Articolo metodologico

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

DOI:

10.3791/61140

⸱

7 giugno 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il corretto ripiegamento e assemblaggio di proteine e complessi proteici sono essenziali per la funzione cellulare. Le cellule impiegano percorsi di controllo della qualità che correggono, sequestrano o eliminano le proteine danneggiate per mantenere un proteoma sano, garantendo così la proteostasi cellulare e prevenendo ulteriori danni alle proteine. A causa delle funzioni ridondanti all'interno della rete di proteostasi, lo screening per fenotipi rilevabili utilizzando knockdown o mutazioni in geni chaperone-encoding nell'organismo multicellulare Caenorhabditis elegans porta alla rilevazione di fenotipi minori o nulli nella maggior parte dei casi. Abbiamo sviluppato una strategia di screening mirata per identificare gli accompagnatori necessari per una funzione specifica e quindi colmare il divario tra fenotipo e funzione. In particolare, monitoriamo nuove interazioni chaperone utilizzando schermi di interazione sintetica RNAi, abbattendo l'espressione dell'accompagnatore, un accompagnatore alla volta, in animali portatori di una mutazione in un gene che codifica per l'accompagnatore o sovraesprimendo un accompagnatore di interesse. Interrompendo due chaperoni che individualmente non presentano fenotipo grossolano, possiamo identificare chaperoni che aggravano o espongono un fenotipo specifico quando entrambi sono perturbati. Dimostriamo che questo approccio può identificare insiemi specifici di chaperoni che funzionano insieme per modulare il ripiegamento di una proteina o di complessi proteici associati a un dato fenotipo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule affrontano il danno proteico impiegando macchinari di controllo qualità che riparano, sequestrano o rimuovono eventuali proteine danneggiate1,2. Il ripiegamento e l'assemblaggio di complessi proteici sono supportati da chaperoni molecolari, un gruppo eterogeneo di proteine altamente conservate che possono riparare o sequestrare le proteine danneggiate3,4,5,6,7. La rimozione delle proteine danneggiate è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o dal macchinario autofagico9 in collaborazione con gli accompagnatori10,11,12. L'omeostasi proteica (proteostasi) è, quindi, mantenuta da reti di controllo qualità composte da macchinari di piegatura e degradazione3,13. Tuttavia, comprendere le interazioni tra i vari componenti della rete di proteostasi in vivo è una sfida importante. Mentre gli schermi di interazione proteina-proteina contribuiscono con informazioni importanti sulle interazioni fisiche e sui complessi di chaperone14,15, manca la comprensione dell'organizzazione e dei meccanismi compensatori all'interno delle reti di chaperone tessuto-specifiche in vivo.

Le interazioni genetiche sono spesso utilizzate come un potente strumento per esaminare la relazione tra coppie di geni che sono coinvolti in percorsi biologici comuni o compensatori16,17,18. Tali relazioni possono essere misurate combinando coppie di mutazioni e quantificando l'impatto di una mutazione in un gene sulla gravità fenotipica causata da una mutazione nel secondo gene16. Mentre la maggior parte di tali combinazioni non mostra alcun effetto in termini di fenotipo, alcune interazioni genetiche possono aggravare o alleviare la gravità del fenotipo misurato. Mutazioni aggravanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è più grave del fenotipo atteso visto combinando i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni funzionano in percorsi paralleli, influenzando insieme una data funzione. Al contrario, le mutazioni attenuanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è meno grave del fenotipo osservato con i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni agiscono insieme come un complesso o partecipano alla stessa via16,18. Di conseguenza, diversi fenotipi che possono essere quantificati, compresi fenotipi ampi, come letalità, tassi di crescita e dimensioni della covata, nonché fenotipi specifici, come i reporter trascrizionali, sono stati utilizzati per identificare le interazioni genetiche. Ad esempio, Jonikas et al. si sono affidati a un reporter dello stress ER per esaminare le interazioni della rete di proteostasi della risposta proteica dispiegata saccharomyces cerevisiae ER utilizzando analisi di delezione genica a coppie19.

