Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Nicholas P. Boyer; Maite Azcorra; Peter Jung; Anthony Brown

doi:10.3791/61264

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Articolo metodologico

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

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DOI:

10.3791/61264

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31 agosto 2020

Nicholas P. Boyer¹ , Maite Azcorra¹^,² , Peter Jung³^,⁴ , Anthony Brown¹

¹Department of Neuroscience, The Ohio State University, ²Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, ³Quantitative Biology Institute, Ohio University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Ohio University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Abstract

I polimeri proteici neurofilamenti si muovono lungo gli assoni nella componente lenta del trasporto assonale a velocità medie di 0,35-3,5 mm al giorno. Fino a poco tempo fa lo studio di questo movimento in situ era possibile solo utilizzando l'etichettatura a impulsi radioisotopica, che permette l'analisi del trasporto assonale in nervi interi con una risoluzione temporale di giorni e una risoluzione spaziale di millimetri. Per studiare il trasporto di neurofilamenti in situ con una risoluzione temporale e spaziale più elevata, abbiamo sviluppato un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime la proteina neurofilamento M etichettata con GFP fotoattivabile nei neuroni. Qui descriviamo i metodi di fluorescenza fotoattivazione impulso-fuga e pulsazione-spread per analizzare il trasporto neurofilamento in assoni mielinati singoli di nervi tibiali da questi topi ex vivo. I segmenti nervosi isolati vengono mantenuti sullo stadio del microscopio per perfusione con salina ossigenata e immagini di microscopia a fluorescenza confocale del disco rotante. La luce viola viene utilizzata per attivare la fluorescenza in una breve finestra assonale. La fluorescenza nelle regioni attivate e fiancheggiate viene analizzata nel tempo, permettendo lo studio del trasporto neurofilamento con risoluzione temporale e spaziale rispettivamente nell'ordine dei minuti e dei micron. La modellazione matematica può essere utilizzata per estrarre i parametri cinetici del trasporto neurofilamento, tra cui la velocità, la distorsione direzionale e il comportamento di pausa dai dati risultanti. I metodi di fuga di impulsi e di diffusione del polso possono anche essere adattati per visualizzare il trasporto di neurofilamenti in altri nervi. Con lo sviluppo di topi transgenici aggiuntivi, questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per immagini e analisi del trasporto assonale di altre proteine citoscheschescheschesche e citosoliche negli assoni.

Introduzione

Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni '70 mediante l'etichettatura radioisotopica a impulsi¹. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell'ordine di millimetri e giorni al meglio². Inoltre, l'etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l'iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fl....