Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola

Sommario

Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.

Abstract

La fluorescenza a singola molecola, la fluorescenza di fondo da substrati etichettati in soluzione spesso limita la concentrazione di fluoroforo a intervalli pico- a nanomolari, diversi ordini di grandezza inferiori a molte concentrazioni fisiologiche di ligando. Le nanostrutture ottiche chiamate guide d'onda a modalità zero (ZWW), che hanno aperture di diametro di 100−200 nm fabbricate in un sottile metallo conduttore come l'alluminio o l'oro, consentono l'imaging di singole molecole a concentrazioni micromolari di fluorofori limitando l'eccitazione della luce visibile ai volumi efficaci dello zeptoliter. Tuttavia, la necessità di apparecchiature di nanofabbricazione costose e specializzate ha precluso l'uso diffuso di ZWW. Tipicamente, nanostrutture come gli ZMW sono ottenute scrivendo direttamente usando la litografia a fascio di elettroni, che è sequenziale e lenta. Qui, colloidale, o nanosfera, la litografia è usata come strategia alternativa per creare maschere su scala nanometrica per la fabbricazione di guide d'onda. La presente relazione descrive l'approccio in dettaglio, con considerazioni pratiche per ogni fase. Il metodo consente di creare migliaia di ZW in alluminio o oro in parallelo, con diametri e profondità finali della guida d'onda di 100−200 nm. Sono necessarie solo attrezzature da laboratorio comuni e un evaporatore termico per la deposizione di metalli. Rendendo gli ZMW più accessibili alla comunità biochimica, questo metodo può facilitare lo studio dei processi molecolari a concentrazioni e velocità cellulari.

Introduzione

Tecniche a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza a singola molecola (smFRET) o la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a singola molecola (FCS) sono potenti strumenti per la biofisica molecolare, consentendo lo studio di movimenti dinamici, conformazioni e interazioni di singole biomolecole in processi come la trascrizione^1,2,3,traduzione^4,5,6e molti altri⁷. Per smFRET, la microscopia tirf (Total Internal Reflection Fluorescence) è un metodo comune perché molte molecole legate possono essere seguite nel tempo e l'onda evanescente generata dal TIR è limitata a una regione di 100−200 nm adiacente al coverslip⁸. Tuttavia, anche con questa limitazione del volume di eccitazione, i fluorofori di interesse devono ancora essere diluiti in intervalli di pM o nM al fine di rilevare segnali di singola molecola al di sopra della fluorecenza di fondo⁹. Poiché le costanti michaelis-menten degli enzimi cellulari sono tipicamente nell'intervallo da μM a mM¹⁰, le reazioni biochimiche negli studi su singole molecole sono di solito molto più lente di quelle nella cellula. Ad esempio, la sintesi proteica avviene a 15−20 aminoacidi al secondo in E. coli¹¹,^12,mentre la maggior parte dei ribosomi procariotici negli esperimenti smFRET si traducono in 0,1−1 aminoacido al secondo¹³. Nella sintesi proteica, le strutture cristalline e lo smFRET sui ribosomi in stallo hanno mostrato che gli RRNA di trasferimento (tRNA) oscillano tra stati "ibridi" e "classici" prima della traslocazione tRNA-mRNA^{fase 14,15}. Tuttavia, quando erano presenti concentrazioni fisiologiche del fattore GTPasi di traslocazione, EF-G, è stata osservata una conformazione diversa, intermedia tra gli stati ibridi e classici, in smFRET⁶. Studiare processi molecolari dinamici a tassi e concentrazioni simili a quelli della cellula è importante, ma rimane una sfida tecnica.

