Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Gli animali gnotobiotici hanno dimostrato di essere strumenti inestimabili per gli studi sul microbioma^1,2,3. Gli animali privi di germi e a flora definita hanno permesso di inucidazione delle interazioni ospite-microbo, comprese le risposte immunologiche dell'ospite, la maturazione epiteliale intestinale e il metabolismo ospite^1,4,5,6,7. Gli animali gnotobiotici inoculati con una comunità semplificata hanno anche aiutato in una comprensione più completa delle interazioni microbo-microbo in una comunità intestinale, in particolare nello svelare l'alimentazione incrociata e le relazioni antagonistiche^8,9,10,11. L'attuale sistema modello preferito per gli studi sul microbioma intestinale dei mammiferi è il modello murino. Sebbene questo sistema sia stato vitale nelle scoperte sopra descritte, una lacuna fondamentale è il costo. Attrezzature specializzate e tecnici altamente qualificati sono necessari per stabilire e mantenere una struttura gnotobiotica. Questo, in combinazione con una cura extra che deve essere data ad ogni aspetto del mantenimento degli animali gnotobiotici, fa sì che un animale gnotobiotico costi da dieci a venti volte di più per riprodursi rispetto a un animale standard^{modello 12}. A causa dei costi elevati, molti ricercatori potrebbero non essere in grado di permettersi un modello murino gnotobiotico. Inoltre, mentre i modelli murini possono essere la scelta più ampiamente accettata per gli studi che cercano di tradurre in salute umana, ci sono ancora molte differenze fisiologiche e morfologiche tra budella umana e topo¹³. Chiaramente nessun modello singolare è sufficiente per rispondere al numero sempre crescente di domande riguardanti i molti aspetti del microbioma intestinale.

I modelli di insetti sono un'alternativa più economica a causa del loro minor costo di manutenzione rispetto alle specie di mammiferi. Un'ampia ricerca senza germi e gnotobiotica in una varietà di specie di insetti ha portato allo sviluppo di più modelli comunemente usati. Zanzare e Drosophila sono modelli comuni per il lavoro privo di germi a causa della loro rilevanza per le malattie globali e la trattabilità genetica^14,15. Un altro sistema di modelli emergenti è quello dell'apemellifera ( Apis mellifera), data la sua importanza nella ricerca sull'impollinazione e la^{socialità 16}. Tuttavia, molti di questi insetti comunemente usati mancano della complessità tassonomica osservata nelle comunità intestinali dei mammiferi^17,limitando la loro capacità di modellare interazioni di ordine superiore. Non solo la totale diversità dei microbi trovati nell'intestino degli scarafaggi americani è più simile ai mammiferi, ma molti dei microbi presenti nell'intestino scarafaggio appartengono a famiglie e filla che si trovano comunemente nel microbiota intestinale di mammiferi e umani¹⁸. Il broncio posteriore dello scarafaggio è anche funzionalmente analogo all'intestino crasso dei mammiferi, in quanto è una camera di fermentazione densamente piena di batteri per aiutare nell'estrazione^{dei nutrienti 19,20}. Infine, la natura onnivora degli scarafaggi consente una diversità di regimi dietetici che non sarebbe possibile con gli specialisti dietetici.

Gli scarafaggi americani possono essere un utile sistema modello per comprendere le comunità microbiche intestinali negli organismi superiori, ma lo stato dello scarafaggio come parassita rende anche questo sistema rilevante per il controllo dei parassiti²¹. Sfruttare la conoscenza fondamentale dell'influenza della comunità intestinale sulla salute e la fisiologia degli scarafaggi aiuta a sviluppare nuove tecniche per la gestione dei parassiti.

