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Articolo metodologico

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

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DOI:

10.3791/61162

⸱

16 settembre 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Center for Skeletal Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Abstract

Le cellule staminali scheletriche periosteali (P-SSC) sono essenziali per il mantenimento e la riparazione ossea per tutta la vita, rendendole un punto focale ideale per lo sviluppo di terapie per migliorare la guarigione delle fratture.  Le cellule periosteali migrano rapidamente verso una lesione per fornire nuovi condrociti e osteoblasti per la guarigione delle fratture. Tradizionalmente, l'efficacia di una citochina per indurre la migrazione cellulare è stata condotta solo in vitro eseguendo un test transwell o scratch. Con i progressi nella microscopia intravitale utilizzando l'eccitazione multifotonica, è stato recentemente scoperto che 1) le P-SSC esprimono il gene migratore CCR5 e 2) il trattamento con il ligando CCR5 noto come CCL5 migliora la guarigione delle fratture e la migrazione delle P-SSC in risposta a CCL5. Questi risultati sono stati acquisiti in tempo reale. Qui è descritto un protocollo per visualizzare la migrazione P-SSC dalla nicchia delle cellule staminali scheletriche di sutura calvariale (SSC) verso una lesione dopo il trattamento con CCL5. Il protocollo descrive in dettaglio la costruzione di un sistema di ritenuta per topo e di un supporto per l'imaging, la preparazione chirurgica della calvaria del topo, l'induzione di un difetto di calvaria e l'acquisizione dell'imaging time-lapse.

Introduzione

La riparazione delle fratture è un processo dinamico e multicellulare che si distingue dallo sviluppo scheletrico embrionale e dal rimodellamento. Durante questo processo, l'induzione di segnali di lesione dal tessuto danneggiato è seguita dal rapido reclutamento, proliferazione e successiva differenziazione delle cellule staminali /progenitrici scheletriche, che sono tutte fondamentali per la stabilità generale e la fissazione delle fratture1. In particolare, le prime fasi della guarigione delle fratture richiedono la formazione di callo molle, che è principalmente attribuita alle cellule residenti periosteali2. Quando le ossa sono ferite, un sottogruppo di cellule periosteali risponde rapidamente e contribuisce a nuovi intermedi cartilagineici differenziati e osteoblasti all'interno del callo3, implicando la presenza di una distinta popolazione di cellule staminali / progenitrici scheletriche all'interno del periostio. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione funzionale delle cellule staminali scheletriche residenti nel periostio (SSC) costituiscono un approccio terapeutico promettente per le malattie degenerative dell'osso e i difetti ossei4.

Si ritiene che le SSC risiedano in più posizioni tissutali, incluso il midollo osseo. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6.  Queste SSC periosteali (P-SSC) possono essere etichettate con marcatori di lignaggio mesenchimale precoce (ad esempio, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante lo sviluppo osseo fetale4,7,8,9,10. Una limitazione significativa di questi singoli modelli di tracciamento del lignaggio genetico è che esiste una sostanziale eterogeneità all'interno delle popolazioni cellulari marcate. Inoltre, non sono in grado di distinguere le SSC etichettate dalla loro progenie in vivo. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo recentemente sviluppato un mouse a doppio reporter (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) per visualizzare distintamente i P-SSC dalle SSC del midollo osseo (BM-SSC)11. Con questo modello, è stato determinato che le P-SSC sono contrassegnate dalla doppia marcatura Mx1+αSMA+, mentre le cellule Mx1+ più differenziate risiedono nel midollo osseo, nelle superfici endosteale e periostale e nelle ossa corticali e trabecolari11,12.

Citochine multiple e fattori di crescita sono noti per regolare il rimodellamento e la riparazione ossea e sono stati testati per il miglioramento della riparazione scheletrica nei difetti critici del segmento1,13. Tuttavia, a causa della complessità cellulare dei modelli di lesione generati attraverso l'interruzione della barriera fisica del compartimento osseo, gli effetti diretti di queste molecole sulla migrazione e l'attivazione endogena di P-SSC durante la guarigione non sono chiari. Le caratteristiche funzionali e le dinamiche migratorie delle SSC sono spesso valutate in vitro eseguendo un test transwell o scratch, in combinazione con citochine o fattori di crescita noti per indurre la migrazione in altre popolazioni cellulari. Pertanto, l'interpretazione dei risultati di questi esperimenti in vitro per l'applicazione nei loro corrispondenti sistemi in vivo è impegnativa. Attualmente, la valutazione in vivo della migrazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche non è tipicamente osservata in tempo reale; piuttosto, viene misurato in punti temporali fissi post-frattura5,7,14,15,16.