Una strategia per aumentare la concentrazione del substrato fluorescente è l'uso di aperture di lunghezza d'onda sub-visibile a base di metallo, chiamate guide d'onda in modalità zero (ZMW), per generare campi di eccitazione confinati che eccitano selettivamente le biomolecole localizzate all'interno delle aperture¹⁶ (Figura 1). Le aperture hanno in genere un diametro di 100−200 nm e una profondità di 100−150 nm¹⁷. Al di sopra di una lunghezza d'onda di taglio correlata alla dimensione e alla forma dei pozzi (λ_c ≈ 2,3 volte il diametro per le guide d'onda circolari con acqua come mezzo dielettrico¹⁸), non sono consentiti modi di propagazione nella guida d'onda, da cui il termine guide d'onda in modalità zero. Tuttavia, un campo elettromagnetico oscillante, direttamente un'onda evanescente, in decomposizione esponenziale in intensità tunnela ancora a breve distanza nella guida d'onda^18,19. Sebbene simili alle onde evanescenti TIR, le onde evanescenti ZMW hanno una costante di decadimento più breve, con conseguente regione di eccitazione effettiva di 10−30 nm all'interno della guida d'onda. A concentrazioni micromolari di ligandi etichettati fluorescentmente, solo una o poche molecole sono simultaneamente presenti all'interno della regione di eccitazione. Questa limitazione del volume di eccitazione e la conseguente riduzione della fluorescenza di fondo consentono l'imaging a fluorescenza di singole molecole a concentrazioni biologicamente rilevanti. Questo è stato applicato a molti sistemi^20,tra cui misurazioni FCS di diffusione di singole proteine^21,misurazioni FRET a singola molecola di interazioni ligando-proteina²² a bassa affinità e proteina-proteina^23,e misurazioni spettro-elettrochimiche di singoli eventi di turnover^{molecolare 24.}

Gli ZWW sono stati prodotti modellando direttamente uno strato metallico utilizzando la fresatura di^{fasci ionici 25,26} o litografia a fascio di elettroni (EBL) seguita dall'incisione al plasma^16,27. Questi metodi di litografia senza maschera creano guide d'onda in serie e in genere richiedono l'accesso a strutture specializzate di nanofabbricazione, impedendo l'adozione diffusa della tecnologia ZMW. Un altro metodo, il lift-off della litografia nanoimprint ultravioletta²⁸, utilizza uno stampo scorrevole al quarzo per premere un modello ZMW inverso su un film di resistenza come un timbro. Sebbene questo metodo sia più snello, richiede ancora EBL per la fabbricazione dello stampo al quarzo. Questo articolo presenta il protocollo per un metodo di fabbricazione basato su modelli semplice ed economico che non richiede la fresatura EBL o fasci di ioni e si basa sull'imballaggio ravvicinato di nanosfere per formare una maschera litografica.

La nanosfera o litografia "naturale", proposta per la prima volta nel 1982 da Deckman e Dunsmuir^29,30, utilizza l'auto-assemblaggio di particelle colloidali monodisperse, che vanno da decine di nanometri a decine di micrometri^31,per creare modelli per la creazione di superfici attraverso l'incisione e/o la deposizione di materiali. Gli array periodici estesi bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) di particelle colloidali, denominati cristalli colloidali, sono caratterizzati da una luminosa iridescenza dallo scattering e dalla diffrazione³². Sebbene meno ampiamente utilizzata del fascio di elettroni o della fotolitografia, questa metodologia di mascheramento è semplice, a basso costo e facilmente ridimensionabile per creare dimensioni delle funzionalità inferiori a 100 nm.

Dirigere l'auto-assemblaggio delle particelle colloidali determina il successo dell'uso dei cristalli colloidali come maschere per la creazione di superfici. Se le dimensioni e la forma delle particelle sono omogenee, le particelle colloidali possono essere facilmente auto-assemblate con imballaggio esagonale, guidate dall'esaurimento^{entropico 33}. L'evaporazione dell'acqua dopo il rivestimento a goccia è un percorso efficace per sedimentare le particelle colloidali, anche se altri metodi includono il dip-coating^34,il rivestimento di spin^35,la deposizione elettroforetica³⁶e il consolidamento in un'interfaccia aria-acqua^37. Il protocollo presentato di seguito si basa sul metodo di sedimentazione dell'evaporazione, che è stato il più semplice da implementare. Gli interstizi triangolari tra perline di polistirene imballate a distanza ravvicinata formano aperture in cui placcare un metallo sacrificale, formando pali(Figura 2 e Figura supplementare 1). Breve ricottura delle perline prima che questo passaggio adatti la forma e il diametro di questi pali. Le perline vengono rimosse, uno strato metallico finale viene depositato intorno ai pali e quindi i pali vengono rimossi. Dopo che i due passaggi di deposizione metallica sulla nanomaschera colloidale, rimozione dei post intermedi e modifica della chimica delle superfici per la passivazione e il tethering, gli array ZMW sono pronti per l'uso per l'imaging a singola molecola. Una caratterizzazione più estesa delle proprietà ottiche ZMW dopo la fabbricazione può essere trovata in un articolo^{38 di accompagnamento.} Oltre a un evaporatore termico per la deposizione di vapore dei metalli, non sono necessari strumenti specializzati.

