Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.
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Articolo metodologico
Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell'elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.
Introduzione
Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazioneapplicabile sul campo 1,2,3. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una....
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Protocollo
1. Preparazione della piastra
- Praticare fori in 24 coperchi di piastre di coltura tissutale bene (4−6 fori per pozzo) utilizzando un trapano domestico con un bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2).
NOTA: Questi fori impediscono la condensa dell'acqua dall'agarosio per accumularsi sul coperchio, dove le zanzare possono deporre le uova. La dimensione standard della femmina Ae. aegypti ("Liverpool" strain) è di ~ 3,11 mm di apertura alare. Si consiglia di ridurre le dimensioni dei fori quando si utilizzano zanzare più piccole per evitare la fuga dalla piastra. - Il giorno prima dell'esperimento di ovideposizione, lavar....
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Risultati
Le zanzare sono state iniettate con dsRNA che prende di mira un trasportatore di ferro candidato (FeT) o un gene di controllo (EGFP), alimentato dal sangue e misurato per la fecondità e la produzione di fertilità utilizzando il metodo della piastra EAgaL, seguendo la procedura sopra descritta.
Le zanzare in cui l'espressione fet è stata silenziata a seguito dell'iniezione di dsRNA hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa (F.......
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Discussione
La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT).
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse per questo studio.
Ringraziamenti
Ringraziamo texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program per il finanziamento. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Adelman per l'aiuto nello sviluppo di questo metodo e suggerimenti durante la stesura del manoscritto, così come i membri del laboratorio Kevin Myles. Ringraziamo anche i recensori e gli editori per il loro aiuto nel migliorare questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,6 mm Φ punta | da trapano in alternativa chiodi riscaldati possono essere utilizzati | ||
| 1000 μ Puntali per pipette L (lunghi) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Thermo Scientific | 930186 | trasparente, a fondo piatto con piastre con coperchio ad anello |
| Agarosio | VWR | 0710-500G | |
| Fotocamera digitale compatta | Computer Olympus | TG-5/TG-6 | |
| (Windows, Mac o Linux) | |||
| Acqua deionizzata | |||
| Fiji (imageJ) software | scaricare da: https://fiji.sc/ | ||
| Pinze | Dumont | pinze affilate possono rompere il corpo della zanzara | |
| Piastre di Petri in vetro | VWR | ||
| Candeggina | |||
| Trapano elettrico | |||
| illuminatore per stereomicroscopio (collo d'oca) | |||
| Pipetta P-1000 | Pennelli | ||
| Elastici | |||
| Scheda | per registrare immagini di fotocamere digitali (DSHC, SDXC dovrebbe essere migliore) | ||
| Software per fogli di calcolo (Microsoft Excel) | Microsoft | Qualsiasi software per fogli di calcolo funziona | |
| TetraMin cibo per pesci | Tetra | macinato con macinacaffè, frullatore o mortaio e pestello | |
| Pipette di trasferimento | VWR | 16011-188 |
Riferimenti
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti....
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Ristampe e permessi
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