Gli screening di interazione genetica comportano l'incrocio sistematico di mutazioni di delezione a coppie per generare un set completo di doppi mutanti20. Tuttavia, nei modelli animali, e in particolare in C. elegans, questo approccio su larga scala non è fattibile. Invece, i ceppi mutanti possono essere testati per i loro modelli di interazione genetica regolando l'espressione genica utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi)21. C. elegans è un potente sistema per schermi basato su RNAi22,23. In C. elegans, la consegna di RNA a doppio filamento (dsRNA) è ottenuta mediante alimentazione batterica, portando alla diffusione di molecole di dsRNA a numerosi tessuti. In questo modo, le molecole di dsRNA introdotte hanno un impatto sull'animale attraverso una procedura rapida e semplice21. Uno screening di interazione genetica che utilizza RNAi può, quindi, rivelare l'impatto della down-regolazione di un insieme di geni o della maggior parte dei geni codificanti C. elegans utilizzando le librerie RNAi24. In tale schermo, i colpi che influenzano il comportamento del mutante di interesse ma non il ceppo wild type sono potenziali modificatori del fenotipo monitorato25. Qui, applichiamo una combinazione di mutazioni e screening RNAi per mappare sistematicamente le interazioni chaperone tessuto-specifiche in C. elegans.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di piastre di crescita di nematodi per RNAi

  1. In una bottiglia da 1 L aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di Bacto-Peptone, 17 g di agar e acqua distillata fino a 1 L e autoclave.
  2. Raffreddare la bottiglia a 55 °C.
  3. Aggiungere 25 mL di 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL di 1 M CaCl2,1 mL di 1 M MgSO4e 1 mL di soluzione di colesterolo(Tabella 1)per produrre mezzi di crescita nematodi (NGM).
  4. Aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 0,5 mL di 1 M IPTG(Tabella 1)per produrre la soluzione di NGM-RNAi.
    NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati contengono una DNA polimerasi T7 inducibile da IPTG utilizzata per esprimere i plasmidi che codificano per il dsRNA. Questi plasmidi codificano anche per la resistenza all'ampicillina.
  5. Mescolare la soluzione calda facendo roteare la bottiglia.
  6. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, versare la soluzione NGM in piastre o utilizzando una pompa peristaltica, erogare la soluzione in piastre. Utilizzare piastre a 6 pozzi, 12 pozzi, 40 mm o 60 mm per questo schermo. Agar dovrebbe riempire circa 2/3 della profondità della piastra.
  7. Lasciare asciugare le piastre per una notte sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte. Le piastre NGM per RNAi possono essere conservate a 4 °C per un massimo di un mese.

2. Crescita dei batteri RNAi e semina delle piastre

  1. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL di tetraciclina (5 mg/mL) (Tabella 1) a una soluzione e miscela pre-autoclavata da 1 L di LB.
    NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati sono resistenti alle tetracicline.
  2. Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 600 μL di soluzione LB a ciascun pozzo in piastre sterili da 96 pozzi profonde 2 mL. È meglio usare un pipetto multicanale per erogare il supporto.
  3. Utilizzando procedure sterili, inoculare pozzi con batteri HT115 (DE3) E. coli trasformati con un plasmide che codifica per il dsRNA che prende di mira un gene di interesse o un plasmide vuoto, come controllo. Coprire le piastre e incubare a 37 °C durante la notte. Le librerie costituite da cloni batterici che esprimono dsRNA, corrispondenti a circa il 94% dei geni previsti di C. elegans, sono state precedentemente costruite22,23 e sono disponibili in commercio. La biblioteca di accompagnatori utilizzata qui è stata costruita dal laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.
  4. Utilizzando procedure sterili, seminare 75, 150 o 250 μL di batteri sulle piastre NGM RNAi a 12 pozzi, 40 mm e 6 o 60 mm, rispettivamente. Contrassegnare chiaramente il nome del gene bersaglio sulla piastra. I batteri dovrebbero coprire il 30-50% della superficie dell'agar e non dovrebbero toccare i bordi della piastra.
  5. Lasciare asciugare le piastre per almeno 2 giorni sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte.
    NOTA: le piastre possono essere incubate a 37 °C durante la notte. Assicurarsi che i pozzi interni siano asciutti prima di utilizzare o conservare le piastre. Per tutti gli scopi a lungo termine (ad es. essiccazione o conservazione) tenere le piastre al buio. I piatti essiccati con semi possono essere conservati a 4 °C per un massimo di un mese.

