Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare in Glomerulonephritis

Summary

Il DNA extracellulare (ecDNA) rilasciato durante la morte cellulare è infiammatorio e contribuisce all'infiammazione. La misurazione dell'ecDNA nel sito della lesione può determinare l'efficacia del trattamento terapeutico nell'organo bersaglio. Questo protocollo descrive l'uso di uno strumento di apprendimento automatico per automatizzare la misurazione dell'ecDNA nel tessuto renale.

Abstract

La morte delle cellule glomeriari è una caratteristica patologica della mieloperossia anti-neutrofia anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV). L'acido deossiribonucleico extracellulare (ecDNA) viene rilasciato durante diverse forme di morte cellulare, tra cui apoptosi, necrosi, necrotosi, trappole extracellulari neutrofiche (NET) e piroptosi. La misurazione di questa morte cellulare richiede molto tempo con diversi biomarcatori necessari per identificare le diverse forme biochimiche di morte cellulare. La misurazione dell'ecDNA è generalmente condotta nel siero e nelle urine come surrogato per danni renali, non nell'organo bersaglio effettivo in cui si verifica la lesione patologica. L'attuale difficoltà nello studio dell'ecDNA nel rene è la mancanza di metodi per formalina tessuto incorporato di paraffina fissa (FFPE) sia sperimentalmente che in biopsie renali umane archiviate. Questo protocollo fornisce un riepilogo dei passaggi necessari per macchiare l'ecDNA nel tessuto FFPE (sia umano che murino), dissetare l'autofluorescenza e misurare l'ecDNA nelle immagini risultanti utilizzando uno strumento di apprendimento automatico dal plugin Weka addestrabile a livello di immagine pubblicamente disponibile. La segmentazione Weka addestrabile viene applicata all'ecDNA all'interno del glomeruli dove il programma impara a classificare l'ecDNA. Questo classificatore viene applicato alle successive immagini renali acquisite, riducendo la necessità di annotazioni manuali di ogni singola immagine. L'adattabilità della segmentazione trainabile di Weka è ulteriormente dimostrata nel tessuto renale da glomerulofoftite sperimentale (GN), per identificare NET ed ecMPO, contributori patologici comuni all'anti-MPO GN. Questo metodo fornisce un'analisi oggettiva dell'ecDNA nel tessuto renale che dimostra chiaramente l'efficacia in cui il programma di segmentazione Weka trainingable può distinguere l'ecDNA tra tessuto renale normale sano e tessuto renale malato. Questo protocollo può essere facilmente adattato per identificare ecDNA, NET ed ecMPO in altri organi.

Introduction

La mieloperossia anti-neutrofila anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV) è una malattia autoimmune che si traduce in insufficienza renale da lesioni glomeriula patologiche con notevole morte cellulare e rilascio di acido deossiribonucleico (DNA)^1,2. Il DNA può attivare il sistema immunitario agendo come un segnale di pericolo. In condizioni di salute normali, la posizione nucleare del DNA offre protezione dall'esposizione al sistema immunitario. L'autoDNA che viene rilasciato extracellulare durante i processi patogeni o l'autoimmunità è visto dal sistema immunitario come un potente danno proinfiammatorio a....

Protocol

Questo metodo consente il rilevamento di pan ecDNA da tutte le forme di morte cellulare. Lo stesso metodo e gli anticorpi sono utilizzati per il tessuto di biopsia renale umana (dal punto 4). Tutti i soggetti animali e umani hanno avuto l'approvazione etica dalla Monash University, e Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Colorazione per l'ecDNA con DAPI e

1. Indurre un modello di 20 giorni di anti-mieloperoxidase glomerulofritis (anti-MPO-GN) in 8-10 settimana vecchi topi C57/Bl6, con controlli⁹.
   1. Eutanasia i topi umanamente utilizzando una camera di CO_2.
   2. Rimuovere i reni....

Results

Queste immagini rappresentano i molteplici passaggi necessari per utilizzare con successo la segmentazione Weka addestrabile per ridurre al minimo la misurazione manuale ad alta intensità di lavoro dell'ecDNA nel tessuto renale FFPE color acquaescente da un topo con anti-MPO GN indotta. Questi passaggi sono riepilogati in Figura 1 e Figura 2 con le immagini prese direttamente dal programma di segmentazione Weka, delineando ogni f.......