Un limite di questo metodo è che la migrazione non viene valutata a livello di singola cella; piuttosto, viene misurato attraverso i cambiamenti nelle popolazioni cellulari. A causa dei recenti progressi nella microscopia intravitale animale vivo e della generazione di topi reporter aggiuntivi, è ora possibile il monitoraggio in vivo delle singole cellule. Utilizzando la microscopia intravitale di animali vivi, abbiamo osservato la distinta migrazione delle P-SSC dalla nicchia di sutura calvariale a una lesione ossea entro 24-48 ore dopo la lesione nei topi Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 è stato recentemente identificato come un meccanismo di regolamentazione che influenza il reclutamento e l'attivazione delle P-SSC durante la risposta precoce all'infortunio. È interessante notare che non è stato rilevato alcuna migrazione P-SSC sostanziale in risposta a un infortunio in tempo reale. Tuttavia, il trattamento di una lesione con CCL5 produce una migrazione robusta e distinta direzionalmente delle P-SSC, che può essere catturata in tempo reale. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una metodologia dettagliata per registrare la migrazione in vivo di P-SSC in tempo reale dopo il trattamento con CCL5.

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Protocollo

Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Baylor College of Medicine's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione del mouse

  1. Incrociare i mouse Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (acquistati dal Jackson Laboratory) con mouse αSMA-GFP (forniti qui dai dottori Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) per generare mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figura 2A).
  2. Per l'induzione mx1-Cre, iniettare topi con 25 mg/kg di pIpC a giorni alterni per 10 giorni.
  3. Irradiare topi con 9,5 Gy 1 giorno prima del trapianto endovenoso di 1 x 106 cellule mononucleate del midollo osseo intero da topi C57BL/6 wild-type (WT-BMT)19.
  4. Dopo 6-8 settimane di recupero, i topi sono sottoposti all'imaging in vivo del protocollo di migrazione cellulare periostale descritto di seguito.
    NOTA: L'irradiazione e il WT-BMT dei topi Mx1-Cre sono necessari per eliminare le cellule ematopoietiche marcate endogenamente mx1 che possono rispondere a una lesione. Da sei a otto settimane dopo l'irradiazione, il numero di cellule ematopoietiche dell'ospite è al <5% e quindi pronto per l'imaging19.

2. Sistema di ritenuta del mouse e supporto per immagini

  1. Creare un sistema di ritenuta per mouse con un tubo conico da 50 ml (Figura 1A).
    1. Usando le forbici appuntite, fai un buco attraverso il fondo della conica. Tagliare dal foro inferiore alla parte superiore della conica (il lato tagliato sarà la parte superiore del sistema di ritenuta).
    2. Effettuare un taglio lungo circa 4-5 cm parallelo al taglio precedente e a metà strada (~ 2 cm) dalla parte superiore del sistema di ritenuta. Rimuovere questa sezione della conica e lisciare i bordi erano necessari.
  2. Costruire un supporto per imaging a tubo conico utilizzando una piastra angolare regolabile, un palo ottico da 0,5" e un morsetto ad angolo retto per il palo da 0,5", esagonale da 0,1875" (Figura 1B e Tabella dei materiali).
    1. Regolare la piastra angolare su un angolo di 35°. Sul lato sinistro della piastra angolare, avvitare il palo ottico nel secondo foro dal retro della piastra.
    2. Sul lato destro della piastra regolabile, inserire una vite a molla da 0,1875 "con bloccaggio esagonale da 0,25" nel secondo foro dalla parte anteriore e negli ultimi fori sulla piastra. Il morsetto ad angolo retto verrà utilizzato con il montante ottico per fissare il sistema di ritenuta conica del mouse in posizione.