3. Sincronizzazione non stressante degli embrioni

  1. Usa un worm pick per spostare circa 100 uova da una piastra worm non sincronizzata a una piastra NGM appena seminata.
  2. Coltivare animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. Gli animali dovrebbero raggiungere il primo giorno di deposizione delle uova.
    NOTA: I vermi sono comunemente coltivati a 20 °C. Tuttavia, diversi ceppi mutanti di chaperone possono richiedere temperature di coltivazione specifiche. Ad esempio, molti ceppi sensibili alla temperatura vengono coltivati a 15 °C ma spostati a 25 °C per esporre il loro fenotipo.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone M9 (Tabella 1) lentamente e lontano dal prato batterico. Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto.
    NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.
  4. Ripetere il passaggio 3.3 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.
  5. Usando una punta di plastica standard, tagliare un quadrato di agar dal piatto lavato dove sono concentrate le uova e posizionare il pezzo di agar su un piatto NGM appena seminato.
    NOTA: sono necessarie ~ 200 uova per produrre abbastanza animali che depongono le uova; troppi animali consumano i batteri troppo rapidamente. Bassi livelli di cibo possono avere un impatto sulla proteostasi27.
  6. Coltivare gli animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. A questo punto, le piastre dovrebbero essere coperte con uova sincronizzate.
    NOTA: gli animali possono essere spostati su una nuova piastra per una breve durata per una sincronizzazione più rigorosa. Tuttavia, è importante utilizzare solo gli adulti nelle prime fasi della deposizione delle uova poiché gli animali possono trattenere le uova nel loro utero influenzando la sincronizzazione.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone M9 lentamente e lontano dal prato batterico.
  8. Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto.
  9. Ripetere il passaggio 3.7 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.
  10. Aggiungere 1 mL di tampone M9 e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare le uova dalla piastra.
  11. Raccogliere il tampone M9 contenente le uova dalle piastre.
  12. Centrifugare il tampone M9 contenente le uova a 3.000 x g per 2 min.
  13. Rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone M9 per raggiungere un volume di 1 ml.
  14. Risuscindi le uova per interrompere eventuali pezzi di uova e batteri.
  15. Ripetere la procedura di lavaggio descritta nei passaggi 3.11-3.13 cinque volte. Il pellet d'uovo dovrebbe apparire bianco. Se è ancora giallo/marrone, ripetere il lavaggio fino a ottenere un pellet bianco.
    NOTA: i batteri che rimangono sulle uova possono contaminare i batteri che esprimono dsRNA.
  16. Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 200 μL. Le uova sincronizzate possono essere utilizzate per gli schermi RNAi.