Discussion

Esistono diversi protocolli che misurano marcatori infiammatori nel siero e nelle urine di entrambi i pazienti e modelli murini di glomerulonephritis. Questo protocollo descritto consente l'analisi dei prodotti di morte cellulare (ecDNA, NET ed ecMPO) all'interno del glomerulus direttamente. I passaggi più importanti in questo protocollo sono la preparazione e l'imaging dei tessuti. Il principale elemento restrittivo dell'uso di un metodo di colorazione fluorescente per l'analisi è l'autofluorescenza del tessuto. Il tess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
albumina sierica bovina	SIGMA	A2153	5% e all'1% sono costituite da PBS, possono essere prodotte alla rinfusa e congelate, scartate una volta scongelate.
Anticorpo ad assorbimento incrociato IgG di pollo di capra (H+L) Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel tuo cocktail di anticorpi
Anticorpo IgG (H+L) di pollo anti topo ad assorbimento incrociato, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel tuo cocktail
di anticorpiPollo anti coniglio IgG (H+L) Anticorpo ad assorbimento incrociato Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Centrifugare in mini centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel cocktail di anticorpi
Pollo sera	SIGMA	C5405	Composto da 1%BSA/PBS
Vetrini coprioggetti 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Questo non è uno spessore standard, progettato per l'uso in microscopia
confocaleEDTA 10mM	SIGMA	E6758	Aggiungere TRIS e EDTA insieme in acqua distillata e pH a 9, per il recupero dell'antigene, può essere preparato in una soluzione 10x
Etanolo 30%, 70% e 100%	Chem Supply	UN1170	Fornito come etanolo non denaturato al 100% - diluire al 30% e al 70% utilizzando acqua distillata
Formaldeide, 4% (10% Formalina tamponata neutra	)TRAJAN	NBF-500	Il rene viene inserito in un tubo da 5 ml contenente 3 ml di formalina per 16 ore a RT, la formalina deve essere utilizzata in una cappa aspirante
Vetrini istologici in vetro- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0 mm	TRAJAN	J3800AM4	L'uso di vetrini rivestiti con carica positiva è essenziale. Si sconsiglia l'uso di poli-L-lisina per il rivestimento di vetrini poiché il tessuto si stacca dai vetrini durante la fase di recupero dell'antigene
Anticorpo MPO anti-umano/topo di capra	R& D	AF3667	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Histosol	Clini CPL	puro HISTOSOL 08	Usato pulito, in contenitori per la colorazione da 200 ml, utilizzare in una cappa aspirante
Penna idrofobica	VECTOR Labs	H-400	Utilizzare per disegnare un cerchio attorno al tessuto renale
Topo anti umano/topo Peptidil arginasi 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Testa laser a scansione confocale Nikon C1 collegata al microscopio invertito Nikon Ti-E	scientifica		e congelamento a meno 80 gradi all'arrivo
Soluzione salina tamponata con fosfato	SIGMA	P38135	0,01 M PB/0,09% NaCl Composizione 5 litri alla volta
Pentola a pressione 6 litri Tefal secure 5 Neo inossidabile	Tefal	GSA-P2530738	Acquistato presso il negozio di articoli per la casa locale
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Applicare le gocce direttamente sul vetrino coprioggetti
Coniglio anti umano/topo Anticorpo Beta actina	ABCAM	ab8227	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Coniglio anti umano/topo Anticorpo H3Cit	ABCAM	ab5103	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Rack di colorazione 24 vetrini	ProScitech	H4465	Il rack di colorazione scelto deve essere in grado di resistere all'ebollizione sotto pressione e all'incubazione in forno a 60 gradi
Sudan Black B	SIGMA 199664		0,3% Aggiungere 3 g in una bottiglia da 1 litro in etanolo al 70%, filtrare e proteggere dalla luce- stabile per 6 mesi a temperatura ambiente
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Aggiungere TRIS e EDTA insieme in acqua distillata e pH a 9, per il recupero dell'antigene, può essere preparato in una soluzione 10x
Xylene	Trajan	XL005/20	Deve essere utilizzato in una cappa aspirante