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Articolo metodologico

Modello di onda d'esplosione a bassa intensità per la valutazione preclinica della lesione cerebrale traumatica lieve a testa chiusa nei roditori

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DOI:

10.3791/61244

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6 novembre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geriatrics Research Education and Clinical Center, Veterans Affairs, 2Division of Gerontology and Geriatric Medicine, University of Washington, 3Department of Neurosurgery, University of Florida, 4Department of Neurosurgery, West Virginia University, 5Division of Pharmaceutical Sciences, University of Cincinnati, 6Central Illinois Neuro Health Sciences, Bloomington, IL, 7Neuro-research, Dallas, TX

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo qui un protocollo di un modello di onda d'urto per i roditori per studiare gli effetti neurobiologici e fisiopatologici di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate. Abbiamo stabilito una configurazione da banco a gas dotata di sensori di pressione che consentono una generazione affidabile e riproducibile di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate indotte da esplosioni.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica su larga scala. Il TBI lieve è la forma più diffusa di neurotrauma e rappresenta un gran numero di visite mediche negli Stati Uniti. Attualmente non ci sono trattamenti approvati dalla FDA disponibili per TBI. L'aumento dell'incidenza di TBI militari e indotti da blasti accentua ulteriormente l'urgente necessità di trattamenti TBI efficaci. Pertanto, nuovi modelli animali preclinici di TBI che ricapitolano aspetti del TBI correlato all'esplosione umana faranno progredire notevolmente gli sforzi di ricerca sui processi neurobiologici e fisiopatologici alla base del TBI da lieve a moderato, nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per TBI.

Qui presentiamo un modello affidabile e riproducibile per lo studio degli effetti molecolari, cellulari e comportamentali del TBI indotto da blast da lieve a moderato. Descriviamo un protocollo passo-passo per tbiti lievi a testa chiusa e indotti da esplosioni nei roditori utilizzando una configurazione da banco costituita da un tubo d'urto azionato da gas dotato di sensori di pressione piezoelettrici per garantire condizioni di prova coerenti. I vantaggi della configurazione che abbiamo stabilito sono il suo relativo basso costo, facilità di installazione, facilità d'uso e capacità di throughput elevato. Ulteriori vantaggi di questo modello TBI non invasivo includono la scalabilità della sovrapressione del picco di esplosione e la generazione di risultati riproducibili controllati. La riproducibilità e la rilevanza di questo modello TBI è stata valutata in una serie di applicazioni a valle, tra cui analisi neurobiologiche, neuropatologiche, neurofisiologiche e comportamentali, a supporto dell'uso di questo modello per la caratterizzazione dei processi alla base dell'eziologia del TBI da lieve a moderato.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) rappresenta oltre due milioni di visite ospedaliere ogni anno solo negli Stati Uniti. I TBI lievi comunemente derivanti da incidenti automobilistici, eventi sportivi o cadute rappresentano circa l'80% di tutti i casi di TBI1. Il TBI lieve è considerato la "malattia silenziosa" in quanto i pazienti spesso non manifestano sintomi evidenti nei giorni e nei mesi successivi all'insulto iniziale, ma possono sviluppare gravi complicanze correlate al TBI più tardi nella vita2. Inoltre, il TBI lieve indotto da blast è prevalente tra i membri del servizio militare ed è stato associato a disfunzione cronica del SNC3,4,5,6. A causa della crescente incidenza di TBI7,8 lieve correlato all'esplosione, la modellazione preclinica dei processi neurobiologici e fisiopatologici associati al TBI lieve è quindi diventata un punto focale nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici per TBI.

Storicamente, la ricerca sul TBI si è concentrata principalmente sulle forme gravi di neurotrauma, nonostante il numero relativamente inferiore di casi gravi di TBI umano. Sono stati sviluppati modelli preclinici di roditori per TBI umani gravi, compresi i modelli di impatto corticale controllato (CCI)9,10 e lesioni da percussione fluida (FPI)11, entrambi ben consolidati per produrre effetti fisiopatologici affidabili12,13. Questi modelli hanno gettato le basi per ciò che è noto oggi sulla neuroinfiammazione, la neurodegenerazione e la riparazione neuronale nel TBI. Sebbene sia stata sviluppata una notevole conoscenza della fisiopatologia del TBI, attualmente non sono disponibili trattamenti efficaci approvati dalla FDA per tbi.

