Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Summary

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Abstract

L'identificazione di specifiche interazioni proteina-DNA sul genoma è importante per comprendere la regolazione genica. L'immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è ampiamente utilizzata per identificare le posizioni di legame a livello genomico delle proteine leganti il DNA. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dalla sua eterogeneità nella lunghezza dei frammenti di DNA sonicato e del DNA di fondo non specifico, con conseguente bassa risoluzione di mappatura e incertezza nei siti di legame con il DNA. Per superare questi limiti, la combinazione di ChIP con digestione esonucleasi (ChIP-exo) utilizza la digestione delle esonucleasi da 5' a 3' per tagliare il DNA immunoprecipitato di dimensioni eterogenee al sito di reticolamento proteina-DNA. Il trattamento con esonucleasi elimina anche il DNA di fondo non specifico. Il DNA preparato dalla libreria e digerito con esonucleasi può essere inviato per il sequenziamento ad alta produttività. Il metodo ChIP-exo consente una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi con una maggiore sensibilità di rilevamento e un segnale di fondo ridotto. Di seguito è descritto un protocollo ChIP-exo ottimizzato per le cellule di mammifero e il sequenziamento di nuova generazione.

Introduction

Le posizioni delle interazioni proteina-DNA forniscono informazioni sui meccanismi di regolazione genica. L'immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è stata utilizzata per un decennio per esaminare le interazioni proteina-DNA a livello genomico nelle^{cellule viventi 1,2}. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dall'eterogeneità nella frammentazione del DNA e dalla contaminazione del DNA non legato che porta a bassa risoluzione di mappatura, falsi positivi, chiamate perse e segnale di fondo non specifico. La combinazione di ChIP con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) migliora il metodo ChIP-seq tagliando il DNA ChIP ai punti di collegamento incrociato proteina-DNA, fornendo una risoluzione vicina alla coppia di basi e un basso segnale di fondo^3,4,5. La risoluzione di mappatura notevolmente migliorata e il basso background fornito da ChIP-exo consentono di determinare posizioni di legame proteina-DNA accurate e complete in tutto il genoma. ChIP-exo è in grado di rivelare motivi di legame del DNA funzionalmente distinti, interazioni cooperative tra fattori di trascrizione (TF) e più siti di collegamento incrociato proteina-DNA in una certa posizione di legame genomico, non rilevabili da altri metodi di mappatura^{genomica 3,4,6,7}.

ChIP-exo è stato inizialmente utilizzato nel lievito in erba per esaminare il legame dna specifico della sequenza dei TF, per studiare l'organizzazione precisa del complesso di pre-iniziazione della trascrizione e la struttura sub-nucleosomica dei singoli istoni^{attraverso il genoma 4,8,9}. Dalla sua introduzione nel 2011⁴, ChIP-exo è stato utilizzato con successo in molti altri organismi tra cui batteri, topi e cellule umane^{7,10,11,12,13,14,15,16,17}. ^Nel 2016, Rhee et al. Questo studio ha dimostrato che in assenza di Lhx3, Isl1 viene reclutato in nuovi esaltatori neuronali legati da Onecut1 TF per mantenere l'espressione genica dei geni dell'effettore neuronale. In questo studio, ChIP-exo ha rivelato come più TF riconoscano dinamicamente il tipo di cellula e gli elementi regolatori del DNA specifici dello stadio cellulare in modo combinatorio a una risoluzione di mappatura quasi nucleotidica. Altri studi hanno anche usato il metodo ChIP-exo per comprendere l'interazione tra proteine e DNA in altre linee cellulari di mammiferi. Han et al.^{7 usò} chip-exo per esaminare l'organizzazione a livello genomico dei TF GATA1 e TAL1 nelle cellule erythroid del topo usando chIP-exo. Questo studio ha scoperto che tal1 viene reclutato direttamente nel DNA piuttosto che indirettamente attraverso interazioni proteina-proteina con GATA1 durante la differenziazione erythroid. Studi recenti hanno anche utilizzato ChIP-exo per profilare le posizioni di legame a livello genomico di CTCF, RNA Polimerasi II e segni istonografici per studiare i meccanismi epigenomici e trascrizionale nelle linee^{cellulari umane 18,19}.

