo metodologico
In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli astrociti protoplasmatici (PrA) situati nella corteccia cerebrale del topo sono strettamente giustapposti, formando una matrice tridimensionale apparentemente continua negli stadi adulti. Finora, nessuna strategia di immunosottenzione può distinguerli e segmentarne la morfologia negli animali maturi e nel corso della corticogenesi. I PrA corticali provengono da progenitori situati nel pallio dorsale e possono essere facilmente mirati usando in utero l'elettroporazione di vettori integrativi. Qui viene presentato un protocollo per etichettare queste cellule con la strategia MAGIC (Genome-Integrating Color) Markers multiindirittabile, che si basa sulla trasposizione piggyBac/Tol2 e sulla ricombinazione Cre/lox per esprimere stocasticamente proteine fluorescenti distinte (blu, ciano, giallo e rosso) indirizzate a specifici compartimenti subcellulari. Questa strategia di mappatura del destino multicolore consente di contrassegnare in situ i progenitori corticali vicini con combinazioni di marcatori di colore prima dell'inizio della gliogenesi e di tracciare i loro discendenti, compresi gli astrociti, dagli stadi embrionali a quelli adulti a livello di singola cellula. L'etichettatura semi-sparsa ottenuta regolando la concentrazione di vettori elettroporati e i contrasti di colore forniti dai marcatori di colore multiindirizzabili per l'integrazione del genoma (MAGIC Markers o MM) consentono di individualizzare gli astrociti e di distinguerne il territorio e la morfologia complessa nonostante la loro densa disposizione anatomica. Qui è presentato un flusso di lavoro sperimentale completo che include i dettagli della procedura di elettroporazione, l'acquisizione di stack di immagini multicanale tramite microscopia confocale e la segmentazione tridimensionale assistita da computer che consentirà allo sperimentatore di valutare il volume e la morfologia dei singoli PrA. In sintesi, l'elettroporazione dei marcatori MAGIC fornisce un metodo conveniente per etichettare individualmente numerosi astrociti e ottenere l'accesso alle loro caratteristiche anatomiche in diversi stadi di sviluppo. Questa tecnica sarà utile per analizzare le proprietà morfologiche degli astrociti corticali in vari modelli di topi senza ricorrere a croci complesse con linee di reporter transgeniche.
Introduzione
Gli astrociti svolgono numerose funzioni vitali nello sviluppo cerebrale e nella fisiologia1. Oltre al loro ruolo alla barriera ematico-encefalica dove regolano l'assorbimento dei nutrienti e il flusso sanguigno, contribuiscono attivamente alla formazione e alla funzione della sinapsi producendo neuromodulatori in grado di alterare l'attività e il comportamento neuronali2. Inoltre, la disfunzione degli astrociti contribuisce a una varietà di disturbineurologici 3. Gli astrociti situati nella corteccia cerebrale mostrano una morfologia elaborata che consente un ampio contatto con i processi neurona....
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Protocollo
Tutte le procedure relative agli animali qui descritte sono state eseguite in conformità con gli orientamenti istituzionali. I protocolli sugli animali sono stati approvati dal consiglio etico per la sperimentazione animale di Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Preparazione di plasmidi senza endotossina per marcatori MAGIC in elettroporazione utero
- Trasformazione batterica
- Sul ghiaccio, scongelare le cellule competenti DH5 alpha immagazzinate a -70 °C.
- Riscaldare le piastre di agar contenenti l'antibiotico appropriato (100 μg/mL di ampicillina o 50 μg/mL di kanamicina) a 37 °C.
- Aggiungere 1 μL di 5-50 ng....
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Risultati
L'elettroporazione dei marcatori MAGIC nei progenitori corticali embrionali consente l'etichettatura degli astrociti dalle prime alle ultime fasi dello sviluppo della corteccia cerebrale (Figura 1). Questi astrociti sono stati trovati in tutti gli strati corticali in vari stadi postnatali (P4, P7, P21) mentre si disperdevano ampiamente nell'intera corteccia cerebrale. Sono stati valutati con immagini confocali piastrellate acquisite con un obiettivo 20x 0.8 NA (o NA superiore) e assemblate c.......