Più recentemente, il focus della ricerca TBI è stato ampliato per includere uno spettro più ampio di patologie correlate al TBI con l'obiettivo finale di sviluppare interventi terapeutici efficaci. Tuttavia, sono stati stabiliti pochi modelli preclinici per TBI lieve che hanno mostrato effetti misurabili e solo un piccolo numero di studi ha studiato lo spettro TBI lieve2,14,15. Poiché il TBI lieve rappresenta la grande maggioranza di tutti i casi di TBI, sono urgentemente necessari modelli affidabili di TBI lieve per facilitare la ricerca sull'eziologia e la neuropatofisiologia della condizione umana, al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche.

In collaborazione con ingegneri biomedici e fisici aerospaziali, abbiamo stabilito un modello scalabile di onde d'urto a testa chiusa per TBI da lieve a moderato. Questo modello di roditore preclinico è stato specificamente sviluppato per studiare gli effetti della dinamica della forza, comprese le onde d'urto e il movimento di accelerazione / decelerazione, che sono associati al LIEVE TBI umano ottenuto in combattimenti militari, eventi sportivi, incidenti automobilistici e cadute. Poiché le onde d'urto sono correlate con le dinamiche di forza che causano tbi lieve negli esseri umani, questo modello è stato progettato per produrre una forma d'onda di Friedlander coerente con un impulso, che viene misurato come libbre per pollice quadrato (psi) * millisecondo (ms). Il livello di impulso viene scalato per scendere al di sotto delle curve di letalità polmonare definite per topi e ratti al fine di condurre indagini precliniche16,17,18. Inoltre, questo modello consente di indagare sulle lesioni da colpo di stato e contrecoup dovute alle rapide forze di rotazione della testa dell'animale. Questo tipo di lesione è inerente a diversi tipi di presentazioni cliniche di TBI, comprese quelle osservate sia nella popolazione militare che in quella civile. Pertanto, questo modello versatile si adatta a un'esigenza che comprende più presentazioni cliniche di TBI.

Il modello preclinico qui presentato produce cambiamenti fisiopatologici affidabili e riproducibili associati a TBI clinica lieve, come dimostrato da una serie di studi precedenti17,19,20,21,22,23. Gli studi con questo modello hanno dimostrato che i ratti sottoposti a un'onda d'urto a bassa intensità hanno mostrato neuroinfiammazione, danno assonale, danno microvascolare, cambiamenti biochimici legati a lesioni neuronali e deficit di plasticità a breve termine ed eccitabilità sinaptica19. Tuttavia, questo modello lieve di TBI non ha indotto alcun cambiamento neuropatologico macroscopico, inclusi danni tissutali, emorragie, ematomi e contusioni19 che sono stati comunemente osservati in studi che hanno utilizzato modelli di TBI invasivi da moderati a gravi10,24. Ricerche precedenti19,21,22,23 hanno dimostrato che questo modello preclinico può essere utilizzato per caratterizzare i processi neurobiologici e fisiopatologici alla base dell'eziologia del TBI lieve e moderato17,19,20,21,22,23. Questo modello consente anche di testare nuovi composti e strategie terapeutiche, nonché l'identificazione di nuovi bersagli adatti per lo sviluppo di interventi TBI efficaci19,21,22,23.

Questo modello è stato sviluppato per studiare gli effetti indotti dalle onde d'urto e le forze rotazionali rapide sugli esiti molecolari, cellulari e comportamentali nei roditori. Analogamente al modello di onda d'urto qui presentato, è stato sviluppato un certo numero di modelli preclinici che tentano di ricapitolare TBI da lieve a moderato utilizzando onde di sovrapressione guidate dal gas2,14,17,25,26,27,28. Alcune delle limitazioni di altri modelli includono: l'animale è fissato a una gabbia di rete metallica e la testa è immobilizzata all'impatto; gli organi periferici sono esposti all'onda oltre al cervello, che crea le variabili confondenti del politrauma; e i modelli sono grandi e stazionari, il che limita la modifica e l'adattamento dei parametri critici a migliori condizioni del modello che ricordano il TBI umano.