Esistono diverse versioni del protocollo ChIP-exo disponibili^3,5,20. Tuttavia, questi protocolli ChIP-exo sono difficili da seguire per le ricerche che non hanno familiarità con la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione. Un'eccellente versione del protocollo ChIP-exo è stata pubblicata con istruzioni facili da seguire e un video²¹, ma conteneva molti passaggi enzimatici che richiedono una notevole quantità di tempo per il completamento. Qui si segnala una nuova versione del protocollo ChIP-exo contenente passaggi enzimatici ridotti e tempi di incubazione e spiegazioni per ogni fase enzimatica²¹. Le reazioni di riparazione finale e di coda dA sono combinate in un unico passaggio utilizzando l'enzima di preparazione finale. I tempi di incubazione per i passaggi di lisciviazione dell'indice e dell'adattatore universale sono ridotti da 2 h a 15 minuti utilizzando un esaltatore di legatura. La reazione della chinasi dopo il passaggio di legatura della scheda di indice descritto nel precedente protocollo ChIP-exo è stata rimossa. Al contrario, durante la sintesi del DNA dell'oligo viene aggiunto un gruppo fosfato a una delle 5' estremità dell'adattatore indice (Tabella 1), che verrà utilizzato per la fase di digestione dell'esonucleasi lambda. Mentre il precedente protocollo ChIP-exo utilizzava la digestione dell'esonucleasi RecJ_f per eliminare i contaminanti di DNA a singolo filamento, questo passaggio di digestione viene rimosso qui perché non è fondamentale per la qualità della libreria ChIP-exo. Inoltre, per purificare il DNA inverso incrociato dopo l'eluizione del ChIP, viene utilizzato un metodo di purificazione magnetica delle perline al posto del metodo di estrazione fenolo:cloroformio:alcol isoamile (PCIA). Ciò riduce i tempi di incubazione dell'estrazione del DNA. È importante sottolineare che rimuove la maggior parte dei dimeri della scheda formati durante la legatura della scheda di indicizzazione, il che può influire sull'efficienza della PCR mediata dalla legatura.

Il protocollo ChIP-exo qui presentato è ottimizzato per il rilevamento di precise interazioni proteina-DNA nei neuroni dei mammiferi differenziati dalle cellule staminali embrionali del topo (ES). In breve, le cellule neuronali raccolte e incrociate vengono lese, per consentire alla cromatina di essere esposta alla sonicazione, quindi sonicate in modo da ottenere frammenti di DNA di dimensioni appropriata (Figura 1). Le perline rivestite di anticorpi vengono quindi utilizzate per immunoprecipitato selettivamente la cromatina frammentata e solubile alla proteina di interesse. Mentre il DNA immunoprecipitato è ancora sulle perline, vengono eseguite la riparazione finale, la legatura degli adattatori di sequenziamento, la reazione di riempimento e le fasi di digestione delle esonucleasi lambda da 5' a 3 '. La fase di digestione dell'esonucleasi è ciò che conferisce a ChIP-exo la sua altissima risoluzione e l'elevato rapporto segnale-rumore. L'esonucleasi lambda taglia il DNA immunoprecipitato alcune coppie di basi (bp) dal sito di reticolamento, causando così la degradazione del DNA contaminante. Il DNA ChIP trattato con esonucleasi viene eluita dalle perline rivestite di anticorpi, i collegamenti incrociati proteina-DNA sono invertiti e le proteine sono degradate. Il DNA viene estratto e denaturato in DNA ChIP a singolo filamento, seguito dalla ricottura del primer e dall'estensione per realizzare DNA a doppio filamento (dsDNA). Successivamente, viene eseguita la legatura di un adattatore universale alle estremità trattate con esonucleasi. Il DNA risultante viene purificato, quindi amplificato pcr, purificato in gel e sottoposto a sequenziamento di nuova generazione.

Il protocollo ChIP-exo è più lungo del protocollo ChIP-seq, ma non è molto impegnativo dal punto di vista tecnico. Qualsiasi DNA ChIP immunoprecipitato con successo può essere sottoposto a ChIP-exo, con diversi passaggi enzimatici aggiuntivi. I notevoli vantaggi del ChIP-exo, come la risoluzione di mappatura ultra-alta, un segnale di fondo ridotto e la diminuzione di falsi positivi e negativi, per quanto riguarda i siti di legame genomico, superano il costo del tempo.

Protocol

NOTA: L'acqua distillata autoclavata e deionizzata (ddH₂O) è raccomandata per la produzione di tamponi e miscele di master di reazione. Le sezioni 1−4 descrivono la lisi cellulare e la sonicazione, le sezioni 5−7 descrivono l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), le sezioni 8−11 descrivono le reazioni enzimatiche sulle perline, le sezioni 12 e 13 descrivono l'eluizione del ChIP e la purificazione del DNA, e le sezioni 14−19 descrivono la preparazione della biblioteca.

