Articolo metodologico

Quantificazione in vivo del fatturato proteico nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Dendra2 fotoconvertibile

DOI:

10.3791/61196

⸱

13 giugno 2020

 , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui è un protocollo per monitorare la degradazione della proteina huntingtina fusa al fluoroforo fotoconvertibile Dendra2.

Abstract

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Le proteine sono sintetizzate e degradate costantemente all'interno di una cellula per mantenere l'omeostasi. Essere in grado di monitorare la degradazione di una proteina di interesse è fondamentale per comprendere non solo il suo ciclo di vita, ma anche per scoprire gli squilibri nella rete proteostasi. Questo metodo mostra come monitorare la degradazione della proteina huntingtina che causa la malattia. Due versioni di huntingtina fusa a Dendra2 sono espresse nel sistema nervoso C. elegans: una versione fisiologica o una con un tratto espanso e patogeno di glutammine. Dendra2 è una proteina fluorescente fotoconvertibile; su un breve impulso ultravioletto di irradiazione (UV), Dendra2 commuta i suoi spettri di eccitazione/emissione dal verde al rosso. Simile a un esperimento di pulse-chase, il turnover del red-Dendra2 convertito può essere monitorato e quantificato, indipendentemente dall'interferenza da nuovo sintetizzato verde-Dendra2. Utilizzando la microscopia a base confocale e grazie alla trasparenza ottica di C. elegans,è possibile monitorare e quantificare la degradazione della huntingtina-Dendra2 in un organismo vivente e invecchiato. La huntingtina-Dendra2 neuronale è parzialmente degradata subito dopo la conversione e cancellata ulteriormente nel tempo. I sistemi che controllano la degradazione sono carenti in presenza di huntingtina mutata e sono ulteriormente compromessa dall'invecchiamento. I sottotipi neuronali all'interno dello stesso sistema nervoso presentano diverse capacità di turnover per huntingtina-Dendra2. Nel complesso, il monitoraggio di qualsiasi proteina di interesse fusa in Dendra2 può fornire informazioni importanti non solo sul suo degrado e sugli attori della rete proteostasis coinvolti, ma anche sulla sua posizione, traffico e trasporto.

Introduzione

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Il proteoma di un organismo vivente si rinnova costantemente. Le proteine sono continuamente degradate e sintetizzate in base alla domanda fisiologica di una cellula. Alcune proteine vengono rapidamente eliminate, mentre altre sono più vissute. Il monitoraggio delle dinamiche delle proteine è un compito più semplice, più accurato e meno invasivo quando si utilizzano proteine fluorescenti geneticamente codificate (FP). Le FP si formano automaticamente e possono essere fuse in qualsiasi proteina di interesse (POI), ma non richiedono enzimi per piegare o hanno bisogno di cofattori risparmiano perl'ossigeno 1. Una nuova generazione di SP è stata re....

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Protocollo

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1. Generazione di C. elegans che esprimono proteina di fusione neuronale Huntingtina-Dendra2

  1. Clonare il gene che codifica il POI in un vettore di espressione nematode (cioè, pPD95_75, Addgene #1494), con l'enzima di restrizione tradizionale digest10, Gibson assembly11,o qualsiasi metodo di scelta. Inserire un promotore per guidare l'espressione in un tessuto desiderato o in una fase di sviluppo desiderata. Inserire il fluoroforo Dendra2 N o C nel telaio con il POI.
  2. Generare C. elegan transgenici che esprimano il costrutto di fusione (ad esempio, tramite microiniezione)

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Risultati

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Due ceppi di nematodi che esprimono il frammento di proteina huntingtina esoneso-1 nel telaio con la proteina fotoconvertibile Dendra2 sono stati ottenuti tramite microiniezione e i plasmidi sono stati mantenuti come un array extracromosomico. Il costrutto di fusione è stato espresso in tutto il sistema nervoso C. elegans dallo sviluppo durante l'invecchiamento. In questo caso, hTT-D2 conteneva il tratto fisiologico di 25 poliglutamine (HTTQ25-D2, Figura 1

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Discussione

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Per comprendere la funzione di una proteina è importante comprenderne la sintesi, la posizione e la degradazione. Con lo sviluppo di FP nuovi, stabili e luminosi, la visualizzazione e il monitoraggio dei POI sono diventati più facili ed efficienti. I PAFP di fusione geneticamente espressi come Dendra2 sono posizionati in modo univoco per studiare la stabilità di un POI. Dopo l'esposizione alla luce viola-blu, Dendra2 si rompe in una posizione precisa all'interno di una triade di aminoacidi conservati. Il fluoroforo subis.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, borsa di dottorato NeuroCure dal Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l'Imaging Core Facility dell'Istituto di ricerca Leibniz per la farmacologia molecolare di Berlino (FMP) per aver fornito l'imaging creato. Inoltre, vorremmo ringraziare Diogo Feleciano che ha stabilito il sistema Dendra2 in laboratorio e ha fornito istruzioni.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM
componente Agarosio, Universal GradeBio & Vendi GmbHBS20.46.500Componente di montaggio della slitta
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677componente NGM
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Vetrini coprioggetto
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27Carl Zeiss AGObiettivo
Fiji/ImageJ 1.52pSoftware di analisiNIH
Levamisolo cloridratoAppliChem GmbHA4341Anestetico
LSM710-ConfoCor3Carl Zeiss AGMicroscopio confocale a scansione laser
Montaggio stereomicroscopioLeica Camera AGMontaggio microscopio
neuronal-HTTQ25-Dendra2questo articoloC. elegans ceppo
neuronal-HTTQ97-Dendra2questo articoloC. elegans ceppo
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50Fonte alimentare di nematodi
Cloruro di sodioCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM componente
Standard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Vetrini
ZEN2010 B SP1Carl Zeiss AGSoftware di acquisizione confocale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov,....

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Protein TurnoverC ElegansDendra2 PhotoconversionConfocal MicroscopyHuntingtin DegradationProteostasis NetworkNeuronal SubtypesLive ImagingFluorescence QuantificationAging Organism

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