I vantaggi di questa configurazione del tubo d'urto da banco a gas sono il suo costo relativamente basso per le spese di acquisizione e gestione, nonché la facilità di installazione e utilizzo. Inoltre, la configurazione consente un funzionamento ad alto rendimento e la generazione di onde d'urto riproducibili controllate e risultati in vivo sia nei topi che nei ratti. Al fine di controllare condizioni di prova coerenti (ad esempio, onda d'urto costante e sovrapressione) la configurazione è dotata di sensori di pressione. I vantaggi di questo modello per TBI includono la scalabilità della gravità della lesione e che il TBI lieve viene indotto utilizzando una procedura non invasiva a testa chiusa. La sovrapressione di picco e la successiva lesione cerebrale aumentano con membrane di poliestere più spesse in modo scalabile e coerente17. La capacità di scalare la gravità del TBI attraverso lo spessore della membrana è uno strumento utile per determinare il livello, al quale diventano evidenti specifiche misure di esito (ad esempio, neuroinfiammazione). Fornendo una schermatura protettiva per gli organi periferici, consente anche un'indagine mirata sui meccanismi del TBI lieve evitando o riducendo le variabili confondenti della lesione sistemica, come le lesioni polmonari o toraciche. Inoltre, questa configurazione consente di selezionare la direzione, con cui l'onda d'urto colpisce / penetra nella testa (cioè frontalmente, lateralmente, superiore o inferiore) e quindi possono essere indagati diversi tipi di insulti che inducono TBI. La procedura standard per indurre TBI da lieve a moderata qui descritta impiega l'esposizione laterale per valutare gli effetti della lesione da onda d'urto in combinazione con lesioni da colpo di stato e contrecoup a causa di forze di rotazione rapide. Inoltre, al fine di studiare esclusivamente le lesioni indotte da esplosioni, in questo modello può essere impiegata l'esposizione alle onde d'urto dall'alto verso il basso.

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Protocollo

Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Cincinnati e della West Virginia University. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e sono state eseguite secondo i principi della Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.

1. Installazione della configurazione BLAST TBI

  1. Acquisire tutte le parti di lavoro necessarie per la configurazione, tra cui: tubo d'urto costituito da sezione di azionamento e driver in acciaio, membrana in poliestere, bulloni di fissaggio, sensori di pressione, schermo per tubi in polivinilcloruro (PVC) per proteggere gli organi periferici, linea idraulica ad alta pressione da 9,53 mm e attacchi maschio e femmina a collegamento rapido, regolatore del gas ad alto flusso e una bombola del gas con staffa a parete (vedere Figura 1A, B e Tabella dei Materiali).
    NOTA: Le specifiche della sezione guidata e driver utilizzata qui (vedere Figura 2 e Tabella dei materiali) sono state stabilite per produrre un'onda d'urto in scala di breve durata coerente (vedere Figura 3C, D) per indurre TBI da lieve a moderato nei topi. A tale scopo, è stata selezionata una sezione di driver corta progettata cono (cono di 6 °). La lunghezza e il diametro delle sezioni guidate e driver possono essere modificati per ricercare specificamente la dinamica dell'onda d'urto29,30,31,32, dell'onda di compressione18 o dell'onda d'urto33. Per gli esperimenti con i ratti, le dimensioni del tubo d'urto devono essere adattate per produrre forze comparabili in base ai parametri di ridimensionamento del corpo pertinenti17 (vedere Tabella dei materiali).
  2. Installare le singole parti di lavoro del setup su tavoli di scorrimento della macchina fissati su una superficie stabile e facile da pulire (preferibilmente in acciaio inossidabile per l'uso nei roditori) in uno spazio di laboratorio approvato per esperimenti su animali.
    NOTA: Gli esperimenti sulle onde d'urto producono un notevole livello di rumore; quindi scegli una posizione all'interno dello spazio di laboratorio fonoassorbente, dove il rumore non interferirà con altri esperimenti / gruppi di laboratorio.
    1. Fissare lo scudo del tubo in PVC perpendicolare alla configurazione del tubo d'urto in modo che il corpo del roditore sia completamente coperto e solo la testa sporga.
      NOTA: affinché la procedura standard per indurre TBI da lieve a moderata qui descritta, il centro della testa si trova a 5 cm dalla fine della sezione guidata per i topi.
    2. Bombola del gas a parete in prossimità della configurazione in conformità con OSHA e tutte le altre normative di sicurezza pertinenti.
      NOTA: aria compressa, elio o azoto gassoso sono comunemente usati per generare le onde d'urto dei roditori nei modelli di tubi d'urto dei roditori. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando l'elio, poiché questo gas produce una sovrapressione più elevata per una durata più breve34, consentendo un ridimensionamento appropriato per i soggetti murini.