1. Cellule di raccolta e collegamento incrociato

1. Dopo aver differenziato le cellule ES del topo in neuroni postmitotici, aggiungere l'11% di formaldeide alle cellule raccolte a una concentrazione finale dell'1% (v/v). Celle rocciose su una piattaforma a dondolo (rocker, shaker o rotatore) per 15 minuti, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   NOTA: A seconda della proteina bersaglio da reticolare, meno formaldeide reticolare (ad esempio, una concentrazione finale dello 0,5%) o si può usare il doppio reticello con glutarato disuccinidile (DSG).
2. Aggiungere 2,5 M di glicina a una concentrazione finale di 150 mM per interrompere la reazione di retiatura. Celle rocciose su una piattaforma a dondolo a RT, per 5 minuti.
3. Centrifugare le celle reticolate in tubi conici da 15 ml a RT, per 6 minuti, a 1.350 x g. Aspirare la soluzione, quindi rimosombidire le cellule in 5 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: I pellet a celle retigliate possono essere conservati a -80 °C dopo il congelamento flash con azoto liquido.

2. Llisi cellulare

NOTA: I seguenti passaggi di questo protocollo sono per circa 2 x 10^{7 cellule} neuronali differenziate dalle cellule ES del mouse. Per rompere le cellule aperte, verranno utilizzati tamponi di lisi contenenti vari detergenti. Aggiungere 50 μL di 1000x stock completo di inibitore della proteasi (CPI) a 50 mL di tampone appena prima dell'uso.

1. Preparare i buffer di lisi 1−3 come descritto nella tabella 2.
2. Scongelare pellet di cellule reticolate sul ghiaccio, quindi rimescolare accuratamente i pellet di cellule in 3 ml di tampone di lisi 1 in tubi conici da 15 ml. Roccia a 4 °C per 15 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifuga a 1.350 x g per 5 min a 4 °C e aspira il supernatante.
3. Rimescolare accuratamente le cellule pellettate in 3 mL di tampone di lysis 2. Roccia a 4 °C per 10 minuti su una piattaforma a dondolo. Centrifuga a 1.350 x g per 5 min a 4 °C e aspira il supernatante.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 3 ad ogni pellet, quindi tenere sul ghiaccio. Procedere immediatamente alla sonicazione.

3. Cromatina sonicante

NOTA: Conservare i campioni sul ghiaccio o a 4 °C durante questa procedura di sonicazione per ridurre l'inversione del collegamento incrociato.

1. Utilizzando una spatola sterile, aggiungere perline di sonicazione (Table of Materials) fino al segno di graduazione di 0,2 ml su tubi di polistirolo da 15 ml. Lavare le perline di sonicazione vortice in 600 μL di 1x PBS fino a quando non sono visibili macchie secche. Centrifugare i tubi per 5 s a 30 x g e aspirare 1x PBS.
   NOTA: La sonicazione nei tubi in polistirolo è più efficiente della sonicazione nei tubi in polipropilene. Se un numero minore di celle (ad esempio, <10^{6 celle)} è sonicato, utilizzare tubi in polistirolo da 1,5 ml senza aggiungere perline di sonicazione.
2. Sospensire accuratamente i lisati nucleari in 1 ml di tampone di lisi 3 (dal passaggio 2.4), quindi trasferire ai tubi di polistirolo da 15 ml contenenti perline di sonicazione. Vortice brevemente i tubi in polistirolo.
3. Per frammentare il DNA della cromatina reticolta, il sonicato nucleare si lega a 4 °C per un numero ottimizzato di cicli, con ampiezza di potenza a 30 W e cicli di sonicazione impostati su 30 s on / 30 s off.
   NOTA: L'ottimizzazione della sonicazione per ogni tipo di cella e lotto comporterà la migliore resa ChIP-exo. Per 2 x 10^{7 cellule} neuronali del topo, 20−30 cicli di sonicazione alle impostazioni menzionate frammenteranno la cromatina nell'intervallo di 100−500 bp.
4. Al termine della sonicazione, trasferire tutti i supernatanti (lysate sonicati), da ciascun campione, a tubi da 1,5 ml. Aggiungere il 10% di 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo) a ciascun campione ad una concentrazione finale dell'1%. Mescolare mediante pipettazione.
5. Per pellet cell debris, centrifugare campioni a 13.500 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire tutti i lysati sonicati (supernatanti) da ciascun campione a nuovi tubi da 1,5 ml.
6. Prendere 30 μL di lysate sonicato da ciascun campione (~3% di lysate sonicato) e aggiungere a nuovi tubi da 1,5 ml per controllare la sonicazione. Conservare i listati sonicati rimanenti a 4 °C fino a quando non sono pronti per l'incubazione con perline rivestite di anticorpi.