3. Procedura chirurgica preoperatoria

  1. Anestesia del topo
    1. Per la gestione del dolore, iniettare per via sottocutanea il topo con buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg di peso corporeo) 30-60 minuti prima dell'intervento chirurgico.
    2. Anestetizzare i topi utilizzando l'anestesia di combinazione CCM III (combo III) contenente 37,5 mg / mL di ketamina, 1,9 mg / mL di xilazina e 0,37 mg / mL di acepromazina. Il dosaggio appropriato per i topi è 0,75-1,50 ml per 1 kg di peso corporeo. La dose durerà 30-45 minuti.
    3. Una volta che il topo è anestetizzato, applicare un unguento oftalmico agli occhi con un batuffolo di cotone sterile per prevenire la disidratazione degli occhi.
    4. Per l'imaging a lungo termine (>45 min), somministrare nuovamente l'anestesia per mantenere una corretta profondità anestetica come segue.
      1. Preparare una siringa da 1 mL con una quantità sufficiente di combo III per mantenere l'anestesia per la durata di imaging pianificata (0,75 ml/kg di peso corporeo per 30 minuti di sedazione aggiuntiva). Attaccare un set per infusione con ago a farfalla da 25 G con tubo da 12" alla siringa e spingere l'anestetico attraverso il tubo e l'ago.
      2. Inserire l'ago a farfalla per via intraperitoneale, quindi fissare l'ago in posizione.
        NOTA: questo è il modo in cui la combo III aggiuntiva verrà somministrata durante l'imaging in modo tale che non sia necessario spostare l'animale o interrompere il piano visivo.
    5. Fornire supporto termico con una piastra riscaldante mantenuta a 37 ° C durante tutta la procedura. Per l'imaging prolungato (>1 ora) sarà necessario un ulteriore supporto fluido.  I liquidi supplementari possono essere forniti I.P. con Combo III aggiuntivo durante l'imaging o 33 ml / kg di soluzione salina (0,9 NaCl) per via sottocutanea.
  2. Contenimento del topo e preparazione del sito chirurgico
    1. Usa i tagliacapelli per rimuovere quanti più peli possibili dalla parte superiore della testa. Applicare la crema depilatoria sulla zona rasata per rimuovere eventuali peli rimanenti nel sito chirurgico.
    2. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato da una mancanza di risposta ai pizzichi delle dita dei piedi. Dopo 15 minuti, se il topo non è completamente anestetizzato, somministrare una seconda dose più piccola di combo III (<0,75 ml/kg di peso corporeo).
    3. Posiziona il mouse nella coda di ritenuta, facendolo scorrere abbastanza indietro in modo che il naso penda leggermente sul bordo del conico.
    4. Fissare le zampe anteriori sul fondo del tubo conico usando del nastro medico.
    5. Posizionare il tubo conico con il mouse su un supporto per immagini impostato con un angolo di 35° e fissarlo utilizzando il morsetto ad angolo retto (Figura 1C).
    6. Una volta che il mouse è al sicuro nel supporto per imaging, pulire il sito chirurgico 3 volte con scrub alternati di betadine scrub e alcool isopropilico al 70%. Ancora una volta, controlla che l'animale sia completamente sedato.
    7. Spostare il mouse su un pad assorbente pulito e posizionare un drappo sopra il mouse per creare un grande campo sterile.

4. Procedura chirurgica

  1. Incisione di apertura
    1. Usando una pinza a punta fine, raccogliere la pelle immediatamente mediale all'orecchio destro. Con le forbici da microdissezione, tagliare la pelle trattenuta dalla pinza.
      NOTA: l'avvio dell'incisione con il metodo sopra descritto crea un'incisione arrotondata che è più adatta per la sutura dopo la procedura.
    2. Fare un'incisione trasversale a partire dall'incisione iniziale verso l'orecchio sinistro (<1 cm).  Fai un'altra incisione, a partire dall'incisione iniziale, verso il naso dell'animale (~ 2-3 mm oltre l'occhio destro).
    3. Separare la pelle dal periostio usando la pinza e le forbici per tagliare delicatamente il tessuto connettivo separando la pelle dalla calvaria periostio.
    4. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare un unguento oftalmico sulla parte superiore del lembo della pelle.  Raccogliere delicatamente il lembo della pelle e piegarlo sull'occhio sinistro. L'intersezione delle suture sagittale e coronale deve essere chiaramente esposta (Figura 1E).
      NOTA: L'unguento oftalmico viene utilizzato per mantenere il lembo della pelle in posizione.
    5. Lavare la superficie aperta con PBS sterile per pulire l'area di sangue e capelli residui.
      NOTA: Se necessario, utilizzare una pinza a punta fine per rimuovere i peli che rimangono dopo il lavaggio, ma fare attenzione a non danneggiare il periostio.
  2. Microfrattura
    1. Per generare microfratture sulla calvaria, rimuovere lo stantuffo di una siringa da insulina da 29 G e tagliare l'estremità posteriore della siringa, intorno ai segni di 300-400 uL.
      NOTA: questo passaggio semplifica la manovra sotto un ambito di dissezione quando si produce la lesione.
    2. Posizionare la punta di una smussatura (da una a due larghezze dell'ago) verso il naso dalla sutura coronale e una o due larghezze dell'ago a destra della sutura sagittale (Figura 1E).
    3. Ruotare delicatamente la siringa in senso orario, quindi in senso antiorario più volte.
      NOTA: nei topi giovani, è necessaria una quantità molto piccola di pressione verso il basso per creare una microfrattura circolare. Fare attenzione a non lasciare che l'ago penetri nel cervello, in quanto ciò causerà sanguinamento e interferirà con l'imaging.
    4. Utilizzare un ago da 27 G per allargare la microfrattura a ~0,4 mm. Se i frammenti ossei rimangono nella microfrattura, lavare l'area con PBS. Se i frammenti ossei rimangono ancora nella microfrattura, utilizzare l'ago da 29 G per estrarli delicatamente.
    5. Ripetere i passaggi 4.2.1–4.2.4 per creare una lesione sul lato sinistro della sutura sagittale.
      NOTA: A questo punto, ci sono due opzioni: 1) procedere immediatamente al trattamento con CCL5 (paragrafo 4.3) e all'imaging (paragrafo 5); o 2) chiudere il sito chirurgico seguendo le procedure postoperatorie di cui al paragrafo 6. A 24 ore dopo, anestetizzare nuovamente il topo, riaprire la vista chirurgica, trattare la lesione con CCL5 (paragrafo 4.3) ed eseguire l'imaging intravitale (paragrafo 5) e l'assistenza postoperatoria (sezione 6).
  3. Trattamento CCL5
    1. Da uno stock di RANTES (100 ng/mL), fare una soluzione di 10 ng/mL usando la matrice della membrana basale (Tabella dei materiali). Mantenere questa soluzione su ghiaccio per mantenere la matrice in forma liquida.
    2. Trattare ogni lesione con 2 μL di CCL5 (10 ng / μL) utilizzando una pipetta da 2-20 μL (questa punta della pipetta ha un diametro maggiore, che è più efficace quando si utilizza un liquido viscoso). Permettete alla matrice di solidificarsi.
    3. Una volta che la matrice si è solidificata, coprire delicatamente la calvaria con il lembo della pelle per garantire che il tessuto non si disidrati. Incubare per 1 ora prima dell'imaging.