2. Valutazione della configurazione e delle proprietà delle onde d'urto utilizzando le registrazioni del sensore di pressione.

  1. Preparare il tubo d'urto.
    1. Tagliare con cura la membrana in poliestere senza piegarsi e produrre fessure, al fine di garantire una rottura costante.
    2. Inserire la membrana tra le sezioni guidate e driver. Fissare le sezioni stringendo i bulloni di collegamento.
    3. Verificare che il sistema sia ermetico e che la membrana sia fissata saldamente tra il driver e le sezioni guidate.
    4. Collegare il serbatoio del gas tramite un tubo idraulico ad alta pressione da 9,53 mm e attacchi di collegamento rapido al tubo d'urto
      NOTA: le sezioni driver e motorizzate sono lavorate con tolleranze precise al fine di garantire una tenuta completa della membrana tra le sezioni. Ciò non consente perdite di gas e preclude l'uso di qualsiasi forma di materiale guarnizione/o-ring e consente una maggiore coerenza nella forma d'onda generata.
  2. Installare i sensori di pressione per il monitoraggio delle onde d'urto (vedere Figura 1C).
    1. Posizionare un sensore di pressione nell'area di posizionamento della testa e tre sensori all'uscita del tubo d'urto (vedere figura 1C e 2).
    2. Avviare la registrazione dai sensori di pressione, appena prima dell'esecuzione delle onde d'urto. Registrare i dati dell'onda di pressione a 500.000 fotogrammi al secondo utilizzando un condizionatore di segnale del sensore e una scheda di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: indossare paraorecchie approvati OHSA per garantire un'adeguata protezione dell'udito.
    3. Aprire completamente la valvola principale del serbatoio del gas compresso per consentire al flusso di gas di produrre un improvviso e rapido picco di pressione.
      NOTA: la sovrapressione del gas rompe la membrana di poliestere per rilasciare un'onda d'urto che si trasforma in un'onda di compressione all'interno della sezione guidata ed esce dal tubo nella direzione dell'area di posizionamento della testa.
    4. Spegnere il flusso di gas immediatamente dopo la procedura.
      NOTA: La configurazione può essere dotata di una valvola di ritorno a molla per arrestare automaticamente e rapidamente il flusso di gas.
    5. Analizza le registrazioni delle onde di pressione utilizzando un programma per computer scritto personalizzato per determinare la sovrapressione di picco e i dati del grafico. I dati possono essere rappresentati graficamente con ciascun sensore singolarmente o sovrapposti l'uno sull'altro per dimostrare la planarità dell'onda generata (vedere Figura 3C,D).
      NOTA: l'analisi può essere eseguita tecnicamente utilizzando software più facilmente disponibile, ma a causa dei grandi set di dati, questi programmi hanno lunghi ritardi nella generazione di grafici.
  3. Stabilire condizioni sperimentali adeguate allo scopo dello studio TBI designato e confermare che il modello produce un'onda d'urto coerente con una sovrapressione di picco, durata e misurazione dell'impulso paragonabile a un'onda di Friedlander (vedere figura 3). Verificare questi parametri utilizzando il software per computer di cui sopra.
    1. Calibrare l'impostazione ripetendo i passaggi 2.1.1. al 2.2.5. e utilizzare le registrazioni delle onde di pressione per determinare se la configurazione deve essere regolata (per i dati rappresentativi vedere la Figura 3).
    2. Modificare l'impostazione (se necessario).
      NOTA: le proprietà dell'onda d'urto possono essere regolate con piccole modifiche della configurazione. Ad esempio, la distanza della testa fino alla fine della sezione guidata influisce sulla forza dell'onda d'urto a livello della testa. Lo spessore della membrana in poliestere determina il livello di sovrapressione di picco, con membrane più spesse che aumentano i livelli di picco (vedi Figura 3A,B). Inoltre, la configurazione consente di selezionare la direzione con cui l'onda d'urto colpisce / penetra nella testa (cioè testa-su, lato, sopra o sotto) e quindi diversi aspetti possono essere studiati, come la lesione da onda d'urto da sola o in combinazione con lesioni da colpo di stato e contrecoup a causa di forze rotazionali rapide.
    3. Ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.4 per stabilire le proprietà desiderate dell'onda d'urto (se necessario) e controllare la riproducibilità.
    4. Ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.4 con membrane in poliestere di diverso spessore per valutare la scalabilità del setup (per i dati rappresentativi si veda la Figura 3A,B).