Protocollo

NOTA: tutti i passaggi possono essere completati nello spazio generale del laboratorio.

1. Pulizia delle labbra con coperture in vetro

1. Per fornire una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare 24 x 30 mm di rivestimenti in vetro borosilicato ottico (spessore 0,16−0,19 mm) all'interno degli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro coplin per la pulizia.
   NOTA: Assicurarsi che i copriparsi siano in posizione verticale e siano ben separati in modo che tutte le superfici siano chiaramente esposte durante il processo di pulizia.
2. Versare abbastanza acetone nel barattolo di colorazione per coprire le copertine, posizionare il coperchio e sonicare per 10 minuti a 40 °C.
3. Versare l'acetone e sciacquare le copertine riempiendo il barattolo di colorazione con H₂O distillato e versando l'acqua. Ripeti altre 2 volte.
4. Ripetere ancora una volta la sonicazione dell'acetone (passaggi 1.2 e 1.3).
5. Versare abbastanza KOH da 200 mM nel barattolo per coprire le coverlips e sonicare, coperto, per 20 min a 40 °C.
   NOTA: Il KOH intasa leggermente il vetro.
6. Risciacquare le coverlips con H distillato₂O 6 volte.
7. Aggiungere l'etanolo per coprire i copricapo, aggiungere il coperchio e sonicare per 10 minuti a 40 °C.
8. Risciacquare le coverlips con H distillato₂O 3 volte.
9. Raccogliere ogni coverlip sul bordo con forcep delicate e asciugare i copricapo con gas N_2. Toccare solo i bordi del coverslip. Posizionare ciascuna delle coverlip essiccate e pulite in una singola piastra di Petri pulita.

