Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili utilizzando alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ionica indotta dal canale ionico e la neurotossicità indotta da aggregazioni proteiche, per monitorare e sezionare le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative associate all'età.
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Articolo metodologico
Modellazione di malattie neurodegenerative associate all'età in Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Combattere le patologie neurodegenerative umane e gestire il loro impatto socioeconomico pervasivo sta diventando una priorità globale. Nonostante i loro effetti nocivi sulla qualità della vita umana e sul sistema sanitario, la maggior parte dei disturbi neurodegenerativi umani rimangono ancora incurabili e non prevenibili. Pertanto, lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro tali malattie sta diventando un'urgenza urgente. Il deterioramento associato all'età dei circuiti neuronali e della funzione è evolutivamente conservato in organismi diversi come il verme umile Caenorhabditis elegans e gli esseri umani, che significa somiglianze nei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. C. elegans è un modello genetico altamente malleabile, che offre un sistema nervoso ben caratterizzato, trasparenza del corpo e un repertorio diversificato di tecniche genetiche e di imaging per valutare l'attività neuronale e il controllo della qualità durante l'invecchiamento. Qui, introduciamo e descriviamo metodologie che utilizzano alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ioonizzata indotta dal canale ionico (ad esempio, deg-3(d) e mec-4(d)) e l'aggregazione proteica (ad esempio, la siccoliera e la neurotossicisia indotta dalla poli-glutamata) per sezionare e sezionare le basi cellulari e molecolari. Una combinazione di questi modelli di neurodegenerazione animale, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare porterà a una comprensione senza precedenti della ripartizione della funzione neuronale legata all'età e fornirà informazioni critiche con ampia rilevanza per la salute umana e la qualità della vita.
Introduzione
Negli ultimi due decenni, C. elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i meccanismi molecolari della morte cellulare necrotica. C. elegans offre un sistema nervoso eccezionalmente ben caratterizzato e mappato, una struttura del corpo trasparente e un repertorio diversificato di metodi genetici e di imaging per monitorare la funzione cellulare in vivo e la sopravvivenza durante l'invecchiamento. Così, diversi modelli genetici C. elegans di neurodegenerazione sono già stati sviluppati per valutare la vitalità neuronale. In particolare, i modelli di nematode ben descritti e utilizzati includono la necrosi ioattiv....
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Protocollo
1. Morte delle cellule necrotiche indotta da canali ionici iperattivi
NOTA: Mutazioni di guadagno di funzione nella famiglia genica dei degenerins, tra cui mec-4 e deg-3 tra gli altri, provoca la generazione di canali iperattivi che innescano la morte necrotica cellulare di sei neuroni recettori tattili necessari per la meccanoscima nei vermi3. La necrosi indotta dalla stimolazione aberrante dei degenerini mostra diverse somiglianze meccanicistiche e morfologiche con l'eccitotossicità nei mammiferi. Il mantenimento del metabolismo energetico e dell'omeostasi del calcio ha un ruolo cruciale sulla sopra....
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Risultati
Indotta dalla morte delle cellule necrotiche dai canali ionici iperattivi
Utilizzando le procedure qui presentate, gli embrioni mutanti mec-4(u231) e deg-3u662) sono stati incubati per 25 min a 34 gradi centigradi o mantenuti alla temperatura standard di 20 gradi centigradi. Alla schiusa, il numero di cadaveri di cellule neuronali è stato determinato nella fase larvale L1 di entrambi i gruppi. La morte delle cellule necrotiche è diminuita nei nematodi che si schiudono dalle uova prec.......
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Discussione
Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili per la crescita, la sincronizzazione e l'esame microscopico di alcuni modelli versatili di C. elegans che studiano la neurodegenerazione dipendente dall'età. In particolare, valutiamo e seleviamo le basi cellulari e molecolari della ripartizione neuronale legata all'età utilizzando necrosi ionica indotta dal canale iperattivato e neurotossicità indotta da proteine1,2,
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione video e l'editing. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziata da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell'istruzione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Biozima | di agarosio | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Cloruro di calcio disidratato (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Colesterolo | SERVA Elettroforesi | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V o deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Mantenere gli animali a 20 ° C | |
| Microscopio DIC (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Stereomicroscopio da dissezione | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Microscopio a epifluorescenza | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 ceppo | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri parabole (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Fiji | https://fiji.sc | ||
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X o mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Mantenere gli animali a 20 gradi; C | |
| Vetrini per microscopio (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Vetro di copertura del microscopio (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Pacchetto software Excel | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| di agar con terreno di crescita per nematodi (NGM) | |||
| Soluzione madre di nistatina | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| tampone fosfato | |||
| Cloruro di sodio (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Attrezzatura standard per la preparazione di piastre di agar ( autoclave, piastre di Petri, ecc.) | |||
| Attrezzatura standard per la manutenzione dei vermi (plettro in platino, incubatrici, ecc.) | |||
| software di analisi statistica | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | Pacchetto software GraphPad Prism | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisolo cloridrato | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Su richiesta: G. Caldwell (Università dell'Alabama, Tuscaloosa AL) |
Riferimenti
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....
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Ristampe e permessi