3. Preparazione dell'impostazione sperimentale e induzione di TBI lieve nei roditori

NOTA: Trasferire i roditori nell'area di detenzione da 30 minuti a 1 ora prima dell'inizio degli esperimenti TBI per acclimatarsi. Selezionare l'area di attesa minimamente influenzata dal rumore della procedura.

  1. Preparare tutti i materiali necessari per l'esperimento e controllare la configurazione per una corretta installazione (ad esempio, regolare i parametri in base allo scopo dello studio) (~ 5 - 10 minuti).
    NOTA: la gravità della lesione può essere regolata selezionando lo spessore della membrana in poliestere. Sulla base dei nostri studi, uno spessore di membrana da 25,4 a 102 μm viene utilizzato per TBI da lieve a moderato nei topi35. In precedenza abbiamo utilizzato membrane con uno spessore da 76,2 a 127 μm per produrre TBI da lieve a moderato nei ratti19.
    1. Tagliare con cura la membrana in poliestere, inserirla tra le sezioni guidate e driver e fissarla stringendo i bulloni di collegamento.
    2. Collegare il serbatoio del gas al tubo dell'ammortizzatore attraverso l'uso di raccordi a sgancio rapido. Assicurarsi che la membrana sia fissata saldamente tra il driver e le sezioni guidate.
    3. Posizionare tre sensori di pressione all'uscita del tubo d'urto, a 120° di distanza, per monitorare le proprietà dell'onda d'urto durante l'induzione del TBI come descritto ai punti 2.2.2 e 2.2.5.
    4. Assicurarsi che la distanza dall'estremità dell'apparato del tubo d'urto sia corretta per ogni rispettivo soggetto utilizzando il micrometro installato. Mantenere costante il posizionamento della testa del roditore (cioè posizione, distanza) all'interno degli studi per consentire una valutazione coerente delle lesioni.
      NOTA: Come indicato al punto 1.2.1., è possibile indurre diversi tipi di lesioni selezionando la direzione in cui l'onda d'urto colpisce la testa. Affinché la procedura induca tbi da lieve a moderata qui descritta, il corpo viene posizionato perpendicolarmente al tubo d'urto che l'onda d'urto colpisce il lato della testa. In questo contesto, alla testa è consentita la libera mobilità e quindi è esposta all'onda d'urto e alle forze di rotazione rapida che consentono la generazione di effetti di colpo di stato e contrecoup.
    5. Avviare la registrazione dai sensori di pressione utilizzando l'interfaccia utente grafica (GUI) del software.
  2. Anestesia e posizionamento dei roditori in configurazione
    1. Trasferire i roditori dalla sala di detenzione e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano in ossigeno e mantenere con il 2% di isoflurano in ossigeno per ridurre l'angoscia e il dolore.
      NOTA: assicurarsi che l'animale non risponda al pizzico della punta o della coda prima di procedere. Assicurati che l'induzione dell'anestesia sia coerente per tutti gli animali da esperimento, compresi i controlli fittizi. Questa procedura richiede un basso livello e una breve durata dell'anestesia.
    2. Posizionare il roditore completamente anestetizzato nello scudo del tubo in PVC con ammortizzazione per proteggere gli organi periferici dall'onda d'urto.
      NOTA: i soggetti di controllo sono anestetizzati e posizionati in prossimità del setup, ma non sono direttamente sottoposti all'onda d'urto. Assicurarsi che i comandi siano sottoposti al rumore generato dal tubo d'urto.
    3. Posizionare la testa del roditore all'interno dell'area di posizionamento della testa e sostenerla dal basso, tramite un supporto integrato direttamente nell'apparato di schermatura o una garza. Determinare l'allineamento della testa in base all'anatomia di ogni singolo roditore, con il condilo occipitale allineato con il bordo della schermatura protettiva.
      NOTA: Evitare di dirigere l'onda di pressione direttamente verso il tronco cerebrale per ridurre la mortalità. La lesione al centro respiratorio del tronco cerebrale e del midollo spinale cervicale è nota per contribuire alle anomalie respiratorie e persino alla morte nei modelli di roditori di TBI36,37,38.
  3. Esposizione dei roditori all'onda d'urto.
    1. Aprire rapidamente la valvola principale del serbatoio del gas compresso per produrre un picco di pressione che rompe la membrana e produrre una forte esplosione che conferma la generazione di un'onda di pressione. La membrana sarà visivamente rotta quando rimossa dopo l'esperimento.
      NOTA: una telecamera ad alta velocità può essere utilizzata per catturare gli effetti di colpo e di contrecoup dell'accelerazione rotazionale sperimentata dal roditore per ulteriori analisi.
    2. Spegnere il flusso di gas immediatamente dopo aver sentito l'esplosione.
  4. Recupero dall'esposizione alle onde d'urto
    1. Dopo l'esposizione alle onde d'urto, rimuovere il roditore dall'apparecchio e posizionarlo su una superficie piana direttamente adiacente al tubo d'urto su un lato.
    2. Monitorare i soggetti per determinare il tempo riflesso di raddrizzamento (RRT). Usa un cronometro per registrare il tempo dall'esposizione alle onde d'urto fino a quando non riacquistano il riflesso di raddrizzamento intrinseco. (vedi Figura 4A).
    3. Non appena i soggetti riacquistano il loro riflesso raddrizzante, metterli nella rispettiva gabbia domestica dove vengono monitorati per le reazioni avverse (ad esempio, convulsioni, difficoltà respiratorie, sanguinamento da un orifizio corporeo) per le successive 24 ore.
    4. Dopo il periodo di monitoraggio iniziale, i soggetti possono essere analizzati utilizzando vari saggi biochimici, neuropatologici, neurofisiologici e comportamentali a scelta del ricercatore (vedi sotto).
  5. Preparare la configurazione e lo spazio per il prossimo esperimento.
    1. Configurazione pulita con detergente per rimuovere l'odore.

