In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Nereo Kalebic; Barbara Langen; Jussi Helppi; Hiroshi Kawasaki; Wieland  B. Huttner

doi:10.3791/61171

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Articolo metodologico

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

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DOI:

10.3791/61171

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6 maggio 2020

Nereo Kalebic¹^,² , Barbara Langen¹^,³ , Jussi Helppi¹ , Hiroshi Kawasaki⁴ , Wieland B. Huttner¹

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²Human Technopole, ³Landesdirektion Sachsen, ⁴Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

Abstract

La manipolazione dell'espressione genica in vivo durante lo sviluppo embrionale è il metodo di scelta quando si analizza il ruolo dei singoli geni durante lo sviluppo dei mammiferi. In utero l'elettroporazione è una tecnica chiave per la manipolazione dell'espressione genica nel cervello di mammifero embrionale in vivo. Qui viene presentato un protocollo per l'elettroporazione in utero della neocorteccia embrionale dei furetti, un piccolo carnivoro. Il furetto è sempre più utilizzato come modello per lo sviluppo della neocorteccia, perché la sua neocorteccia presenta una serie di caratteristiche anatomiche, istologiche, cellulari e molecolari che sono presenti anche nei primati umani e non umani, ma assenti nei modelli di roditori, come il topo o il ratto. In utero l'elettroporazione è stata eseguita al giorno embrionale (E) 33, uno stadio di midneurogenesi in furetto. Nell'elettroporazione in utero si rivolge alle cellule progenitrici neurali che rivestono i ventricoli successivi del cervello. Durante la neurogenesi, queste cellule progenitrici danno origine a tutti gli altri tipi di cellule neurali. Questo lavoro mostra risultati rappresentativi e analisi all'E37, giorno postnatale (P) 1 e P16, corrispondenti rispettivamente a 4, 9 e 24 giorni dopo l'elettroporazione in utero. Nelle fasi iniziali, la progenie delle cellule mirate è costituita principalmente da vari sottotipi di progenitori neurali, mentre nelle fasi successive la maggior parte delle cellule etichettate sono neuroni postmitotici. Così, in utero l'elettroporazione consente lo studio dell'effetto della manipolazione genetica sulle caratteristiche cellulari e molecolari di vari tipi di cellule neurali. Attraverso il suo effetto su varie popolazioni cellulari, in utero l'elettroporazione può essere utilizzata anche per la manipolazione delle caratteristiche istologiche e anatomiche della neocorteccia del furetto. È importante sottolineare che tutti questi effetti sono acuti e vengono eseguiti con una specificità spatiotemporale determinata dall'utente.

Introduzione

La neocorteccia è il foglio esterno del cervello dei mammiferi e la sede delle funzioni cognitive superiori¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Per ottenere una manipolazione genetica acuta nella neocorteccia di mammifero in vivo durante lo sviluppo embrionale, sono stati esplorati due diversi metodi: l'infezione virale⁶ e l'elettroporazione utero⁷. Entrambi i metodi consentono un targeting efficiente delle cellule neocorticali, ma soffrono di alcune limitazioni. Il principale vantaggi....