Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

Sommario

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Abstract

Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l'assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l'uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell'immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l'accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L'esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell'esperimento abbassa l'effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l'affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell'analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).

Introduzione

La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell'ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologica^{razionale 1,2,3,}nel tentativo di raggiungere l'integrazione e l'elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza di^{base 4,5,}applicazioni diagnostiche, terapeutiche e^{biotecnologiche 6,7,8,9,}<....

Protocollo

1. Preparazione dei media e della cultura

1. Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente.
   1. . Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H₂O. Sciogliere completamente.
   2. Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C.
2. Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito e 7,5 g di agar Bacto con 0,5 L di sterile H₂O. Autoclave la soluzione a 121 °C per 20 min.
   1. Im....

Risultati

Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L'Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa a.......

Discussione

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l'SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimost.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto di vetro da 35 mm	opaco	P35G-0.170-14-C	spessore corrispondente alla lente del microscopio.
Agarosio	Lonza	5004	LB preparazione
AHL	Induttore Sigma-Aldrich	K3007
Bacto triptone	BD - Becton, Dickinson e compagnia	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotico
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotico
Casamino acidi	BD - Becton, Dickinson e compagnia	223050	soluzione di media minima
eclipse Ti	nikon		microscopio invertito
Glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	soluzione di media minima
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	substrato di media minimo
Immersol 518F	zeiss	44496000000000	olio da immersione
M9 soluzione salina	Soluzione minima per terreni Sigma-Aldrich	M6030
NaCl	Bio-Lab	214010	Preparazione LB
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	nastro per parafilm con substrato minimo
	per supporti Bemis	PM-996	indicato come nastro nel testo
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	substrato per supporti minimi
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	Soluzione multimediale minima
Estratto di lievito	BD - Becton, Dickinson e compagnia	212750	LB preparazione