4. Applicazioni a valle per roditori esposti a onde d'urto/forze di rotazione e controlli

NOTA: In studi precedenti, gli effetti del TBI da lieve a moderato in vari punti temporali dopo l'esposizione a un'onda d'urto e alle forze rotazionali sono stati valutati nei roditori utilizzando applicazioni a valle, tra cui analisi biochimiche, neuropatologiche, neurofisiologiche e comportamentali19.

  1. Analisi biochimiche
    1. In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), prelevare tessuto (ad esempio, cervello, sangue) per l'analisi biochimica utilizzando protocolli standard come descritto19.
    2. Utilizzare il tessuto per l'analisi biochimica (ad esempio, immunoblotting, ELISA, ecc.) per valutare l'effetto del TBI lieve sui processi neurobiologici e fisiopatologici.
  2. Analisi neuropatologica
    1. In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), perfondere i roditori transcardialmente con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% per fissare il tessuto come descritto19.
      NOTA: Alcune applicazioni non sono compatibili con la fissazione della paraformaldeide (ad esempio, colorazione dell'argento, alcuni anticorpi per l'immunoistochimica).
    2. Utilizzare tessuto fisso perfuso per analisi anatomiche, istologiche e molecolari per valutare i cambiamenti neuropatologici associati a TBI lieve, tra cui neuroinfiammazione, neurodegenerazione e cambiamenti neurochimici come descritto19.
  3. Analisi neurofisiologica in fette di cervello
    1. In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), sacrificare i roditori per decapitazione, rimuovere il cervello e preparare fette di cervello come descritto19.
    2. Eseguire registrazioni elettrofisiologiche come descritto19 per valutare l'effetto del TBI lieve sulle proprietà sinaptiche basali e sulla plasticità sinaptica.
  4. Analisi comportamentale
    1. In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), valutare le prestazioni comportamentali, compresa la funzione motoria (ad esempio, campo aperto, rotarod, attività locomotoria; vedere figura 4D) e l'apprendimento e la memoria (ad esempio, condizionamento della paura, labirinto di Barnes, labirinto d'acqua di Morris).