4. Controllo della sonicazione

1. Fare 20 mL di 2x proteinasi K tampone aggiungendo 2 mL di 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mL di 0,5 M EDTA, 10 mL di 10% sodio dodecil solfato (SDS) e 6 mL di ddH_{autoclavato 2}O. Non aggiungere CPI a questo buffer. Conservare in tubo da 50 mL presso RT.
2. Per invertire il crosslink proteina-DNA, rimuovendo le proteine, prendere i 30 μL di cromatina sonicata da ogni campione (dal passaggio 3.6), aggiungere 166 μL di ddH₂O autoclavato, 200 μL di tampone 2x proteinasi K e 4 μL di 20 mg/mL proteinasi K. Vortice breve dei campioni, quindi incubare a 65 °C per 1−3 h a 24 x g.
3. NOTA: I lisce sonicati possono essere invertite a 65 °C durante la notte.
4. Estrarre il DNA utilizzando PCIA (25:24:1) e metodo di precipitazione dell'etanolo come segue.
   ATTENZIONE: la PCIA è tossica. Utilizzare sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale standard (DPI).
   1. Aggiungere 400 μL di PCIA a ciascun campione in tubi da 1,5 ml, impostare il vortice alla velocità massima e campioni di vortice per 20 s. Centrifuga a 18.400 x g per 6 min a RT. Si osserveranno due fasi. Trasferire con cura lo strato acquoso superiore (fase chiara) di ciascun campione in nuovi tubi da 1,5 ml.
   2. Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di RNasi A. Incubare campioni a 37 °C per 30 min.
   3. Aggiungere 1 μL di glicogeno da 20 mg/mL a ciascun campione, quindi precipitare con 1 mL di etanolo ghiacciato al 100% (conservato in un congelatore a -20 °C). Mescolare brevemente, quindi incubare i campioni nel congelatore a -80 °C per 30 min a 1 h. Centrifugare i campioni a 18.400 x g per 10 min a 4 °C e versare con cura 100% etanolo.
   4. Lavare pellet con 500 μL di ghiaccio freddo al 70% di etanolo (conservato in un congelatore a -20 °C). Centrifuga a 18.400 x g per 5 min a 4 °C. Versare con cura il 70% di etanolo.
   5. Incubare campioni in tubi da 1,5 ml a 50 °C fino a evaporare l'etanolo rimanente. Resuspend pellet di DNA in 15 μL di ddH₂O autoclavato o ddH₂O privo di nucleasi.
   6. Eseguire i campioni di DNA estratti, insieme a una scala del DNA, in un gel di agarosio all'1,5% a 120−180 V e controllare le dimensioni del DNA sonicato.

5. Incubazione di anticorpi con perline

NOTA: I seguenti passaggi di questo protocollo sono per circa 2 x 10^{7 cellule} neuronali differenziate dalle cellule ES del mouse. Non congelare e scongelare le perline magnetiche in nessun momento durante il protocollo ChIP-exo in quanto le perline possono rompersi causando la contaminazione del campione o le prestazioni dell'anticorpo possono essere compromesse.

1. Dopo la lisi cellulare e la sonicazione, preparare le perline magnetiche Protein G (Table of Materials) per il ChIP, mescolare le perline magnetiche fino ad omogeneo, quindi aggiungere 25 μL di perline magnetiche a tubi a bassa legatura proteica da 2 ml.
   NOTA: Il tipo di perline magnetiche utilizzate dipenderà dalla specie degli anticorpi.
2. Lavare le perline con 1 mL di soluzione di blocco(tabella 2),mescolare bene, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto. Mentre sei ancora su un rack magnetico, rimuovi il supernatante una volta che è chiaro.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione di blocco alle perline magnetiche. Tubi di roccia per 10 minuti a 4 °C su una piattaforma a dondolo. Ruotare brevemente, quindi posizionare i tubi su un rack magnetico e rimuovere il supernatante.
4. Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte.
5. Aggiungere 500 μL di soluzione di blocco alle perline magnetiche. Ruotare brevemente l'anticorpo contro l'Isl1 (0,04 μg/μL, Tabella dei Materiali),quindi aggiungere 4 μg di anticorpo ai corrispondenti tubi a basso legame proteico da 2 ml contenenti le perline magnetiche in soluzione di blocco.
6. Ripetere il passaggio 5.5 senza anticorpi (cioè, il controllo senza anticorpi per chIP).
   NOTA: La quantità di anticorpi da aggiungere può essere determinata empiricamente considerando la qualità dell'anticorpo e il numero di cellule utilizzate per il ChIP.
7. Campioni di roccia a 4 °C per 6−24 h su una piattaforma a dondolo.

6. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

1. Lavare le perle rivestite con anticorpi dal passo 5.8 con 1 mL di soluzione di blocco. Posizionare i campioni su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Rimuovere il supernatante.
2. Ripetere il passaggio 6.1 altre due volte.
3. Resuspend perline rivestite con anticorpi in 50 μL di soluzione di blocco, quindi trasferire a nuovi tubi a basso legame proteico da 2 ml. Per ogni campione di ChIP, aggiungere lisati sonicati (~1,0 mL dal passo 3.6) alle perline rivestite di anticorpi in tubi a bassa legante proteica da 2 ml.
4. Incubare ogni campione su una piattaforma a dondolo durante la notte a 4 °C.