2. Deposizione evaporativa di perline di polistirolo

1. Per creare la maschera di cristallo colloidale per l'array ZMW, centrifugare 50 μL di 1 μm di diametro, perline di polistirolo non funzionalizzate (2,5% w/v in acqua) a 15.000 x g,25 °C per 5 min.
   NOTA: Prima di pipeggiare le perline, la soluzione stock deve essere brevemente vortice nel caso in cui le perline si siano depositate sul fondo della bottiglia.
2. Scartare il supernatante, lasciando meno acqua rimasta possibile.
   NOTA: L'acqua residua può cambiare le proprietà di evaporazione della resopensione dell'etanolo^39,quindi è accettabile la rimozione di una piccola quantità di perline per rimuovere tutta l'acqua.
3. Rimossare le perline dal passo 2.2 in 50 μL di 1:400 TritonX-100:etanolo solvente. Pipettare su e giù più volte per mescolare accuratamente le perline con il solvente.
   NOTA: TritonX-100:etanolo solvente deve essere sigillato con pellicola di paraffina dopo l'uso e preparato fresco una volta al mese. Le perline tendono ad aderire ai lati di un recipiente di plastica, come un tubo di microcentrifugo, quindi pipetta lungo i lati per garantire che tutte le perline vengano rimescolate.
4. Per impostare una camera di umidità per la deposizione, posizionare 6 piastre di Petri, ognuna con un copripasto, su una panca in linea con coperchi lasciati leggermente socchiusa. In ogni piatto, spostare il coverslip nella regione aperta in modo che i copriparsi siano esposti all'ambiente quando l'umidità aumenta nel passaggio successivo.
5. Posizionare un igrometro e un piccolo ventilatore elettrico centrato dietro le piastre di Petri.
6. Registrare l'umidità relativa iniziale (RH) in laboratorio. Riempire un becher da 200 mL con 150−200 mL di ~75 °C di acqua e posizionarlo dietro il ventilatore.
7. Accendere il ventilatore e coprire le piastre di Petri, il ventilatore, il becher e l'igrometro con un contenitore di stoccaggio in plastica rovesciato e trasparente (66 cm x 46 cm x 38 cm).
8. Lasciare che l'RH nella camera sali al 70−75%, che in genere richiede 5−10 min.
   NOTA: Se il laboratorio ambientale RH è basso (inferiore a ~50%), lasciare che la camera raggiunga un RH più alto, ma non superiore all'80%, per compensare la perdita di umidità durante la deposizione (vedi sotto).
9. Quando l'RH raggiunge il 70−75%, registrare la RH e sollevare leggermente il contenitore di plastica per posizionare rapidamente le coperture sulle piastre di Petri, il che impedisce l'inumuramento esortibile dei copripavimenti.
   NOTA: La temperatura nella camera sarà leggermente più calda della temperatura ambiente, tipicamente 25−26 °C, a causa dell'umidificazione. Se l'umidità è visibile sui coprispasmi, le superfici di vetro sono troppo bagnate. Una scatola portaoggetti commerciale potrebbe semplificare questa parte del protocollo.
10. Lascia che l'RH nella camera continui a salire all'85%. A quel punto, registrare l'RH nella camera di umidità e pipettare 5 μL della sospensione del tallone al centro di ogni coverlip.
11. Chiudere la camera e le piastre di Petri dopo ogni deposizione per ridurre al minimo la perdita di umidità. Mira a finire tutte e 6 le deposizioni entro 2 minuti.
12. Registrare l'RH nella camera dopo la deposizione.
    NOTA: La deposizione rh dopo la deposizione aiuterà a misurare la velocità con cui l'umidità è stata persa durante la deposizione, che dipende dalle condizioni del laboratorio ambientale. Per una tipica corsa di successo, la camera inizierà all'85% di RH prima della deposizione e terminerà al 70−75% di RH dopo la deposizione.
13. Lasciare che le goccioline di perline si diffondano e si asciughino per 5 minuti.
    NOTA: Se i cristalli colloidali hanno molti fori o regioni multistrato, la camera era probabilmente troppo umida o asciutta, rispettivamente. Regolare l'umidità relativa alla quale chiudere le piastre di Petri e iniziare le deposizioni (vedi la sezione risultati per ulteriori discussioni sull'ottimizzazione).

3. Ricottura delle perline per ridurre le dimensioni dei pori nel modello di cristallo colloidale

1. Per fornire una superficie di temperatura uniforme per la ricottura delle perline di polistirolo, che restringe gli interstizi tra perline e arrotonda gli angoli degli interstizi, posizionare una piastra di alluminio piatta e fresata sopra una piastra calda in ceramica standard.
2. Impostare la temperatura della piastra calda su 107 °C, la temperatura di transizione del vetro del polistirolo⁴⁰.
   NOTA: Per ottenere una temperatura stabile e accurata, una sonda termocopia è stata tenuta in un foro largo 2−3 mm e profondo 4−5 mm nella piastra di alluminio.
3. Posizionare un coverslip contenente il modello di perline sulla piastra di alluminio caldo e ricottura per 20 s (vedere la sezione discussione per la spiegazione del tempo di fusione).
4. Dopo il riscaldamento, rimuovere il coverslip dalla piastra di alluminio e posizionarlo prontamente su un'altra superficie in alluminio a temperatura ambiente per raffreddarlo.
   NOTA: È utile che i copripavimenti pendino leggermente sopra il bordo della piastra o mulino canali poco profondi (vedi il video di accompagnamento) nella piastra per facilitare il ritiro dei copripavimenti.

4. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero in alluminio utilizzando il modello di cristallo colloidale

1. Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettrone, depositare 300 nm di rame a 2 Å/s sul modello di cristallo colloidale per generare pali negli interstizi tra le perline.
2. Rimuovere il metallo in eccesso sopra le perline premendo delicatamente la superficie con del nastro adesivo. Sbucciare lentamente il nastro per estrarre il metallo.
   NOTA: Alcune piccole macchie di metallo in eccesso riflettente possono rimanere dopo l'estrazione del nastro, e queste possono spesso essere rimosse da un flusso di gas N_2. Se dopo l'accostamento del nastro rimangono macchie sostanziali di metallo in eccesso riflettente, provare a immergere i modelli in toluene per 2 ore per sciogliere parzialmente le perline di polistirolo. Lavare le coverlips con acqua distillata, asciugare con N₂e ripetere l'estratto del nastro. L'ammollo aggiuntivo non deve sciogliere completamente le perline, poiché le perline aiutano a proteggere i pali dai danni durante l'esercista del nastro.
3. Per sciogliere le perline di polistirolo, posizionare i modelli di perline in toluene e immergersi durante la notte.
   ATTENZIONE: I fumi di toluene possono essere tossici. Lavora con il toluene sotto un cappuccio ben ventilato e indossa dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Il toluene deve essere conservato in armadi ventilati designati per liquidi infiammabili.
4. Dopo l'incubazione del toluene, sciacquare i modelli una volta con cloroformio e due volte con etanolo. Maneggiare accuratamente le coperture a questo punto perché i delicati pali metallici alti 200−300 nm sono ora esposti. Asciugare i modelli con N_{2 e} rimuovere polimeri e contaminanti residui in un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti.
   ATTENZIONE: I fumi cloroformi possono essere tossici. Lavorare con il cloroformio sotto un cappuccio ben ventilato e indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Il cloroformio deve essere conservato in armadi ventilati lontano da altri solventi infiammabili.
5. Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettronico, depositare 3 nm di uno strato di adesione al titanio a 1 Å/s seguito da 100−150 nm di alluminio a 4 Å/s intorno e sopra i pali di rame.
   NOTA: Si può usare rivestimenti più spessi per ottenere guide più profonde e una migliore attenuazione della fluorescenza di fondo, ma questo diminuisce anche la resa dopo aver esposto e dissolto i post nella fase successiva (vedi la sezione discussione).
6. Per sciogliere i pali metallici, immergere le copertine in incisione di rame (a base di acido citrico; Tavola dei materiali) per 2 ore.
   ATTENZIONE: L'incisione metallica può causare ustioni alla pelle. Lavorare con le incisioni sotto una cappa ben ventilata e indossare dispositivi di protezione. Lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione. L'incisione metallica deve essere conservata in armadi ventilati designati per liquidi corrosivi.
7. Risciacquare i copricapo con acqua distillata, asciugare con N₂e lucidare delicatamente la superficie del rivestimento metallico con carta lente per esporre eventuali pali che sono ancora coperti di rivestimento. Riposizionare le coverlips in incisione di rame per altre 2 ore, quindi risciacquare di nuovo con acqua distillata e asciugare con N₂.
   NOTA: le diapositive ZMW devono essere conservate in piastre di Petri coperte e pulite per mantenerle libere da contaminanti.

5. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero oro utilizzando il modello di cristallo colloidale

NOTA: Il metodo per fabbricare ZW d'oro (Figura supplementare 1), che rispecchia il protocollo per fabbricare ZW in alluminio, è fornito in questa sezione.

1. Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettronico, depositare 3 nm di uno strato di adesione al titanio a 1 Å/s seguito da 300 nm di alluminio a 4 Å/s.
2. Rimuovere il metallo in eccesso sopra le perline premendo delicatamente la superficie con del nastro adesivo. Sbucciare lentamente il nastro per estrarre il metallo.
3. Per sciogliere le perline di polistirolo, posizionare i modelli di perline in toluene e immergersi durante la notte.
4. Dopo l'incubazione del toluene, sciacquare i modelli una volta con cloroformio e due volte con etanolo. Asciugare i modelli con N_{2 e rimuovere} i contaminanti polimerici residui in un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti.
5. Utilizzando la deposizione evaporativa del fascio termico o elettronico, depositare 100−150 nm di oro a 5 Å/s intorno e sopra i pali di alluminio.
6. Per sciogliere i pali metallici, immergere le coperture in incisione in alluminio (a base di acido fosforico; Tavola dei materiali) per 1 h.
7. Risciacquare i copricapo con acqua distillata, asciugare con N₂e lucidare delicatamente la superficie del rivestimento metallico con carta lente per esporre eventuali pali che sono ancora coperti di rivestimento. Riposizionare i copricapo in incisione in alluminio per 1 h, quindi risciacquare nuovamente con acqua distillata e asciugare con N₂.
   NOTA: le diapositive ZMW devono essere conservate in piastre di Petri coperte e pulite.

Risultati

L'auto-assemblaggio delle particelle colloidali di polistirolo attraverso la sedimentazione evaporativa (fasi 2.1−2.13) può produrre una serie di risultati poiché richiede il controllo del tasso di evaporazione del solvente. Tuttavia, poiché le deposizioni sono veloci (10−15 minuti per round), la procedura può essere rapidamente ottimizzata per diverse condizioni di laboratorio ambientale. La figura 3A mostra un modello colloidale ben formato dopo la deposizione e l'evaporazione. Macroscopic...

Discussione

Per l'auto-assemblaggio colloidale (sezione del protocollo 2), l'uso di etanolo piuttosto che di acqua come solvente di sospensione accelera il processo di evaporazione in modo che i modelli siano pronti in 2−3 minuti dopo la deposizione piuttosto che 1−2 h come nei metodi^{precedenti 48,49}. Il protocollo di sedimentazione evaporativa qui presentato è anche più semplice dei precedenti protocolli di sedimentazione che richiedono il controllo dell'inclinazione superf...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. Vetrino coprioggetti Pulizia
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin vaso di colorazione in vetro	Fisher Scientific	08-817	Barattolo di colorazione con 8 scanalature e coperchio in vetro stampato
Vetrini coprioggetti	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, rettangolare)
Etanolo	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	idrossido di potassio
Sonicatore	Branson	Z245143	, 5510
2. Deposizione evaporativa di perle di polistirene
Contenitore di stoccaggio trasparente	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Ventilatore da tavolo	O2Cool	FD05001A	Qualsiasi piccolo ventilatore da tavolo (~5 pollici) funzionerà
Bicchiere di vetro	Fisher Scientific	02-555-25B	da 250 mL
	Fisher Scientific	11-661-19
Provette per microcentrifuga	Fisher Scientific	21-402-903	da 1,5 mL
Polysciences		18602-15	1,00 & micro; m di diametro, non funzionalizzato
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Ricottura delle perline per ridurre le dimensioni dei pori nel modello di cristallo colloidale
Piastra in alluminio	Fisher Scientific	AA11062RY	Personalizzato internamente a 14 cm x 14 cm
Piastra riscaldante in ceramica	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8,2 x 3,8 pollici.
Regolatore di temperatura	McMaster-Carr	38615K71	Lettura della temperatura con sonda a termocoppia
Sonda a termocoppia	McMaster-Carr	9251T93	Tipo K, sonda di superficie
4/5. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero utilizzando il modello di cristallo colloidale
Aluminium etchant	Transene	Type A
Aluminium pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	Per l'evaporazione del fascio di elettroni
Cloroformio	Sigma	288306	1 L
Mordenzante al rame	Transene	49-1
Pellet di rame	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	Per l'evaporazione a fascio di elettroni
Pellet d'oro	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	Per l'evaporazione a fascio di elettroni
Carta per lenti	Thorlabs	MC-5
Detergente al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Nastro adesivo	Graffette	MMM119
Sistema di deposizione di film sottili	Kurt J. Lesker	PVD-75	Il sistema di evaporazione termica da tavolo funzionerà anche
Pellet di titanio	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	Per l'evaporazione a fascio di elettroni
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Software di modellazione multifisica	COMSOL, Inc.
Splitter spettrale Dual View	Photometrics, Inc.