4. Saggi fenotipici comuni

  1. Coltivazione di animali durante gli esperimenti
    1. Metti una goccia di ~ 30 uova vicino al prato batterico in ogni piatto con semi di RNAi. Per riferimento, posizionare anche ~ 30 uova su piastre seminate con batteri vuoti contenenti vettori (L4440).
    2. Coltivare animali sincronizzati con l'età su piastre con semi NGM RNAi. La durata dell'esperimento dipenderà dalla fase in cui gli animali devono essere monitorati e dalla temperatura di coltivazione. Regolare la temperatura di coltivazione quando si utilizzano animali mutanti sensibili alla temperatura. Regolare la durata della coltivazione quando si utilizzano animali mutanti ritardati nello sviluppo.
      NOTA: Mentre i tempi possono variare, una volta che gli animali raggiungono l'età adulta, la deposizione delle uova (e il conseguente rapido consumo di cibo), così come la proteostosi dipendente dall'età collassano28, potrebbero influire sui risultati. Si raccomanda quindi di segnare gli animali prima dell'inizio della deposizione delle uova (giorno 1 dell'età adulta). Gli animali selvatici raggiungono questo stadio dopo 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.
    3. Il numero di ripetizioni utilizzate dipenderà dalle dimensioni del set di geni esaminato. Per la libreria di chaperone (97 geni), ripetere gli esperimenti almeno quattro volte. La dimensione della popolazione dipende dal test utilizzato. Nei saggi comportamentali discussi qui, il punteggio >15 animali per condizione sperimentale in ogni ripetizione. Anche i dati e le analisi statistiche dipendono fortemente dal tipo di test utilizzato. I dati nei saggi discussi qui possono essere presentati come mezzi ± SEM.
    4. Confronta gli animali trattati con controllo RNAi e vettori vuoti come popolazioni indipendenti. I valori P possono essere calcolati utilizzando ANOVA unidire o bidirezionale, a seconda delle modifiche esaminate, vale a dire aggravando o alleviando da soli o entrambi. Quando si esamina un singolo trattamento RNAi rispetto al controllo, i valori P possono essere calcolati utilizzando il test della somma di rango di Mann-Whitney unidirezionale o bidirezionale. Oltre alla significatività statistica, considerare una soglia per gli hit in base al grado di impatto sul fenotipo.
  2. Arresto/ritardo dello sviluppo
    1. Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e conta il numero di larve e adulti per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti. Il trattamento con hsp-1 o hsp-90 RNAi provoca l'arresto dello sviluppo di animali selvatici e può essere utilizzato come controllo positivo.
    3. Per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo nel tempo, ripetere il passaggio 4.2.2.
      NOTA: Se ci sono adulti che depongono le uova sulla piastra, trasferire gli animali ritardati nello sviluppo in una nuova piastra NGM-RNAi etichettata per lo stesso gene bersaglio per evitare confusione con la progenie.
  3. Sterilità o difetti di deposizione delle uova
    1. Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale iniziano a deportare le uova.
    2. Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e segna la percentuale di animali senza uova visibili nel loro utero. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale.
    3. In alternativa, monitorare gli animali utilizzando uno stereomicroscopio e segnare la percentuale di animali con un utero pieno di uova, definito come EGg Laying defective (Egl-d) fenotipo29.
  4. Letalità embrionale
    1. Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali iniziano a deportare le uova.
    2. Trasferire ~ 100 uova in un piatto vuoto. Distribuire le uova in file per semplificare il conteggio.
    3. Segna la percentuale di uova non schifate sul piatto dopo 24-48 ore. Per riferimento, confrontare con uova di animali trattati con batteri vuoti di controllo del vettore.
  5. Test di paralisi
    1. Per gli adulti del giorno 1, coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Disegna una linea sul retro di una normale piastra di agar NGM usando un pennarello fine.
    3. Posiziona 5-10 animali sulla linea segnata.
    4. Imposta un timer e attendi 10 minuti.
    5. Segna la percentuale di animali rimasti sulla linea come vermi paralizzati. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale. Gli animali selvatici trattati con unc-45 RNAi mostrano fenotipo di paralisi grave e possono essere usati come controllo positivo.
      NOTA: Questo test evidenzia gli animali che mostrano paralisi da media a grave. Tali animali di solito giacciono dritti sul piatto, piuttosto che presentare la forma curva comune. Inoltre, una macchia ripulita dai batteri è visibile intorno alle teste dei vermi paralizzati.
  6. Test di thrashing
    1. Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.
    2. Pipettare 100 μL di tampone M9 alla temperatura di coltivazione degli animali in una piastra a 96 pozzetti.
    3. Posizionare ~ 15 vermi, uno per pozzo, nei pozzi contenenti tampone M9.
    4. Lasciare che gli animali si adattino per 5 minuti.
    5. Esamina ogni animale sotto lo stereomicroscopio, avvia un timer che conta 15 s e conta il numero di curve del corpo che ogni animale esegue in quel lasso di tempo. I valori contati possono essere normalizzati in curve del corpo al minuto. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale.
      NOTA: Questo test di motilità è molto sensibile e può rilevare differenze molto lievi tra i trattamenti. Tuttavia, la motilità nel liquido e la motilità sull'agar possono differire.