7. Lavaggi ChIP

NOTA: Conservare i campioni sul ghiaccio o a 4 °C per mantenere il retille proteina-DNA durante i lavaggi ChIP.

1. Rendere elevato il tampone di lavaggio del sale, il tampone di lavaggio LiCl e il tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7.4) come descritto nella tabella 3. Conservare in tubi da 50 mL a 4 °C. Aggiungere 50 μL di 1000x stock CPI a tutti i buffer appena prima dell'uso.
2. Ruotare brevemente i campioni in tubi a bassa legatura proteica da 2 ml per raccogliere il liquido dai tappi, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere con cura il supernatante con una pipetta.
3. Per i lavaggi ChIP, aggiungere 1 ml di tampone di lysis 3 (a 4 °C) a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
4. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio a sale alto freddo ad ogni tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
5. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio LiCl freddo a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
6. Aggiungere 1 ml di tampone tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) a ciascun tubo. Mescolare su una piattaforma a dondolo a 4 °C per 5 minuti. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.
   NOTA: è possibile utilizzare il buffer Tris-EDTA (pH 8.0) al posto del buffer Tris-HCl (pH 7.4).
7. Ripetere i passaggi 7.4−7.6 tre volte.
8. Trasferire le perline campione con 500 μL di tampone Tris-HCl (pH 7.4) in tubi freschi da 1,5 ml. Ruotare brevemente i campioni, quindi posizionare su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il supernatante con una pipetta.

8. Terminare la riparazione e la reazione di coda dA sulle perline

NOTA: La sonicazione spesso genera dsDNA non smussato. È necessaria una reazione di riparazione finale per creare DNA contundente prima della reazione di coda dA seguita dalla fase di legatura dell'adattatore di indice. Per la legatura del DNA finale appiccicoso con DNA dell'adattatore indice, il dATP viene aggiunto all'estremità 3 ' di un frammento di dsDNA smussato dalla reazione di coda dA. La miscela di reazione di preparazione finale contiene dATP.

1. Dopo i lavaggi ChIP, aggiungere 38 μL di ddH₂O autoclavato alle perline campione in tubi da 1,5 ml per la riparazione finale e la reazione di coda dA.
2. Aggiungere 5,6 μL di miscela di reazione di preparazione finale e 2,4 μL di miscela enzimatica di preparazione finale(tabella dei materiali)a ciascun campione (volume totale di reazione: 46 μL). Incubare campioni a 20 °C per 30 min.
3. Lavare le perline come descritto nei precedenti passaggi di lavaggio ChIP 7.4−7.6.

9. Indicizzazione dell'adattatore sulle perline

NOTA: L'adattatore indice ha 6−10 basi di sequenze di indici codificati a barre, che sono specifiche di un dato campione utilizzato per multiplexare più campioni nel sequenziamento ad alta velocità effettiva. Le sequenze di DNA dell'adattatore indice sono descritte nella tabella 1.

1. Per la legatura dell'adattatore di indice, aggiungere 27 μL di tampone Tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) alle perline campione. Aggiungere 2 μL di adattatore indice da 15 μM, 0,5 μL di esaltatore di legatura e 15 μL di mix principale di ligasi (tabella deimateriali)a ciascun campione (volume totale di reazione: 44,5 μL).
2. Incubare campioni a 20 °C per 15 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.

10. Reazione di riempimento sulle perline

NOTA: Dopo la legatura dell'adattatore, non esiste un legame fosfodiestere tra l'estremità 5' dell'adattatore e l'estremità 3' del DNA ChIP. Il nick può essere riparato da una reazione di riempimento.

1. Aggiungere 47 μL di tampone tris-HCl freddo da 10 mM (pH 7,4) alle perline del campione.
2. Rendere la miscela di reazione di riempimento(tabella 4 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
3. Aggiungere 11,1 μL di miscela di riempimento a ciascun campione (volume totale di reazione: 58,1 μL). Incubare campioni a 30 °C per 20 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.

11. Lambda esonucleasi digestione su perline

1. Dopo la reazione di riempimento sulle perline, aggiungere 50 μL di ddH₂O autoclavato freddo alle perline campione.
2. Per digerire il DNA del ChIP nella direzione da 5' a 3', aggiungere 6 μL di tampone di esonucleasi lambda 10x e 2 μL di 5 U/μL lambda esonucleasi(tabelladei materiali , volume totale di reazione: 58 μL). Incubare campioni a 37 °C per 30 minuti. Lavare le perline come descritto nei passaggi 7.4−7.6.

