Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La fluorescenza a singola molecola, la fluorescenza di fondo da substrati etichettati in soluzione spesso limita la concentrazione di fluoroforo a intervalli pico- a nanomolari, diversi ordini di grandezza inferiori a molte concentrazioni fisiologiche di ligando. Le nanostrutture ottiche chiamate guide d'onda a modalità zero (ZWW), che hanno aperture di diametro di 100−200 nm fabbricate in un sottile metallo conduttore come l'alluminio o l'oro, consentono l'imaging di singole molecole a concentrazioni micromolari di fluorofori limitando l'eccitazione della luce visibile ai volumi efficaci dello zeptoliter. Tuttavia, la necessità di apparecchiature di nanofabbricazione costose e specializzate ha precluso l'uso diffuso di ZWW. Tipicamente, nanostrutture come gli ZMW sono ottenute scrivendo direttamente usando la litografia a fascio di elettroni, che è sequenziale e lenta. Qui, colloidale, o nanosfera, la litografia è usata come strategia alternativa per creare maschere su scala nanometrica per la fabbricazione di guide d'onda. La presente relazione descrive l'approccio in dettaglio, con considerazioni pratiche per ogni fase. Il metodo consente di creare migliaia di ZW in alluminio o oro in parallelo, con diametri e profondità finali della guida d'onda di 100−200 nm. Sono necessarie solo attrezzature da laboratorio comuni e un evaporatore termico per la deposizione di metalli. Rendendo gli ZMW più accessibili alla comunità biochimica, questo metodo può facilitare lo studio dei processi molecolari a concentrazioni e velocità cellulari.
Introduzione
Tecniche a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza a singola molecola (smFRET) o la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a singola molecola (FCS) sono potenti strumenti per la biofisica molecolare, consentendo lo studio di movimenti dinamici, conformazioni e interazioni di singole biomolecole in processi come la trascrizione1,2,3,traduzione4,5,6e molti altri7. Per smFRET, la microscopia tirf (Total Internal Reflect....
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Protocollo
NOTA: tutti i passaggi possono essere completati nello spazio generale del laboratorio.
1. Pulizia delle labbra con coperture in vetro
- Per fornire una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare 24 x 30 mm di rivestimenti in vetro borosilicato ottico (spessore 0,16−0,19 mm) all'interno degli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro coplin per la pulizia.
NOTA: Assicurarsi che i copriparsi siano in posizione verticale e siano ben separati in modo che tutte le superfici siano chiaramente esposte durante il processo di pulizia. - Versare abbastanza acetone nel bar....
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Risultati
L'auto-assemblaggio delle particelle colloidali di polistirolo attraverso la sedimentazione evaporativa (fasi 2.1−2.13) può produrre una serie di risultati poiché richiede il controllo del tasso di evaporazione del solvente. Tuttavia, poiché le deposizioni sono veloci (10−15 minuti per round), la procedura può essere rapidamente ottimizzata per diverse condizioni di laboratorio ambientale. La figura 3A mostra un modello colloidale ben formato dopo la deposizione e l'evaporazione. Macroscopic.......
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Discussione
Per l'auto-assemblaggio colloidale (sezione del protocollo 2), l'uso di etanolo piuttosto che di acqua come solvente di sospensione accelera il processo di evaporazione in modo che i modelli siano pronti in 2−3 minuti dopo la deposizione piuttosto che 1−2 h come nei metodiprecedenti 48,49. Il protocollo di sedimentazione evaporativa qui presentato è anche più semplice dei precedenti protocolli di sedimentazione che richiedono il controllo dell'inclinazione superf.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01GM080376, R35GM118139 e NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: da 15-48571 a Y.E.G., e da una borsa di studio NRSA pre-dottorato NIAID da F30AI114187 a R.M.J.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1. Vetrino coprioggetti Pulizia | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coplin vaso di colorazione in vetro | Fisher Scientific | 08-817 | Barattolo di colorazione con 8 scanalature e coperchio in vetro stampato |
| Vetrini coprioggetti | VWR | 48404-467 | 24 mm x 30 mm (No.1½, rettangolare) |
| Etanolo | Sigma | E7023 | 1 L |
| KOH | Sigma | 30603 | idrossido di potassio |
| Sonicatore | Branson | Z245143 | , 5510 |
| 2. Deposizione evaporativa di perle di polistirene | |||
| Contenitore di stoccaggio trasparente | Fisher Scientific | 50-110-8222 | 26 x 18 x 15 in. |
| Ventilatore da tavolo | O2Cool | FD05001A | Qualsiasi piccolo ventilatore da tavolo (~5 pollici) funzionerà |
| Bicchiere di vetro | Fisher Scientific | 02-555-25B | da 250 mL |
| Fisher Scientific | 11-661-19 | ||
| Provette per microcentrifuga | Fisher Scientific | 21-402-903 | da 1,5 mL |
| Polysciences | 18602-15 | 1,00 & micro; m di diametro, non funzionalizzato | |
| Triton X-100 deturgent | Sigma | X100 | 100 mL |
| 3. Ricottura delle perline per ridurre le dimensioni dei pori nel modello di cristallo colloidale | |||
| Piastra in alluminio | Fisher Scientific | AA11062RY | Personalizzato internamente a 14 cm x 14 cm |
| Piastra riscaldante in ceramica | Fisher Scientific | HP88857100 | 13 x 8,2 x 3,8 pollici. |
| Regolatore di temperatura | McMaster-Carr | 38615K71 | Lettura della temperatura con sonda a termocoppia |
| Sonda a termocoppia | McMaster-Carr | 9251T93 | Tipo K, sonda di superficie |
| 4/5. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero utilizzando il modello di cristallo colloidale | |||
| Aluminium etchant | Transene | Type A | |
| Aluminium pellets | Kurt J. Lesker | EVMAL40QXHB | Per l'evaporazione del fascio di elettroni |
| Cloroformio | Sigma | 288306 | 1 L |
| Mordenzante al rame | Transene | 49-1 | |
| Pellet di rame | Kurt J. Lesker | EVMCU40QXQA | Per l'evaporazione a fascio di elettroni |
| Pellet d'oro | Kurt J. Lesker | EVMAUXX40G | Per l'evaporazione a fascio di elettroni |
| Carta per lenti | Thorlabs | MC-5 | |
| Detergente al plasma | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Nastro adesivo | Graffette | MMM119 | |
| Sistema di deposizione di film sottili | Kurt J. Lesker | PVD-75 | Il sistema di evaporazione termica da tavolo funzionerà anche |
| Pellet di titanio | Kurt J. Lesker | EVMTI45QXQA | Per l'evaporazione a fascio di elettroni |
| Toluene | Sigma | 244511 | 1 L |
| Representative Results | |||
| COMSOL Software di modellazione multifisica | COMSOL, Inc. | ||
| Splitter spettrale Dual View | Photometrics, Inc. |
Riferimenti
- Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
- Santoso, Y., et al. Confor....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.