5. Validazione del knockdown proteico

  1. Posizionare 250-300 uova sincronizzate su una piastra NGM-RNAi da 60 mm seminata con i relativi batteri che esprimono dsRNA o contenenti vettori vuoti (L4440).
    NOTA: l'abbattimento dell'RNAi potrebbe comportare un accumulo aberrante di embrioni, una mancanza di embrioni o un arresto dello sviluppo che potrebbe influire sull'espressione genica. Questo dovrebbe essere considerato quando si determina l'età degli animali da esaminare.
  2. Per gli adulti del giorno 1, coltivare animali per 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.
  3. Raccogliere e trasferire un totale di 200 giovani animali adulti nel cappuccio di un riempimento del tubo da 1,5 ml con 200 μL di PBS-T.
    NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.
  4. Chiudere il tappo con attenzione e centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto.
  5. Aggiungere 800 μL di PBS-T (Tabella 1) e centrifugare a 1.000 x g per 1 min.
  6. Rimuovere con attenzione i primi 900 μL.
  7. Ripetere i passaggi 5.4-5.6 tre volte.
  8. Rimuovere 900 μL, lasciando 100 μL di soluzione contenente i 200 vermi.
  9. Aggiungere 25 μL di 5x buffer campione (Tabella 1).
  10. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 92°C agitando a 1000 giri/min. I campioni possono quindi essere congelati e conservati a -20 °C.
  11. Caricare 20 μL di ciascun campione ed eseguire su un gel SDS-PAGE.
  12. Eseguire l'analisi western blot utilizzando anticorpi appropriati per determinare la stabilità relativa della proteina.
  13. Determinare l'intensità delle bande utilizzando un software densitometrico, come il modulo gel ImageJ disponibile gratuitamente. Normalizzare tutti i valori a quelli misurati nei campioni di controllo.
    NOTA: Lo scopo del knockdown RNAi nei nostri schermi è quello di abbassare i livelli proteici di uno specifico chaperone / co-chaperone. Pertanto, il modo migliore per valutare l'efficienza del knockdown RNAi è l'analisi western blot. Ciò richiede anticorpi specifici. In alternativa, la qPCR può essere utilizzata per quantificare i livelli di mRNA.

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Risultati

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Utilizzo di mutazioni sensibili alla temperatura in UNC-45 per lo screening delle interazioni aggravanti o attenuanti in condizioni permissive o restrittive, rispettivamente
L'assemblaggio e la manutenzione muscolare offrono un sistema efficace per studiare le interazioni chaperone tessuto-specifiche. L'unità funzionale dei muscoli contrattili, il sarcomero, presenta una disposizione cristallina di proteine strutturali e regolatrici. La stabilità della proteina motoria miosina e la sua incorporazione ...

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Discussione

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Rimane carente un quadro integrato della rete di proteostasi che rifletta come è organizzata e funziona in diverse cellule e tessuti metazoici. Per affrontare questa carenza, sono necessarie informazioni specifiche sulle interazioni di vari componenti di questa rete, come gli accompagnatori molecolari, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento. Qui, abbiamo mostrato come l'uso di perturbazioni tessuto-specifiche ci ha permesso di esaminare la rete di chaperone in un determinato tessuto. P...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR), per alcuni dei ceppi di nematodi. Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dallo Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dal Dipartimento di Biologia dell'Università dell'Iowa. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Israel Science Foundation (sovvenzione n. 278/18) e da una sovvenzione del Ministero israeliano della Scienza e della Tecnologia, e del Ministero degli Affari Esteri e della Cooperazione Internazionale, Direzione Generale per la Promozione del Paese, Repubblica Italiana (sovvenzione n. 3-14337). Ringraziamo i membri del laboratorio Ben-Zvi per l'aiuto nella preparazione di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 12 pozzettiSPLBA3D16B
piastre da 40 mmGreiner Bio-one627160
piastre da 60 mmGreiner Bio-one628102
piastre a 6 pozzettiThermo Scientific140675
96 pozzetti 2 mL 128,0/85 mmGreiner Bio-one780278
Agar FormediumAGA03
AmpicillinaFormedium69-52-3
blu di bromofenoloSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
FotocameraQimagingq30548
ColesteroloAmresco0433-250G
ConfocaleLeicaDM5500
Filtro (0,22 µ m)SigmaSCGPUO2RE
Stereomicroscopio fluorescenteLeicaMZ165FC
GliceroloFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Dono dal laboratorio Morimoto
Miosina MHC A (MYO-3) AnticorpoHybridoma Bank5-6
Na2HPO4· 7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Pompa di colata a piastreIntegralo fa p920
RNAi Chaperone libreriaNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß- mercaptoetanoloBio world41300000-1
stereomicroscopioLeicaMZ6
TetraciclinaDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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