12. Eluizione e retittatura inversa

1. Creare un buffer di eluizione ChIP come descritto nella tabella 5.
   NOTA: non aggiungere CPI al buffer di eluizione ChIP.
2. Per eluire campioni di ChIP dalle perline, resuspend campioni in 75 μL di tampone di eluizione ChIP e incubare a 65 °C per 15 min a 130 x g.
3. Aggiungere 2,5 μL di 20 mg/mL di proteinasi K(Tabella dei materiali)ai campioni. Brevemente vortice, quindi incubare i campioni durante la notte a 65 °C.

13. Estrazione del DNA

1. Dopo che i campioni hanno incubato durante la notte a 65 °C, ruotare brevemente i campioni, posizionarli su un rack magnetico per 1 minuto, quindi trasferire il supernatante da ciascun campione a nuovi tubi da 1,5 ml.
2. Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di RNasi A ai campioni. Brevemente vortice, quindi incubare i campioni a 37 °C per 30 min. Aggiungere ~25 μL di ddH_{autoclavato 2}O a volume fino a 100 μL.
3. Purificare il DNA utilizzando perline magnetiche(Tabella dei materiali). DNA eluto con 16 μL di ddH₂O autoclavato o ddH₂O privo di nucleasi.

14. Denaturazione, ricottura del primer ed estensione del primer

1. Dopo l'eluizione chIP e il crosslinking inverso, trasferire 16 μL dei campioni di DNA estratti dal passaggio 13.3 ai tubi PCR.
2. Rendere la miscela di denaturazione e ricottura del primer(tabella 6 e tabella dei materiali)sul ghiaccio. Aggiungere 1,2 μL di miscela di denaturazione e ricottura del primer a ciascun campione (volume totale di reazione: 17,2 μL). Eseguire campioni utilizzando il programma descritto nella tabella 6 per denaturare e ricottura i primer al DNA del modello.
3. Rendere la miscela di estensione del primer(tabella 7 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
4. Una volta completato il programma per la denaturazione e i primer ricottori, aggiungere 3 μL di miscela di estensione del primer ai campioni (volume totale di reazione: 20,2 μL). Eseguire esempi utilizzando il programma per l'estensione del primer descritto nella tabella 7.
5. Procedere immediatamente alla reazione di coda dA.

15. reazione di coda dA

NOTA: Per la legatura del DNA finale appiccicoso con DNA dell'adattatore universale, il dATP viene aggiunto all'estremità 3 ' di dsDNA smussato dalla reazione di coda dA.

1. Rendere la miscela di coda dA(tabella 8 e tabella dei materiali)sul ghiaccio.
2. Aggiungere 4,1 μL di miscela di coda dA a ciascun campione (volume totale di reazione: 24,3 μL). Eseguire campioni utilizzando il programma dA-tailing (Tabella 8).
3. Procedere immediatamente alla legatura universale dell'adattatore.

16. Legatura universale dell'adattatore

NOTA: l'adattatore universale include sequenze specifiche di sequenziamento ad alta produttività per il riconoscimento del campione di DNA per la chimica del sequenziamento. Le sequenze universali di DNA dell'adattatore sono descritte nella tabella 1.

1. Dopo la reazione dA-tailing, creare un mix universale di lisceria dell'adattatore (Tabella 9 e Tabella dei materiali) per la legatura universale dell'adattatore.
2. Aggiungere 21,5 μL a ciascun campione (volume totale di reazione: 45,8 μL) e incubare campioni per 15 min a 20 °C.

17. Pulizia del DNA

1. Purificare il DNA utilizzando perline magnetiche(Tabella dei materiali). DNA eluto con 21 μL di ddH₂O autoclavato o ddH₂O privo di nucleasi.
2. Conservare i campioni a -20 °C fino a quando non sono pronti per eseguire la purificazione PCR (LM-PCR) mediata dalla legatura e pcr.

18. PCR mediata dalla legatura

NOTA: le sequenze primer LM-PCR sono descritte nella tabella 1.

1. Dopo la pulizia del DNA, fare la miscela LM-PCR(tabella 10 e tabella deimateriali) sul ghiaccio.
2. Aggiungere 29 μL di miscela LM-PCR a ciascun campione (volume totale di reazione: 50 μL) ed eseguire campioni utilizzando il programma per LM-PCR (Tabella 10).
3. Procedere immediatamente alla purificazione del GEL del DNA amplificato PCR, seguita dalla purificazione del DNA per il sequenziamento ad alta produttività.