L'obiettivo di questo metodo è quello di delineare una descrizione completa della creazione e del mantenimento di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana), ma questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare ninfe di qualsiasi scarafaggio oviparo. Include un metodo per una raccolta efficiente e non invasiva di ootece mature e una tecnica non distruttiva per monitorare lo stato gnotobiotico^{degli insetti 22,23,24}. Mentre i precedenti metodi per raggiungere e mantenere gli scarafaggi gnotobiotici descrivono la raccolta di ootheca^{23,24,25,26,27}, la maturità dell'ootheca viene interpretata in termini di spunti specifici per specie (in Blattella germanica^22,24,25), o non esplicitamente descritta^27,28, rendendo difficile l'implementazione per chi non ha familiarità con il sistema. Poiché il metodo qui descritto utilizza ootecae cadute naturalmente, l'errore di rimuovere prematuramente le uova è assente. Questo protocollo contiene metodi di controllo della qualità dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla cultura, e il metodo dipendente dalla coltura non richiede il sacrificio degli insetti. Infine, questo metodo riunisce le informazioni di più studi di scarafaggi gnotobiotici per creare un unico protocollo completo con tutte le informazioni necessarie per raggiungere e mantenere gli scarafaggi gnotobiotici.

1. Preparazione dei materiali

1. Mantenimento delle colture di scarafaggi stock
   NOTA: Ci sono molti modi per allevare questi robusti insetti. Le specifiche sulla fornitura di riparo e acqua possono essere diverse a seconda dei materiali accessibili (ad esempio, cartoni per uova invece di tubi di cartone). Il seguente protocollo di sterilizzazione funzionerà per qualsiasi configurazione del serbatoio di magazzino.
   1. Stendere abbastanza letti in trucioli di legno in un serbatoio di pesce da 37,85 L (10 galloni) per coprire il fondo del serbatoio con circa 1 pollice di biancheria da letto. Preparare l'alloggiamento tagliando il cartone (piatto) a 2 x 4 in pezzi. Inserire pezzi di cartone in tubi di cartone (ad esempio tubi di carta igienica) e impilare i tubi ad un'estremità del serbatoio(figura 1).
   2. Spalmare un sottile strato di vaselina sui primi due pollici dell'interno del serbatoio per evitare la fuga degli insetti.
      NOTA: Assicurarsi di rivestire correttamente l'interno degli angoli del serbatoio.
   3. Aggiungi scarafaggi trasferendo tubi di cartone (occupati) da un precedente serbatoio di magazzino, scuotendoli per rilasciare i loro abitanti. Per ogni trasferimento, spostare 100−200 scarafaggi a età mista e a sesso misto. Aggiungere cibo per cani (20−30 pezzi), monitorare la quantità di cibo per cani nel serbatoio e ricaricare quando è basso.
   4. Alleva un piatto d'acqua.
      1. Riempire un piccolo contenitore di plastica riutilizzabile con acqua distillata doppia (ddH₂O). Tagliare spugne e fori di cellulosa nel coperchio del contenitore del cibo all'incirca della stessa dimensione.
         NOTA: Le spugne di cellulosa impediscono agli scarafaggi di annegare nel piatto d'acqua.
   5. Inserire spugne nei fori nel coperchio e posizionare il coperchio sul contenitore riempito. Posizionare il contenitore nel serbatoio e ricaricare quando è basso. Coprire il serbatoio con un panno di cotone e fissarlo in posizione con una fascia elastica.
   6. Quando i serbatoi iniziano ad accumulare quantità eccessive di frass e carcasse di insetti, imposta nuovi serbatoi e trasferisci scarafaggi.
      NOTA: i carri armati vengono in genere trasferiti ogni 6 mesi. Tutti gli scarafaggi /uova rimanenti nei serbatoi di stoccaggio dismessa vengono eutanasiati congelando a -20 °C per 1 h e il contenuto del serbatoio di stoccaggio viene quindi trasferito in un sacchetto autoclave e autoclavato (1 h, ciclo di gravità) prima dello smaltimento. I serbatoi di magazzino vengono sterilizzati con candeggina al 2% tra un uso e l'altro.
2. Disinfettare un contenitore secondario.
   NOTA: Questo contenitore non include un filtro, ma consente invece lo scambio d'aria gratuito.
   1. Spruzzare l'interno sia del coperchio che del fondo con candeggina al 2% e lasciare in ammollo per 10 minuti. Pulire la candeggina con un tovagliolo di carta pulito.
   2. Spruzzare l'interno del coperchio e del fondo con etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta pulito. Sostituire il coperchio fino all'uso.
3. Fai inclinazioni e fiasche BHI per incubare uova e ospitare ninfe.
   1. Preparare BHI secondo le istruzioni del pacchetto, aggiungendo il 2% di agar. Far bollire la soluzione BHI-agar fino a quando non viene chiarita.
   2. Per le inclinazioni, trasferire aliquote da 5 ml a provette e tappo in vetro da 18 mm x 150 mm. Sterilizzare tramite autoclave (tempo di sterilizzazione = 20 min, ciclo liquido). Posizionare tubi autoclavati con un angolo di 45° per raffreddarsi in inclinazioni. Una volta solidificato, conservare in frigorifero fino all'uso per evitare l'essiccazione.
   3. Per i contenitori, trasferire aliquote da 10 ml di soluzione di agar BHI bollita in mastri Erlenmeyer da 250 mL per coprire completamente il fondo del pallone. Coprire il pallone con un foglio e sterilizzare tramite autoclave (20 min, ciclo liquido). Lasciare raffreddare e raffreddare i contenitori autoclavati fino all'uso per evitare l'essiccazione.
      NOTA: non è necessario alcun filtro dell'aria per questa configurazione. Il coperchio del foglio è sufficiente per consentire lo scambio di gas prevenendo al contempo la contaminazione dal flusso all'aperto.
4. Sterilizzare tramite autoclave: chow di ratto autoclavabile suddiviso in mezze dimensioni (~ pezzi da 1/2 pollice) in un becher coperto di fogli (tempo di sterilizzazione = 1 h, ciclo di gravità), ddH₂O in una bottiglia limitata (tempo di sterilizzazione = 20 minuti, ciclo liquido) e forcep in un becher coperto di fogli (tempo di sterilizzazione = 20 minuti, ciclo di gravità).
   NOTA: Non riempire es oltre il becher chow del ratto. I pellet si gonfieranno nell'autoclave.
5. Alleva un carro armato del "reparto maternità".
   NOTA: Questo serbatoio contiene gli stessi materiali dei serbatoi di stoccaggio (tubi di cartone, piatti d'acqua con spugne, cibo per cani, biancheria da letto a cippato; vedi figura 1) e deve essere vuoto di scarafaggi a meno che non venga trasferito per la raccolta delle ootece (vedi sezione 2).
6. Umidificare un'incubatrice preparando un becher pieno di soluzione di cloruro di sodio supersaturo (NaCl). Preparare questa soluzione aggiungendo 37 g di NaCl per 100 mL di ddH₂O e mescolando fino allo scioglimento.
   NOTA: In genere, 500 mL di soluzione di sale saturo in genere umidificano un incubatore con dimensioni della camera 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) per circa un mese prima di aggiungere più acqua.