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Discussione
In utero l'elettroporazione (IUE) dei marcatori MAGIC nei progenitori corticali(Figura 1)ha permesso l'etichettatura degli astrociti in tutta la corteccia cerebrale postnatale in diversi stadi postnatali (P4-P7-P21, Figura 2). È interessante notare che lo stadio dell'IUE non è critico, in quanto l'elettroporazione eseguita da E13.5 a E15.5 produce modelli di etichettatura simili per quanto riguarda gli astrociticorticali 14. Tuttavia, la .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo S. Fouquet e le strutture per l'imaging e il nucleo animale dell'Institut de la Vision e dell'Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI e RAM) per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio della Région Ile-de-France e della Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer a S.C e dall'Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) a Los Angeles, finanziando il Consiglio europeo della ricerca (ERC-SG 336331, PI J. Valette) a E.H., da Agence Nationale de la Recherche con contratti ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , di Fondation....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1.1 Trasformazione batterica | |||
| Ampicillina | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alfa cellule competenti | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ghiacciaia | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Capsula di Petri sterile - 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Bagnomaria | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Coltura plasmidica | |||
| 14 ml provetta per coltura | Dutscher | 187262 | |
| Vetro erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Preparazione del DNA plasmidico | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparazione delle soluzioni | |||
| 26 G x 1/2 ago | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 ago | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Siringa monouso in polipropilene, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparazione del materiale chirurgico | |||
| Adson Pinze - Modello DeBakey - 12,5 cm | FST | 11617-12 | |
| Pinze a punta arcuata - 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Sterilizzatore a perle di vetro Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Micropipetta in vetro 1 mm diametro | FHC | 10-10-L | |
| Pinza Graefe - Titanio 1 mm Punte Leggera Curva- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Pinza Graefe - Titanio 1 mm Punte Dritte- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Forbici per iride - Delicate Dritte - 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Nastro da laboratorio | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microiniettore | INJECT+MATIC | Nessun numero | |
| Olsen-Hegar Porta aghi - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Fibra ottica | VWR | 631-1806 | |
| Carta bianca plastificata | 700103 | Gel | |
| elettrodi Signagel | Free-Med | 15-60 | |
| Piastra di Petri sterile - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizzatore, perlina di vetro secco, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparazione della topolina incinta | |||
| Tampone imbevuto di alcol | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Impacco | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamina | Merial | Imalgene 1000 | |
| Gel oculare | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS topi | Janvier Labs | ||
| Vetadine, soluzione al 10% | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Cuscinetto riscaldante | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xilazina | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Elettroporazione | |||
| Sutura assorbibile Misura 4-0 45 cm Sutura 1 ago 19 mm Lunghezza 3/8 di cerchio | Novosyn | inverso C0068220 | |
| Elettroporatore Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Pipette di trasferimento sterili (confezionate singolarmente) | Dutscher | 043202S | |
| Pinzetta con elettrodi a disco in platino da 3 mm | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Prelievo e sezionamento di tessuti | |||
| piastra a 24 pozzetti | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Vetrino coprioggetti | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), senza calcio, senza magnesio | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Smalto per unghie | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratomo | Leica | VT1000S | |
| 5. Imaging confocale multicanale | |||
| 20X olio NA 0,85 | confocale Olympus | ||
| Carl Zeiss | LSM880 | ||
| Microscopio a scansione laser confocale | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0,8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Segmentazione del volume territoriale degli astrociti | |||
| IMARIS 8.3 e versioni successive | Bitplane | ||
| 7. Tracciamento dell'arborizzazione degli astrociti | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
Riferimenti
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
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Ristampe e permessi
