Descritto è un protocollo per eseguire il trapianto intratracheale di cellule stromali mesenchymale (MSC) attraverso l'iniezione intratracheale in ratti neonatici. Questa tecnica è un'opzione clinicamente praticabile per la somministrazione di cellule staminali e farmaci nei polmoni di ratto neoatale per valutarne l'efficacia.
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Articolo metodologico
Instillazione intratracheale delle cellule staminali nei " ratti neooatali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD). Nei neonati prematuri, la BPD è una complicazione importante nonostante l'uso precoce della terapia surfactant, le strategie di ventilazione ottimali e la ventilazione a pressione positiva non invasiva. Poiché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella patogenesi della BPD, l'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenirlo. Tuttavia, il trattamento corticosteroide sistemico non è solitamente raccomandato per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine. Studi preclinici e studi clinici di fase io hanno dimostrato che l'uso di cellule stromali mesenchymale (MSC) in lesioni polmonari indotte da iperossia e nei neonati pretermine è sicuro e fattibile. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e il trattamento combinato di surfactant e glucocorticoide è emerso come una nuova strategia per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Lo stadio di sviluppo dei polmoni di ratto alla nascita è equivalente a quello dei polmoni umani a 26-28 settimane di gestazione. Quindi, i ratti appena nati sono appropriati per studiare la somministrazione intratracheale ai neonati pretermine con difficoltà respiratorie per valutarne l'efficacia. Questa tecnica di instillazione intratracheale è un'opzione clinicamente praticabile per la consegna di cellule staminali e farmaci nei polmoni.
Introduzione
L'ossigeno supplementare è spesso necessario per trattare i neonati con difficoltà respiratorie1. Tuttavia, la terapia iperossia nei neonati ha effetti negativi a lungo termine. L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD)2. La BPD è una delle principali complicanze del trattamento con iperossia che può verificarsi nonostante la terapia precoce, le procedure di ventilazione ottimali e l'aumento dell'uso della ventilazione a pressione positiva non invasiva nei neonati prematuri. Mentre molte strategie di trattamento sono state segnalate per BPD3, nessuna terapia nota può ridurre questa complicazione.
L'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenire la BPD, perché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella sua patogenesi. Tuttavia, la terapia sistemica corticosteroide non è solitamente raccomandata per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine4,5.
Le cellule stromali mesenchymal (MSC) hanno caratteristiche pluripotenti e possono differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui osso, cartilagine, tessuto adiposo, muscolo e tendini6. Le MSC hanno effetti immunomodulatori, antinfiammatori e rigenerativi7, e gli studi sugli animali mostrano i benefici terapeutici delle MSC e dei loro componenti secreti in lesioni polmonari indotte da iperossia nei roditori8,9. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e la terapia combinata di surfactant e corticosteroidi potrebbero essere una potenziale strategia di trattamento per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Studi preclinici hanno utilizzato la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e del virus adeno-associato nei ratti neonati10,11,12. Tuttavia, non è disponibile una presentazione passo-passo della tecnica e il monitoraggio in vivo delle cellule staminali trapiantate. Il ratto appena nato è adatto per studiare gli effetti della somministrazione intratracheale sui neonati con difficoltà respiratorie perché lo stadio saccolare del polmone del ratto alla nascita è equivalente a quello del polmone umano a 26-28 settimane di gestazione13. Un metodo efficace per la somministrazione nella trachea del ratto è fondamentale per una distribuzione polmonare di successo. La tecnica qui presentata consente lo studio della somministrazione intratracheale di cellule e/o farmaci per il trattamento di malattie polmonari neomotorie utilizzando ratti come modello per gli esseri umani.
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Protocollo
Questa procedura è stata approvata dal comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Taipei.
NOTA: le MSC umane sono state equamente trascate da proteine fluorescenti verdi (GFP) e geni di luciferasi delle lucciole (Fluc) ottenuti da un'azienda commerciale (Tabella dei materiali).
1. Caratterizzazione di MSC umani con luciferasi della lucciola e proteina fluorescente verde
- Mantenere le MSC umane trascate con GFP e Fluc in supporti completi (modifica minima essenziale dell'aquila-alfa media-alfa,, completata con 10-15% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamine, 1 ng/mL base FGF e PSF) a 37 gradi centigradi con umidità satura e 5% di CO2. Passare le celle a confluenza di 70-90 %.
- Osservare le MSC in un microscopio a contrasto di fase di fluorescenza (Figura 1A) e analizzare i livelli di espressione di Fluc e GFP14.
- Caratterizzare gli MSC analizzando l'espressione dei marcatori CD, tra cui CD44, CD73, CD90, CD105 utilizzando la citometria di flusso (Figura 1B). Indurre la differenziazione della trilina delle cellule staminali a adipociti, condrociti e osteociti, e confermare la differenziazione del trilineage (Figura 1C) di von Kossa, oltra tolmo rosso o Alcian colorazione a seguito di un protocollo commerciale15,16.