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Risultati

La scalabilità della configurazione delle onde d'urto è stata testata utilizzando tre diversi spessori di membrana, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. I livelli di pressione di picco sono stati valutati nell'area di posizionamento della testa e l'uscita dell'apparato del tubo d'urto utilizzando sensori di pressione piezoelettrici (vedere Figura 1 e Figura 2). Le pressioni di picco aumentano in concordanza con lo spessore della membrana in entrambe le posizioni del sensore (<...

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Discussione

Presentiamo qui un modello preclinico di TBI lieve che è conveniente, facile da configurare ed eseguire e consente risultati sperimentali ad alta produttività, affidabili e riproducibili. Questo modello fornisce una schermatura protettiva agli organi periferici per consentire un'indagine mirata sui meccanismi tbisidi lievi, limitando al contempo le variabili confondenti del danno sistemico. Al contrario, altri modelli di esplosione sono noti per infliggere danni agli organi periferici2,39,40....

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo R. Gettens, N. St. Johns, P. Bennet e J. Robson per il loro contributo allo sviluppo del modello TBI. NARSAD Young Investigator Grants della Brain & Behavior Research Foundation (F.P. e M.J.R.), una borsa di ricerca del Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease (F.P.) e un PhRMA Foundation Award (M.J.R.) hanno sostenuto questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto attraverso borse di studio pre-dottorato dalla American Foundation for Pharmaceutical Education (A.F.L e B.P.L.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo idraulico ad alta pressione 3/8 SAEEaton AeroquipR2-6-6-36MDisponibile da Grainger
3/8 '' Spine femmina a connessione rapidaKarcherKAR 86410440
3/8 '' Spine maschio a connessione rapidaKarcherKAR 86410440
ANY-maze software di tracciamento videoStoelting Co.Software ANY-maze Membrana
Mylar trasparenteePlastics.comPOLYCLR0.003http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; La membrana in Mylar trasparente è venduta in vari spessori. Tutti sono venduti dai fornitori sopra elencati.
Tavolo scorrevole composto (X2)Grizzly IndustrialG5757
Deadman Gas Control Valvola a sferaConeraco Inc.71-502-01"Apollo", Disponibile da Grainger
Driver e sezione guidata (murina)propria progettazione/produzionen/aPer ulteriori informazioni si prega di contattare gli autori
Driver e sezione guidata (rat)propria progettazione/produzionen/aPer ulteriori informazioni si prega di contattare gli autori
Cuffie per le orecchie3M37274Disponibile da Grainger
Regolatore di gas - Hi Flow 3500-600-580Harris3003539
Gas elioAirGasHE 300sono disponibili in varie dimensioni
Sistema per anestesia per inalazionedi ingresso 901806
VetEquip National InstrumentsNI 9223
IsofluraneBaxterNDC 10019-360-40Ordinato dal veterinario
Timer/Cronometro da laboratorioFisher Scientific50-550-352
Labview versione 12.0Software di acquisizione datiNational Instruments
Comparatore/Micrometro magneticoGrizzly IndustrialG9849
MATLABMathWorksSoftware per l'analisi della registrazione della pressione
Regolatore di ossigenoMedlineHCS8725M
PC per l'elaborazione dei datiDell
in polivinilcloruro - 25,4 mmFORMUFITP001FGP-WH-40x3
Sensori di pressionePCB Piezotronics102A05
Ricevitore Chassis USBNational InstrumentsDAQ-9171
Condizionatore di segnaleper sensore PCB Piezotronicsserie
482CTabella di montaggio in acciaio inox NSFGridmannGR06-WT2448
T Maniglia a brugola - 3/16''S& K73310
I serbatoi Modulo Tubi

Riferimenti

  1. Bazarian, J. J., et al. Mild traumatic brain injury in the United States, 1998--2000. Brain Injury. 19 (2), 85-91 (2005).
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