19. Purodi DNAdel DNA amplificato LM-PCR

1. Eseguire i campioni di DNA amplificato LM-PCR, insieme a una scala del DNA, in un gel di agarosio dell'1,5% a 120−180 V e accisa 200-400 bande bp.
2. Purificare il DNA dal gel asportato utilizzando un kit di estrazione del gel(Table of Materials).
3. Dopo la purificazione del DNA, controllare la concentrazione(Tabella dei materiali)di ogni campione di libreria ChIP-exo. Inviare esempi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva per il sequenziamento a lettura singola.
   NOTA: La lunghezza di lettura preferita per il sequenziamento a lettura singola è di almeno 35 bp, che è sufficiente per allineare in modo univoco le letture di sequenziamento al genoma di riferimento nelle cellule del topo o dell'uomo. Per la maggior parte dei fattori di trascrizione nelle cellule del topo o dell'uomo, 10−20 milioni di letture per campione ChIP-exo sono sufficienti per identificare le loro posizioni di legame genomico. Sono necessari almeno 30 milioni di letture per campione per mappare le regioni genomiche arricchite in segni istonali nelle cellule dei mammiferi.

Results

La figura 2A illustra i risultati della sonicazione dopo la llisi cellulare e la sonicazione, con vari cicli, delle cellule dei motoneuroni differenziate dalle cellule ES del topo. Il numero ottimale di cicli di sonicazione (ad esempio, 12 cicli nella Figura 2A) ha generato una forte intensità del DNA in frammenti di DNA 100−400 bp. Le librerie ChIP-exo di alta qualità si basano sulle dimensioni e sulla quantità di DNA di cromatina frammentato. Pertanto, l'ottim...

