Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Sommario

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Abstract

I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o osteolitiche / osteoblastiche miste. Queste lesioni compromettono la struttura ossea, aumentano il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che con molti tumori solidi, le cellule tumorali che si sono diffuse alle ossa possono essere la fonte primaria di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. La maggior parte dei modelli murini singeneici o xenograft di tumori ossei primari comportano l'iniezione intra-ossea (ortotopica) di sospensioni di cellule tumorali. Alcuni modelli animali di metastasi scheletriche da tumori solidi dipendono anche dall'iniezione ossea diretta, mentre altri tentano di ricapitolare ulteriori passaggi della cascata metastatica ossea iniettando cellule intravascolarmente o nell'organo del tumore primario. Tuttavia, nessuno di questi modelli sviluppa metastasi ossee in modo affidabile o con un'incidenza del 100%. Inoltre, è stato dimostrato che l'iniezione intraossea diretta di cellule tumorali è associata a una potenziale embolizzazione tumorale del polmone. Queste cellule tumorali emboliche si innestano ma non ricapitolano la cascata metastatica. Abbiamo riportato un modello murino di osteosarcoma in cui frammenti tumorali freschi o crioconservati (costituiti da cellule tumorali più stroma) vengono impiantati direttamente nella tibia prossimale utilizzando una tecnica chirurgica minimamente invasiva. Questi animali hanno sviluppato attecchimento riproducibile, crescita e, nel tempo, osteolisi e metastasi polmonari. Questa tecnica ha la versatilità per essere utilizzata per modellare metastasi ossee tumorali solide e può facilmente impiegare innesti costituiti da uno o più tipi di cellule, cellule geneticamente modificate, xenotrapianti derivati dal paziente e / o cellule marcate che possono essere monitorate mediante imaging ottico o avanzato. Qui, dimostriamo questa tecnica, modellando i tumori ossei primari e le metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso.

Introduzione

I modelli murini di malattie umane e animali stanno diventando sempre più popolari nella ricerca biomedica. L'utilità di usare i topi in questo contesto è che la loro anatomia e fisiologia sono molto simili agli esseri umani. Hanno un periodo di gestazione relativamente breve e un tempo nella vita post-natale per raggiungere la maturità e sono in gran parte associati a un costo relativamente basso e alla facilità di alloggio, sebbene l'aumento dei costi di sviluppo o acquisto sia associato a maggiori gradi di modificazione genetica, immunodeficienza e / o umanizzazione¹. L'uso di ceppi inbred si traduce in una popolazione animale ampiamente uni....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Cambridge, Cambridge, Regno Unito.

1. Preparazione di linee cellulari

1. Coltivare linee cellulari in conformità con i protocolli di coltura cellulare standard del laboratorio per la coltura cellulare tradizionale o l'iniezione nei topi. I protocolli standard utilizzati qui sono la crescita nel terreno di coltura modificato di Eagle di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), L-glutammina e penicillina / streptomicina (di seguito noto come mezzo di crescita completo).
   NO....

Risultati

Un risultato positivo sarebbe associato all'attecchimento del tumore e alla crescita progressiva del tumore nel tempo. A seconda del tipo di tumore, la crescita tumorale intraossea può essere associata a zoppia progressiva degli arti posteriori, ma molti tumori non causano zoppia nonostante i segni di malattia ossea associata. L'attecchimento riuscito è stato documentato con imaging avanzato, per cui ci sarebbero cambiamenti radiografici, μTC o μMRI progressivi nella tibia prossimale associata al fenotipo osseo della lin.......