5. Imaging intravitale

  1. Impostazioni del microscopio
    1. Accendere il laser multifotone (laser femtosecondi titanio-zaffiro). Impostare la lunghezza d'onda su 880 nm e regolare la potenza per l'imaging di seconda generazione armonica (SHG) (440 nm) dell'osso.
    2. Accendere i laser a stato solido a 488 nm e 561 nm per l'eccitazione delle cellule che esprimono GFP e tdTomato, rispettivamente.
    3. Attivare i rilevatori PMT (fotomoltiplicatore a tubo) per la seconda generazione armonica (rilevamento 405-455 nm) e GFP (rilevamento 505-550 nm). Accendere il rilevatore HyD 3 per il segnale di pomodoro (rilevamento 590-620 nm).
  2. Montante
    1. Prima di spostare il mouse sull'oscilloscopio, controllare il piano visivo della calvaria premendo delicatamente la parte posteriore della testa del mouse. Se il piano non è in piano, regolare la posizione ruotando delicatamente il sistema di ritenuta del mouse a sinistra o a destra.
      NOTA: questo è un passaggio fondamentale per garantire una qualità dell'immagine sufficiente.
    2. Applicare la metilcellulosa sterile al 2% in acqua (p/v) per coprire l'intera calvaria e il lembo cutaneo e prevenire l'essiccazione del tessuto.
    3. Posizionare il mouse sullo stadio del microscopio motorizzato ad asse XYZ (Figura 1G). Usando la luce epifluorescente, allineare il topo in modo che 1) sia rivolto al microscopio e 2) l'intersezione delle suture coronale e sagittale sia il punto di riferimento centrato dello stadio.
    4. Posizionare il coperchio di vetro sull'area di imaging e ricontrollare l'allineamento (Figura 1H).
  3. Imaging time-lapse
    1. Utilizzare una lente a basso ingrandimento (obiettivo ad immersione in acqua 25x con NA = 0,95) per scansionare la calvaria. Acquisire un'immagine di riferimento dell'intersezione di sutura sagittale e coronale.
    2. Utilizzando l'SHG e i segnali fluorescenti delle cellule, individuare ogni vista della lesione e registrare le coordinate XYZ e le distanze dalle suture sagittali e coronali (Figura 2B).
    3. Scegli una posizione sulle suture coronali o sagittali per l'imaging a lungo termine. Scatta un'immagine Z-stack dettagliata di quest'area dal riferimento durante l'imaging.
      NOTA: Poiché le suture rappresentano una nicchia P-SSC nota, è da qui che le cellule migreranno in risposta alla lesione della calvaria.
    4. Utilizzare le impostazioni del software time-lapse per registrare un'immagine ogni 1 minuto per almeno 1 ora. Nel tempo tra le istantanee, confrontare il campo visivo corrente con il campo visivo iniziale. Se sono diversi, utilizzare l'immagine Z-stack per determinare in quale direzione deve essere regolato il campo visivo.

6. Cura postoperatoria degli animali

  1. Dopo l'imaging, sciacquare la calvaria esposta con PBS sterile per rimuovere la metilcellulosa.
  2. Per chiudere l'incisione, posizionare delicatamente il lembo della pelle sulla calvaria. Utilizzare tamponi di cotone sterili per rimuovere l'unguento oftalmico residuo e asciugare il sito di incisione.
  3. Utilizzando suture non assorbibili in nylon monofilamento taglia 5-0 con un ago da taglio inverso C-1 collegato, chiudere il sito chirurgico. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per applicare un unguento antibiotico triplo all'incisione chiusa.
    NOTA: Le cicatrici sono ridotte con tecniche di sutura di alta qualità e sanguinamento minimo.
  4. Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una superficie calda e controllare ogni 15 minuti fino a quando non si raggiunge la reclinazione sternale.
  5. Somministrare una seconda dose di buprenorfina a rilascio prolungato 72 ore dopo l'intervento chirurgico.
  6. Monitorare quotidianamente il comportamento rannicchiato, la pelliccia arruffata e / o la mancanza di deambulazione fino a quando le suture non vengono rimosse (~ 1 settimana).

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Risultati

È stato proposto che i progenitori scheletrici abbiano un potenziale migratorio o circolatorio20. Recentemente, sono stati generati mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), in cui i P-SSC sono contrassegnati dalla doppia etichettatura Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migrazione sostanziale di Mx1...

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Discussione

Durante la guarigione ossea, le cellule periosteali sono la principale fonte di condrociti e osteoblasti recentemente differenziati all'interno di un callo di lesione3. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6. Valutare le caratteristiche funzionali endogene di P-SSC è tecnicamente impegnativo. Spesso, le dinamiche migratorie delle SSC sono...

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Dichiarazioni

L.C.O. e D.P. divulgano un brevetto in sospeso intitolato "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Bone Disease Program of Texas Award, dal Caroline Wiess Law Fund Award e dal NIAMS del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Ringraziamo M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan nel BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nel BCM Advanced Technology Cores con finanziamenti da NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
½ ” perno otticoThorLabsTR2Per supporto imaging
Siringa da 1 mL309659
ago da 27 GBD PercisionGlide305111
Siringa da insulina da 29 GMcKesson102-SN05C905P
tubo conico da 50 mLFalcon352098Per la contenzione del mouse
Piastra angolare regolabileRenishawR-PCA-5023-50-20Per montaggio imaging
Salviette imbevute di alcolCoviden6818
Scrub chirurgico betadineHenry Schen67618-151-16
Buprenorfina SR-LABZooPharm1mg/mL Combo a rilascio prolungato
IIIOttenuto dal veterinario del personaleN/A37,6 mg/mL Ketamina; 1,9 mg/mL Xilazina; 0,37 mg/mL Acepronazina
Vetrino coprioggettiFisher12-545-8724 x 40 premium superslip
Punte fini forceptsFST11254-20
KetaminaKetaVed50989-161-06100 mg/mL
Leica TCS SP8MP con DM6000CFSLeica MicrosystemsN/A
MatrigelR & D Systems344500101
Nastro medicoMcKesson1001993" x 10 yds (7,6 cm x 9,1 m)
Microscopia elettronicametocellulosaScienze 19560
Forbici per microdissezioneFST1456-12
Tavolino motorizzatoAnaheim automationN/A
Porta aghiFST12500-12
Suture non assorbibiliMcKessonS913BXmonofilamento di nylon 5-0 suture non assorbibili con attaccato C-1 ago da taglio inverso
Unguento oftalmicoRugby0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 &; g/50 µ L
Morsetto ad angolo retto per ½ ” palo, 3/16" HexThorLabsRA90Per montatura a
molla 3/16" Bloccaggio esagonale ¼ ” vite a testa zigrinataThorLabsTS25HPer supporto imaging
Tamponi di cotone steriliHenry Schen100-9249
DPBS sterile (1x)Corning21-030-CV
Teli steriliMcKessen25-517
Guanti chirurgiciMcKessen3158VA
Unguento antibiotico triploTaro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Set per la raccolta del sangue VacutainerBDREF 367298Set per infusione con ago a farfalla da 25G con tubo da 12"
BD di

Riferimenti

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