2. Anestesizzazione dei cuccioli di ratto
- Consentire ai ratti Sprague-Dawley incinte datati nel tempo di consegnare vaginalmente a termine.
- Togliere i cuccioli di topo dalla gabbia il giorno postnatale 5.
- Anestesizzare i cuccioli di ratto utilizzando l'anestesia del gas (cioè il 2% di isoflurane) in una camera di anestesia.
- Confermare l'anestesia adeguata controllando la respirazione e i riflessi.
NOTA: La respirazione dovrebbe diventare superficiale e i riflessi dovrebbero diminuire. I cuccioli di ratto rimangono incoscienti per almeno 10 dollari con questa concentrazione di isoflurane.
3. Instillazione intratracheale
- Una volta anestesizzati, trattenete i cuccioli di ratto su un supporto di intubazione inclinati a 60 gradi e tenete i cuccioli in posizione con del nastro di etichettatura di laboratorio su tutti e quattro gli arti.
- Applicare il nastro sotto il naso per fissare la testa e individuare il collo per la tracheotomia di foratura.
- Disinfettare l'area di incisione (cioè il collo) con un cuscinetto di preparazione alcolica del 75%.
- Fare un'incisione collo verticale di 0,3 cm sopra la trachea con microscissors per evitare di danneggiare le arterie carotidee.
- Dissezionare gli strati di grasso e muscoli per individuare la trachea con una pinzetta affitta a punta curva senza gancio.
- Tenere la trachea con le pinzette affido punta curva.
- Tenere una siringa di 100 l e iniettare lentamente 30 l di normale salina (cioè, controllo) o 30 L di MSC fluc-GFP etichettati (1 x 105 celle) nella trachea attraverso una siringa ad ago da 30 G durante la fase di inspir.
- Chiudere l'incisione con un punto di seta 6-0, legare il nodo il più piccolo possibile e tagliare le estremità il più corto possibile.
- Posizionare i ratti sotto la luce infrarossa o su una piastra di riscaldamento per tenere al caldo e consentire loro di recuperare dall'anestesia.
- Verificare che i ratti siano caldi, rosa e in grado di movimento spontaneo prima di restituire i ratti alla gabbia.
4. Monitoraggio della distribuzione polmonare delle MSC
- Per monitorare le MSC umane trapiantate, iniettare intraperitonenamente i ratti con sale di potassio luciferina in fosfato tamponato salina (PBS) ad una dose di 125 mg/kg di peso corporeo 15 min dopo l'iniezione MSC.
- Anestesizzare i ratti utilizzando 2% isoflurane attraverso i coni nasali.
- Acquisire immagini sequenziali a intervalli di 5-15 s 10 min dopo la somministrazione di luciferina con binning medio, 1 f/stop e un campo visivo di 26 cm utilizzando un sistema di imaging di piccoli animali (Tabella dei materiali).
- Quantificare l'attività di luminescenza dai polmoni in base alle regioni automatiche di interesse utilizzando il software di imaging (Tabella dei materiali)17.
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Risultati
La distribuzione polmonare dell'instillazione intratracheale delle cellule staminali nei ratti neo-neoanati è stata determinata dalle cellule staminali con etichettatura della lucciola luciferasi (Fluc). Le MSC sono state etichettate con Fluc e etichettate con proteine fluorescenti verdi attraverso la trasduzione lentivirale. La figura 1A mostra un alto livello di espressione GFP nelle MSC umane e il 93,7% della popolazione ha mostrato che l'espressione positiva di GFP rilevata dalla citomet...
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Discussione
I neonati con difficoltà respiratorie richiedono comunemente un surfactant intratracheale e/o trattamento corticosteroide19. Gli studi clinici sulla fase i umana hanno dimostrato la sicurezza delle comunicazioni e le comunicazioni amoanzi intratracheali nei neonati pretermine8. Questi studi suggeriscono che la somministrazione intratracheale dei farmaci è un'opzione importante per i neonati con difficoltà respiratorie. Gli studi sui modelli animali s...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato in parte sostenuto da una sovvenzione di Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Kit di analisi hMSC Stemflow | BD Biosciences | 562245 | marcatori CD |
| CMV-Luciferasi-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivettore per imaging in vivo | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| MSC umane | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Luce infrarossa | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurano | Alocarbonio | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 sistema di imaging per piccoli animali | Calibro LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin sale di potassio | Promega, Madison, WI | ||
| Microforbici, dritta | Vannas | H4240 | |
| Soluzione salina normale | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Soluzione isotonica di cloruro di sodio |
| Ago RN per mozzo piccolo, calibro 30 | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Siringa (100 &; l) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
Riferimenti
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