Discussione

Questo rapporto documenta il nostro modello per creare tumori ossei primari o metastasi ossee dopo l'impianto intratibiale di un allotrapianto tumorale. Riteniamo che ci siano diversi passaggi critici in questo processo. Deve essere stabilito un piano anestetico sicuro sia per l'iniezione sottocutanea della sospensione delle cellule tumorali che per il posizionamento intratibiale dei frammenti tumorali risultanti. Ci dovrebbe essere una preparazione sterile del sito chirurgico sia per la rimozione dell'allotrapianto sott.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#15 lama per bisturi	Henry Schein Ltd.	75614	Nessuno
Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	10578911	Utilizzato per tritare pezzi tumorali. Può essere utilizzato anche per colture cellulari
Linea cellulare di osteosarcoma di Abrams	Non applicabile	Non applicabile	Nessuno
Macchina per anestesia con vaporizzatore di isoflurano e serbatoio/i di	ossigenoVetEquip	901805	Nessuno
Bilancia per animali	Kent Scientific	SCL- 1015	Nessuno
BALB/c mouse nudo (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 settimane di età. Topi maschi o femmine
Cemento osseo	Depuy Synthes	160504	Uso opzionale al posto della cera ossea
Cera ossea	Ethicon	W31G
Buprenorfina	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0,3 mg/ml Soluzione iniettabile per cani e gatti
eutanasia con anidride carbonica	N/A	N/A Deve	essere fornito all'interno della struttura per animali
Incubatore per colture cellulari impostato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica	Heraeus	Vari	Nessuno
Scrub chirurgico alla clorexidina	Vetoquinolo	411412	Nessuno
Cryoviali (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Opzionale se crioconservante frammenti tumorali
D-luciferina (Firefly), sale di potassio	Perkin Elmer	122799	Opzionale se la linea cellulare di interesse ha un gene reporter bioluminescente
Calibro digitale	Mitutoyo	500-181-30	Può essere manuale
Cabina per microradiografia digitale	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Opzionale per valutare la risposta ossea alla crescita tumorale
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Opzionale se i frammenti tumorali crioconservanti
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Nessuno
Etanolo (70%)	Sigma Aldrich	2483	Nessuno
Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientific	26140079	Nessuno
Pincipe, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	Nessuno
Congelatore (– 80 ° C)	Sanyo	MDF-794C	Opzionale se crioconservante o congelante a scatto frammenti tumorali
Emocitometro	Thermo Fisher Scientific	11704939	Può anche utilizzare il contatore automatico di cellule, se disponibile
Aghi ipodermici (calibro 27)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	Può anche utilizzare aghi da 25G (DIS55509) e 30G (Catalogo DIS599)
Ghiaccio	N/A	N/A	Idealmente piccoli pezzi in un contenitore per la conservazione di siringhe e sospensioni cellulari
Forbici dell'iride	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	Nessuno
Isoflurano	Henry Schein Ltd.	1182098	Nessuno
Sistema di imaging a bioluminescenza/fluorescenza IVIS Lumina III	Perkin Elmer	CLS136334	Opzionale se la linea cellulare di interesse ha geni reporter bioluminescenti o fluorescenti
L-glutammina	Thermofisher scientifc	25030081	Nessuno
Azoto liquido	British Oxygen Corporation	NA	Opzionale se crioconservazione o congelamento a scatto di frammenti tumorali
Dewar con azoto liquido, 5 litri Thermo	Fisher Scientific	TY509X1	Opzionale se crioconservante di frammenti tumorali
Matrigel® Matrice GFR, senza LDEV, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Opzionale. Disponibile anche nel formato da 10 ml (354230)
Microcentrifuga	Thermo Fisher Scientific	75002549	Celle a pellet a 1200 giri/min per 5-6 minuti
Contiene di congelamento Mr. Frosty	Fisher Scientific	10110051	Opzionale se crioconservante di frammenti tumorali NAIR
Lozione/olio per la rimozione dei peli	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	In alternativa può utilizzare un tagliacapelli elettrico con lama fine
Penicillina/streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Nessuno
Manico per bisturi, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	Preferenza dell'utente purché accetti la lama del bisturi #15
Tappetino riscaldato per piccoli animali	VetTech	HE006	Nessuno
Stereomicroscopio	GT Vision Ltd.	H600BV1	Nessuno
Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific 10010023		Utilizzare per iniezioni e anche come parte dello scrub chirurgico, in alternanza con clorexidina
Adesivo tissutale (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	In alternativa può utilizzare suture cutanee non assorbibili (misura 6-0)
Blu di tripano	Thermo Fisher Scientific	5250061	Nessuno
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Utilizzare 0,05%-0,25%
Siringa per tubercolina (1 ml con gradazioni di 0,1 ml)	Becton Dickinson	309659	Punta scorrevole preferita rispetto alle
fiasche per colture tissutali ventilate Luer, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Può anche utilizzare palloni più piccoli o più grandi, a seconda delle necessità

opzionale Stazione di