Descriviamo un metodo affidabile per la preparazione di estratti interi di cellule da lievito o altre cellule utilizzando un congelatore criogenico che riduce al minimo la degradazione e la denaturazione delle proteine. Gli estratti cellulari sono adatti per la purificazione di complessi proteici funzionali, analisi proteomiche, studi di co-immunoprecipitazione e rilevamento di modifiche proteiche labili.
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Articolo metodologico
Preparazione di estratti cellulari mediante criogrinding in un congelatore automatizzato
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La facilità della manipolazione genetica e la forte conservazione evolutiva dei macchinari cellulari eucarioti nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae ne hanno fatto un organismo modello genetico preminente. Tuttavia, poiché un efficiente isolamento proteico dipende da un'interruzione ottimale delle cellule, l'uso del lievito per l'analisi biochimica delle proteine cellulari è ostacolato dalla sua parete cellulare che è costosa da digerire enzimaticamente (usando liticase o zimolyasi) e difficile da interrompere meccanicamente (usando un battitore di perline tradizionale, una pressa francese o un macinino da caffè) senza causare il riscaldamento dei campioni, che a sua volta causa denaturazione e degradazione delle proteine. Sebbene la macinazione manuale di cellule di lievito sotto azoto liquido (LN2)utilizzando malta e pestello eviti il surriscaldamento dei campioni, è ad alta intensità di manodopera e soggetta a variabilità nella lisi cellulare tra operatori. Da molti anni prepariamo con successo estratti di lievito di alta qualità utilizzando il criogrinding delle cellule in un congelatore automatizzato. La temperatura di -196 °C raggiunta con l'uso di LN2 protegge il materiale biologico dalla degradazione mediante proteasi e nucleasi, consentendo il recupero di proteine intatte, acidi nucleici e altre macromolecole. Qui descriviamo questa tecnica in dettaglio per le cellule di lievito in erba che comporta prima il congelamento di una sospensione delle cellule in un tampone di lisi attraverso la sua aggiunta a goccia in LN2 per generare goccioline congelate di cellule note come "popcorn". Questo popcorn viene quindi polverizzato sotto LN2 in un congelatore per generare un estratto "in polvere" congelato che viene scongelato lentamente e chiarificato dalla centrifugazione per rimuovere i detriti insolubili. Gli estratti risultanti sono pronti per applicazioni a valle, come la purificazione di proteine o acidi nucleici, analisi proteomiche o studi di co-immunoprecipitazione. Questa tecnica è ampiamente applicabile per la preparazione di estratti cellulari da una varietà di microrganismi, tessuti vegetali e animali, campioni marini tra cui coralli, nonché per isolare DNA / RNA da campioni fossili forensi e permafrost.
Introduzione
Il lievito è un organismo modello popolare per gli studi sulle proteine, in quanto è un semplice organismo eucariotico con un'abbondanza di strumenti genetici e biochimici disponibili per iricercatori 1. A causa della loro robusta parete cellulare, una sfida che i ricercatori devono affrontare è quella di lysing efficiente le cellule senza danneggiare il contenuto cellulare. Sono disponibili diversi metodi per ottenere estratti proteici attraverso l'interruzione delle cellule di lievito che includono lisi enzimatica (zymolyase)2,3,lisichimica 4,lisi fisica median....
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Protocollo
1. Preparazione dei popcorn di lievito
- Coltivare cellule di lievito in 0,5 L di media YPD ad una densità di 1 x 107 cellule/mL. Contare le celle usando un contatore Coulter o qualsiasi altro mezzo.
- Cellule centrifughe per 10 min a 2.400 g e 4 °C.
- Lavare ogni campione una volta con 500 mL di acqua di 18 mega Ohm Milli-Q deionizzata ghiacciata.
- Pellet di resuspend in 15 mL di tampone di lisi ghiacciato [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerolo, con agente riducente appena aggiunto 10 mM β-mercaptoetanolo, cocktail inibitore della proteasi, inibitore del proteasome da 10 μM MG-132, 1 mM inibitore del....
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Risultati
Abbiamo confrontato due diversi metodi per la lisi cellulare del lievito, vale a dire la fresatura di perline di vetro a 4 °C e un metodo di criogrinding automatizzato a -196 °C, per valutare le proteine di recupero relative negli estratti cellulari preparati con entrambi i metodi. Per questo studio, abbiamo scelto di utilizzare un ceppo di lievito in erba YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221.......
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Discussione
Una limitazione dello studio delle proteine native dal lievito è lalisi inefficiente delle cellule di lievito a causa della loro dura parete cellulare. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi, il metodo più coerente ed efficiente nelle nostre mani è la criogrinding delle cellule di lievito che lampeggiano congelate come popcorn. Questo metodo consente la preparazione affidabile di estratti di cellule intere di alta qualità dal lievito in erba rispetto ad altri metodi dilisi. I risultati rappresentativi hanno dimost.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca nel laboratorio di Gunjan è supportata dai finanziamenti del National Institutes of Health, della National Science Foundation e del Florida Department of Health. Ringraziamo lo studente universitario John Parker per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette in policarbonato da 50 mL con tappo a vite | Provette da centrifuga | Beckman | 357002 |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuga | Beckman | B38624 | Centrifuga ad alta velocità |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotore |
| -(+)-Destrosio Anidro | MP Biomedicals | 901521 | Lievito YPD Componente del terreno |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Rotore a secchiello oscillante |
| Eppendorf Centrifuga refrigerata Eppendorf 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuga refrigerata |
| Glicerolo | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Esclusore di volume e crioprotettore |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Tampone |
| Anticorpo HIS6 | Novagen | 70796 | Anticorpo per HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Sale per il mantenimento della forza ionica |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Inibitore del proteasoma |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi | ThermoFisher Scientific | A32957 | Cocktail di inibitori della fosfatasi |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Cocktail |
| inibitori della proteasi | ThermoFisher Scientific | A32963 | Cocktail di inibitori della proteasi |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Butirrato di sodio | EM Science | BX2165-1 | Inibitore dell'istone deacetilasi |
| Fluoruro di sodio | Sigma-Aldrich | S6521 | Inibitore della fosfatasi |
| Vanadato di sodio | MP Biomedicals | 159664 | Inibitore della fosfatasi |
| Sodio β-glicerofosfato | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Inibitore della fosfatasi |
| Spex Certiprep 6850 mulino congelatore | SPEX Preparazione del campione | 6850 | Mulino congelatore |
| TALON Affinità metallica Resina | BD Biosiences | 635502 | Per l'estrazione di proteine marcate HIS |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Detergente non ionico |
| β-Mercaptoetanolo | AMRESCO | M131-250ML | Agente riducente |
Riferimenti
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D.
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Ristampe e permessi
