Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili utilizzando alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ionica indotta dal canale ionico e la neurotossicità indotta da aggregazioni proteiche, per monitorare e sezionare le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative associate all'età.
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Articolo metodologico
Modellazione di malattie neurodegenerative associate all'età in Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Combattere le patologie neurodegenerative umane e gestire il loro impatto socioeconomico pervasivo sta diventando una priorità globale. Nonostante i loro effetti nocivi sulla qualità della vita umana e sul sistema sanitario, la maggior parte dei disturbi neurodegenerativi umani rimangono ancora incurabili e non prevenibili. Pertanto, lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro tali malattie sta diventando un'urgenza urgente. Il deterioramento associato all'età dei circuiti neuronali e della funzione è evolutivamente conservato in organismi diversi come il verme umile Caenorhabditis elegans e gli esseri umani, che significa somiglianze nei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. C. elegans è un modello genetico altamente malleabile, che offre un sistema nervoso ben caratterizzato, trasparenza del corpo e un repertorio diversificato di tecniche genetiche e di imaging per valutare l'attività neuronale e il controllo della qualità durante l'invecchiamento. Qui, introduciamo e descriviamo metodologie che utilizzano alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ioonizzata indotta dal canale ionico (ad esempio, deg-3(d) e mec-4(d)) e l'aggregazione proteica (ad esempio, la siccoliera e la neurotossicisia indotta dalla poli-glutamata) per sezionare e sezionare le basi cellulari e molecolari. Una combinazione di questi modelli di neurodegenerazione animale, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare porterà a una comprensione senza precedenti della ripartizione della funzione neuronale legata all'età e fornirà informazioni critiche con ampia rilevanza per la salute umana e la qualità della vita.
Introduzione
Negli ultimi due decenni, C. elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i meccanismi molecolari della morte cellulare necrotica. C. elegans offre un sistema nervoso eccezionalmente ben caratterizzato e mappato, una struttura del corpo trasparente e un repertorio diversificato di metodi genetici e di imaging per monitorare la funzione cellulare in vivo e la sopravvivenza durante l'invecchiamento. Così, diversi modelli genetici C. elegans di neurodegenerazione sono già stati sviluppati per valutare la vitalità neuronale. In particolare, i modelli di nematode ben descritti e utilizzati includono la necrosi ioattiva indotta dal canale ionico1,2,3 e la morte cellulare innescata da una maggiore aggregazione proteica4,5,6,7,8,9,10 e colpo di calore11,12, tra gli altri.
L'esposizione a breve termine a temperature subletali ha conferito resistenza contro la morte delle cellule necrotiche, innescata da un successivo stress termico sia nei nematodi che nei neuroni mammiferi11. È interessante notare che il precondizionamento giornaliero dei nematodi a una temperatura elevata lieve protegge dalla neurodegenerazione, che viene inflitta da diversi stimoli, come lo squilibrio ionico (ad esempio, il mec-4(u231) e/o il deg-3 (u662)) e l'aggregazione delle proteine (ad esempio, zo-sinucleina e poliQ40)11,13.
Qui, descriviamo metodologie versatili usando C. elegans per monitorare e valutare la neurodegenerazione dipendente dall'età in modelli consolidati di malattie umane, come la morte cellulare innescata da eccitotossicità, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington. Inoltre, sottolineiamo il ruolo neuroprotettivo del precondizionamento del calore in diversi modelli di neurodegenerazione. Una combinazione di queste tecniche con schermi genetici e/o farmacologici comporterà l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi modulatori di morte cellulare, con potenziale interesse terapeutico.
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Protocollo
1. Morte delle cellule necrotiche indotta da canali ionici iperattivi
NOTA: Mutazioni di guadagno di funzione nella famiglia genica dei degenerins, tra cui mec-4 e deg-3 tra gli altri, provoca la generazione di canali iperattivi che innescano la morte necrotica cellulare di sei neuroni recettori tattili necessari per la meccanoscima nei vermi3. La necrosi indotta dalla stimolazione aberrante dei degenerini mostra diverse somiglianze meccanicistiche e morfologiche con l'eccitotossicità nei mammiferi. Il mantenimento del metabolismo energetico e dell'omeostasi del calcio ha un ruolo cruciale sulla sopravvivenza neuronale durante la necrosi11. I seguenti ceppi possono essere utilizzati per monitorare la morte delle cellule necrotiche innescata da canali ionici iperattivi, mec-4(u231)X e deg-3(u662)V.
- Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di worm mutanti per l'esame della morte delle cellule necrotiche
- Giorno 1: Raccogliere larve L4 di mec-4(u231) o deg-3(u662) nematodi mutanti su Nematode Growth Media (NGM; Tabella 1) piastre seminate con Escherichia coli (OP50) utilizzando uno stereomicroscopio dissettivo.