Discussion

In questo protocollo, il ChIP seguito dalla digestione dell'esonucleasi viene utilizzato per ottenere librerie di DNA per l'identificazione delle interazioni proteina-DNA nelle cellule dei mammiferi ad altissima risoluzione di mappatura. Molte variabili contribuiscono alla qualità dell'esperimento ChIP-exo. I parametri sperimentali critici includono la qualità degli anticorpi, l'ottimizzazione della sonicazione e il numero di cicli LM-PCR. Questi parametri sperimentali critici sono anche ciò che può limitare gli esperime...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio, UltraPure	Invitrogen	16500	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.6) e purificazione su gel di DNA amplificato LM-PCR (Sezione 19.1)
Albumina, siero bovino (BSA), senza proteasi, isolamento da shock termico, Min. 98%	BioShop	ALB003	Soluzione bloccante
Anticorpo contro Isl1	DSHB	39.3F7	Iniezione di anticorpi con perle (Sezione 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;	Diagenode	B01060010	cromatina sonicante (sezione 3.3)
albumina sierica bovina (BSA), grado di biologia molecolare	New England BioLabs	B9000S	Reazione di riempimento su perle (sezione 10.2) e denaturazione, ricottura del primer ed estensione del primer (sezione 14.2)
centrifuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	cromatina sonicante (sezione 3.5), controllo della sonicazione (sezione 4.3.1, 4.3.3 e 4.3.4)
Centrifuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.3), Lisi cellulare (Sezione 2.2 e 2.3), Cromatina sonicante (Sezione 3.1)
Cocktail di inibitori della proteasi cOmplete, Mini, EDTA-free Cocktail	Roche	4693159001	Aggiunto a tutti i tamponi, ad eccezione del tampone proteinasi K e della soluzione dATP del tampone ChIP Elution
	New England BioLabs	N0440S	dA-Tailing Reaction (Sezione 15.1)
Acido desossicolico Sale di sodio	fisher scientific	BP349	Lysis Buffer 3, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale e LiCl
Wash Buffer dNTP Mix, Molecular Biology Grade	Thermo Scientific	R0192	Fill-in Reaction on Beads (Sezione 10.2) e Denaturazione, Ricottura del primer ed estensione del primer (Sezione 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	Thermo Scientific	K1081	PCR mediata da legatura (Sezione 18.1)
EDTA, 0,5 M, soluzione sterile, pH 8.0	BioShop	EDT111	Tampone di lisi 1-3, controllo della sonicazione (Sezione 4.1), tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, tampone di lavaggio LiCl e tampone di eluizione ChIP
Alcool etilico anidro, 100%	alcoli commerciali	P006EAAN	controllo della sonicazione (Sezione 4.3.3)
Formaldeide, 36,5-38%, contiene il 10-15% metanolo	Sigma	F8775	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.1)
Glicerolo, grado reagente, min 99,5%	BioShop	GLY002	Tampone di lisi 1
glicina, grado biotecnologico, minimo 99%	BioShop	GLN001	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.2)
Glicogeno, grado RNA	Thermo Scientific	R0551	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.3)
HEPES, 1 M Soluzione filtrata sterile, pH 7,3	BioShop	HEP003	Tampone di lisi 1, tampone di lavaggio ad alto contenuto salino
Frammento di Klenow (3->5 exo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-Tailing Reaction (Sezione 15.1)
Esonucleasi Lambda	New England BioLabs	M0262S	Digestione dell'esonucleasi Lambda su perle (Sezione 11.2)
Potenziatore della ligasi	New England BioLabs	E7645S	Kit libreria DNA NEBNext Ultra II. Legatura dell'adattatore indice su perline (Sezione 9.1) e legatura dell'adattatore universale (Sezione 16.1)
Ligasi Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Legatura con adattatore indice su perline (Sezione 9.1) e legatura con adattatore universale (Sezione 16.1)
Cloruro di litio (LiCl), grado di reagente	Bioshop	LIT704	LiCl Wash
Buffer Sfere magnetiche per ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (perle magnetiche per ChIP)	Dynabeads Protein G (biglie magnetiche per ChIP)	Incubazione di anticorpi con perline (Sezione 5)
Sfere magnetiche per purificazione del DNA (AMPure XP Beads)	Beckman Coulter	A63880	Estrazione del DNA (Sezione 13.3) e Pulizia del DNA (Sezione 17.1)
Rack magnetico (magnete DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Utilizzato in molte fasi nelle sezioni: 5 - 11, 13
MinElute Kit di estrazione del gel	Qiagen	28604	Purificazione su gel di DNA amplificato PCR (Sezione 19.2)
di sale sodico di N-lauroilsarcosa, soluzione acquosa al 30%, ≥ 97,0% (HPLC)	Tampone di lisi	Sigma	61747
ottilfenolo etossilato (IGEPAL CA630)	Tampone di lisi BioShop	NON999	1 e tampone di lavaggio LiCl
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico, grado biotecnologico (25:24:1)	BioShop	PHE512	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.1)
phi29 DNA polimerasi	New England BioLabs	M0269L	Reazione di riempimento su perle (Sezione 10.2) e denaturazione, ricottura del primer ed estensione del primer (Sezione 14.3 e 14.4)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Celle di raccolta, reticolazione e congelamento (Sezione 1.3) e cromatina sonicante (Sezione 3.1), Iniezione di anticorpi con perle (Sezione 5.1)
Alimentatore di base PowerPac	BioRad	1645050	Sonicazione per il controllo (Sezione 4.3.6) e Purificazione su gel di DNA amplificato LM-PCR (Sezione 19.1)
Sistema ProFlex PCR	Sistema	ProFlex PCR	applicatoUtilizzato nelle sezioni: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 e 18.2
Provetta Protein LoBind, 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Incubazione di anticorpi con perle (Sezione 5.2) e immunoprecipitazione della cromatina (Sezione 6.3)
Soluzione di proteinasi K, RNA Grade	Invitrogen	25530049	Controllo della sonicazione (Sezione 4.2) e dell'eluizione e della reticolazione inversa (Sezione 12.3)
Qubit 4.0 Fluorimeter	Invitrogen	Q33226	Purificazione su gel di DNA amplificato PCR (Sezione 19.3)
Saggio Quibit dsDNA BR kit	Invitrogen	Q32853	Purificazione su gel di DNA amplificato PCR (Sezione 19.3)
Senza Rnasi A, Dnasi e Proteasi	Thermo Scientific	EN0531	Controllo della sonicazione (Sezione 4.3.2) e dell'estrazione del DNA (Sezione 13.2)
Cloruro di sodio (NaCl), BioReagent	Sigma	S5886	Tampone di lisi 1-3, tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale
dodecil solfato di sodio (SDS), grado di elettroforesi	BioShop	SDS001	Controllo della sonicazione (Sezione 4.1), tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale e microsfere di sonicazione del tampone di eluizione ChIP
e provette Bioruptor da 15 ml	Diagenode	C01020031	cromatina sonicante (Sezione 3.1 e 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Sezione 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 e 16.2
Soluzione di cloridrato di Trizma (Tris-HCl), certificato BioPerformance, 1 M, pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Soluzione tampone
Trizma cloridrato (Tris-HCl), certificato BioPerformance, 1 M, pH 8.0	Sigma	T2694	Tampone di lisi 2, tampone di lisi 3, sonicazione di controllo (Sezione 4.1), tampone di lavaggio LiCl e tampone di eluizione ChIP
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)	New England BioLabs	E7546S	e miscela di enzimi di fine preparazione. Riparazione finale e reazione di dA-tailing su perline (Sezione 8.2)
Mini bilanciere per tubi VWR, velocità variabile	VWR	10159-752	Utilizzato in molte fasi nelle sezioni: 1, 2, 5, 6 e 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo, Triton X-100, Reagente Grade	BioShop	TRX506	Lysis Buffer 1, cromatina sonicante (Sezione 3.4) e tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale