Descritto qui è un protocollo per studiare come l'estratto di fumo di sigaretta influisce sulla colonizzazione batterica nelle cellule epiteliali polmonari.
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Articolo metodologico
Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fumo di sigaretta è la principale causa eziologica per l'enfisema polmonare e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Il fumo di sigaretta promuove anche la suscettibilità alle infezioni batteriche nel sistema respiratorio. Tuttavia, gli effetti del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari umane devono ancora essere studiati a fondo. Descritto qui è un protocollo dettagliato per la preparazione di estratti di fumo di sigaretta (CSE), il trattamento delle cellule epiteliali polmonari umane con CSE, e l'infezione batterica e la determinazione dell'infezione. CSE è stato preparato con un metodo convenzionale. Le cellule epiteliali polmonari sono state trattate con 4% CSE per 3 cellule trattate con CSE sono state, quindi, infettate da Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I carichi batterici delle cellule sono stati determinati da tre diversi metodi. I risultati hanno mostrato che la CSE ha aumentato il carico di Pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo protocollo, quindi, fornisce un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.
Introduzione
Il fumo di sigaretta influisce sulla salute pubblica di milioni di persone in tutto il mondo. Molte malattie deleterie, tra cui il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono segnalate per essere correlate al fumo disigaretta 1,2. Il fumo di sigaretta aumenta la suscettibilità alle infezioni microbiche acute nel sistemarespiratorio 3,4,5. Inoltre, prove crescenti dimostrano che il fumo di sigaretta migliora la patogenesi di molti disturbicronici 6,
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Protocollo
1. Preparazione 100% CSE
- Disegnare 10 mL di supporti di coltura cellulare senza siero (DMEM/F12 per le cellule BEAS-2B; supporto basale epiteliale delle vie aeree per le cellule HSAEC) in una siringa da 60 mL.
- Attaccare inversamente una punta di pipetta da 1 mL tagliata in modo appropriato all'ugello della siringa come adattatore per contenere la sigaretta (3R4F).
- Rimuovere il filtro della sigaretta. Fissare una sigaretta all'adattatore della punta e bruciare la sigaretta.
- Disegnare 40 mL di aria contenente fumo in 10 mL di supporti senza siero. Mescolare il fumo con il mezzo agitando vigorosamente (30 s per pareggio).
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Risultati
Un diagramma viene utilizzato per illustrare il protocollo nella Figura 1. Le cellule beAS-2B epiteliali polmonari sono state trattate con CSE e sfidate con Pseudomonas. Pseudomonas nel mezzo di coltura sono stati uccisi dalla gentamicina aggiunta e le cellule sono state sottoposte al test della piastra di caduta, rt-qPCR rilevamento di Pseudomonas ribosome 16S RNA, e citometria di flusso. Rispetto al controllo, il trattamento CSE ha notevolmente aumentato l'infezi.......
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Discussione
L'invasione batterica nelle cellule epiteliali polmonari è un passo cruciale nella patogenesi delle infezioni batteriche. Il processo di invasione batterica nelle cellule può essere suddiviso nei seguenti tre passaggi: In primo luogo, i batteri contatto e aderire alla superficie della cellula epiteliale utilizzando il loro flagella. In secondo luogo, i batteri subiscono l'internalizzazione o penetrano nella membrana cellulare. Infine, i batteri replicano e colonizzano le cellule se esfuggono con successo ai meccanismi di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un National Institutes of Health R01 concede HL125435 e HL142997 (a C.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 50 ml | BD Biosciences | ||
| Terreno basale delle cellule epiteliali delle vie aeree | ATCC | PCS-300-030 | |
| Agitatore di batteri | ThermoFisher Scientific | ||
| Kit di crescita delle cellule epiteliali bronchiali | ATCC | PCS-300-040 | |
| Contatore di cellule | Bio-Rad | ||
| CFX96 Sistema | di PCR in tempo realeKIT RNA-DNA ad alta capacità Bio-Rad | ||
| ThermoFisher Scientific 4387406 | |||
| HITES medio | ATCC ATCC | 30-2004 | |
| cellule BEAS-2B UMANE | ATCC ATCC | CRL-9609 | |
| cellule epiteliali primarie umane delle piccole vie aeree | ATCC ATCC | PCS-300-030 | |
| Citometro a flusso LSRII | BD Biosciences | ||
| Microscopio confocale Nikkon | OD Nikkon | ||
| USA Primer scientifici | |||
| per PCR | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC ATCC | 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Sigarette per la ricerca (3R4F) | Università del Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Inserto Transwell in PET Transprent | Corning Costar | ||
| Brodo di soia triptico | BD Biosciences |
Riferimenti
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P.
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Ristampe e permessi