- Mettere 10 l4 nematodi per piastra NGM di semi e coltivarli alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
- Giorno 5: Lavare le piastre con 1 mL di tampone M9 (Tabella 1) e raccogliere gli animali in un tubo da 1,5 mL.
- Centrifuga a 10.000 x g per 30 s e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di sbiancamento (7 mL di H2O, 1 mL di 5 N NaOH e 2 mL di candeggina).
NOTA: la soluzione di sbiancamento perde gradualmente la sua efficienza; quindi dovrebbe essere preparato ogni giorno. - Vortice e monitorare periodicamente fino a quando i vermi si sono sciolti.
NOTA: Evitare lo sbiancamento per periodi più lunghi di 5 min perché la vitalità degli embrioni ne risentirà. - Centrifuga a 10.000 x g per 30 s e rimuovere il supernatante.
- Lavare due volte il pellet (uova) con 1 mL di tampone M9.
- Dopo il lavaggio, risospendere le uova in un tampone da 200 gradi e incubarle per 25 min a 34 gradi in un bagno d'acqua.
- Mantenere un gruppo separato di campioni di controllo (uova) a 20 gradi centigradi.
- Pipetta 100 - L di controllo o calore uova urto-trattamento e metterli su piastre NGM non seminata. Ogni piatto contiene almeno 100-200 uova.
- Le uova hanno incubato a 20 gradi centigradi fino alla schiusa.
- Montaggio larve L1 per l'esame utilizzando il contrasto di interferenza differenziale (DIC; Nomarsky) microscopia
- Preparare 2% pastiglie di agarose.
- Utilizzare 1 mL di m9 tampone per lavare le piastre e raccogliere nematodi larve L1 in tubi da 1,5 mL.
- Centrifuga a 10.000 x g per 30 s.
- Rimuovere il supernatante e tenere il pellet (nematodi).
- Aggiungere 100 l di 20 mM M9/levamisole tampone per anetizzare i nematodi.
NOTA: Evitare l'azide di sodio come anestetico. L'anice di sodio innesca danni mitocondriali e stress ossidativo che porta alla fine all'induzione della morte cellulare - Pipetta 10 -L di buffer M9/levamisole contenente vermi L1 e montarli su pastiglie di agarose del 2%(tabella 1).
- Posizionare delicatamente un coperchio sulla parte superiore del campione.
NOTA: Sigillare la coverslip con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. - Osservare i vermi usando il contrasto di interferenza differenziale (DIC; Nomarsky) microscopia.
- Punteggio neurodegenerazione dei sei neuroni recettori touch contando le cellule con il caratteristico aspetto vacolato per nematode.
2. Neurodegenerazione indotta da aggregati proteici
NOTA: I seguenti ceppi possono essere utilizzati per studiare la neurotossicità indotta dagli aggregati proteici: (A) sovraespressione della sostanza umana nei neuroni dopaminergici, UA44: È[baIn1; pdat-1s-syn, pdat-1GFP] e (B) sovraespressione della proteina poliglutamina umana (PolyQ) panneuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di nematodi transgenici per il saggio di neurodegenerazione
- Utilizzare uno stereoscopio dissegente per monitorare lo sviluppo e la crescita di C. elegans.
- Giorno 1: Sincronizzare la popolazione di nematodi transgenici raccogliendo e trasferendo 15-20 larve L4 di ogni ceppo su piastre NGM appena OP50.
NOTA: Utilizzare almeno tre piastre di ciascuna deformazione per condizione. - Incubare e lasciare che i nematodi crescano alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
- Giorno 2: Eseguire il precondizionamento giornaliero per 30 minuti trasferendo le piastre in un'incubatrice impostata a 34 gradi centigradi. Quindi, restituire i nematodi precondizionati alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
NOTA: diversi background genetici potrebbero essere sensibili all'alta temperatura per lunghi periodi di esposizione. - (A) Se si studia la sovraespressione dell'uomo di sivinucleina nei neuroni dopaminergici, UA44: È[baIn1; pdat-1- syn, pdat-1GFP]: il giorno 9, monitorare i nematodi transgenici di 7 giorni per la morte delle cellule neuronali dopaminergiche.
- (B) Se si studia la sovraespressione della proteina poliglutamina umana (PolyQ) panneuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: il giorno 5 misura gli aggregati neuronali in poliq nella regione di testa di animali transgenici di 4 giorni che esprimono Q40::YFP.
- Montaggio dei campioni per l'esame microscopico
- Preparare il 2% delle pastiglie di agarose (Tabella 1).
- Aggiungere 10 L di 20 mM M9/levamisole tampone cadere al centro del pad agarose.
- Scegli i rispettivi nematodi transgenici e trasferiscili in una goccia M9/levamisole.
NOTA: Posizionare 20-30 nematodi per goccia. - Posizionare delicatamente un coperchio sulla parte superiore del campione.
NOTA: Sigillare la coverslip con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. - Procedere all'esame microscopico dei rispettivi campioni.
- Processo di acquisizione e analisi dei dati dei nematodi transgenici che coesprimono la gFP di z-sinucleina e citosolica nei neuroni dopaminergici
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza combinato con una telecamera (ad esempio, EVOS FL Auto 2).
- Rileva e acquisisci immagini z-stack della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.
- Salvare e raccogliere le immagini di proiezione di intensità massima.
- Procedere all'analisi delle immagini acquisite.
- Esaminare i vermi transgenici per la neurodegenerazione segnando le seguenti caratteristiche cellulari, (i) perdita di fluorescenza da neuroni che esprimono GFP sotto il promotore di dat-1, (ii) neuroni che mostrano soma e/o blebbing assonale, escresce o perdita dendritica.
- Importare e analizzare i dati utilizzando un pacchetto software (ad esempio Excel).
3. Processo di acquisizione e analisi dei dati di nematodi transgenici che esprimono pan-neuronalmente PolyQ40 fusa con YFP
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza combinato con una telecamera (ad esempio, EVOS FL Auto 2).
- Rileva e acquisisci immagini z-stack della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.
- Salvare e raccogliere le immagini di proiezione di intensità massima.
- Procedere all'analisi delle immagini acquisite utilizzando il software Fiji.
- Aprire le immagini con il programma Fiji14.
- Selezionare il comando Dividi canali tramite il menu a discesa Immagine e colore.
NOTA: mantenere l'immagine del canale verde. - Usate lo strumento di selezione a mano libera per impostare manualmente l'area di interesse fluorescente (ROI; ad esempio, testa).
- Aggiungere il ROI in Gestione ROI tramite il menu a discesa Analizza e strumenti.
- Sottrarre lo sfondo al 50% selezionando Elabora e Sottrai sfondo.
- Impostare e applicare i valori di soglia tramite il comando di menu Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Mantenere e impostare gli stessi valori di soglia durante l'analisi dell'immagine dell'intero esperimento.
- Selezionare il roI rispettivo da Gestione ROI.
- Analizzare il numero di aggregati di proteine utilizzando il comando di menu Analizza e analizza particelle.
- Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,12 per ogni immagine acquisita.
- Copiare i valori di visualizzazione dalla finestra Risultati separata.
- Incollare/importare e analizzare i risultati utilizzando un pacchetto software.
4. Segnalare l'analisi statistica
- Utilizzare almeno 30 nematodi per ogni condizione sperimentale. Eseguire tre repliche biologiche.
- Utilizzare un software di analisi statistica per eseguire il test t-studentesco (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo.
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Risultati
Indotta dalla morte delle cellule necrotiche dai canali ionici iperattivi
Utilizzando le procedure qui presentate, gli embrioni mutanti mec-4(u231) e deg-3u662) sono stati incubati per 25 min a 34 gradi centigradi o mantenuti alla temperatura standard di 20 gradi centigradi. Alla schiusa, il numero di cadaveri di cellule neuronali è stato determinato nella fase larvale L1 di entrambi i gruppi. La morte delle cellule necrotiche è diminuita nei nematodi che si schiudono dalle uova prec...
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Discussione
Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili per la crescita, la sincronizzazione e l'esame microscopico di alcuni modelli versatili di C. elegans che studiano la neurodegenerazione dipendente dall'età. In particolare, valutiamo e seleviamo le basi cellulari e molecolari della ripartizione neuronale legata all'età utilizzando necrosi ionica indotta dal canale iperattivato e neurotossicità indotta da proteine1,2,
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione video e l'editing. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziata da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell'istruzione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Biozima | di agarosio | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Cloruro di calcio disidratato (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Colesterolo | SERVA Elettroforesi | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V o deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Mantenere gli animali a 20 ° C | |
| Microscopio DIC (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Stereomicroscopio da dissezione | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Microscopio a epifluorescenza | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 ceppo | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri parabole (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Fiji | https://fiji.sc | ||
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X o mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Mantenere gli animali a 20 gradi; C | |
| Vetrini per microscopio (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Vetro di copertura del microscopio (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Pacchetto software Excel | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| di agar con terreno di crescita per nematodi (NGM) | |||
| Soluzione madre di nistatina | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| tampone fosfato | |||
| Cloruro di sodio (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Attrezzatura standard per la preparazione di piastre di agar ( autoclave, piastre di Petri, ecc.) | |||
| Attrezzatura standard per la manutenzione dei vermi (plettro in platino, incubatrici, ecc.) | |||
| software di analisi statistica | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | Pacchetto software GraphPad Prism | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisolo cloridrato | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Su richiesta: G. Caldwell (Università dell'Alabama, Tuscaloosa AL) |
Riferimenti
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