2. Raccolta di oothecae

1. Trasferire le femmine (in qualsiasi numero, a maggior dire per gli esperimenti pianificati) che trasportano oothecae (Figura 2) dal serbatoio di stoccaggio al "reparto maternità" utilizzando le forcep per spostare tubi di cartone che contengono femmine gravide.
   1. Se un tubo di carboard contiene più insetti oltre alla femmina gravita, prima scuoti il tubo in un contenitore di plastica aggiuntivo arato con vaselina, quindi incoraggia l'insetto bersaglio a risalire nel solo tubo di cartone.
2. Trasferisci le femmine nel serbatoio di scorta una volta che hanno lasciato cadere le loro oothecae. Recupera le ootece dalla lettiera nel serbatoio con le forcep.
   NOTA: Le oothecae vengono spesso eliminate entro 24 ore dal trasferimento della femmina.

3. Pulizia delle ootecae

1. Aggiungere ootecae a un tubo di centrifuga da 5 ml contenente 3 ml di solfato di dodecil solfato di sodio (SDS). Vortice per 10 s. Ripetere per un secondo passaggio di lavaggio con un tubo di centrifuga contenente SDS fresco.
   NOTA: Possono essere utilizzate fino a cinque ootecae per 3 mL di SDS.
2. Utilizzando una delicata salvietta per compiti, strofinare delicatamente la superficie di ogni ooteca per rimuovere eventuali detriti. È possibile aggiungere più SDS per facilitare una pulizia accurata. Mettere le ootece pulite in una barca di pesatura fino a quando non sono pronte per la sterilizzazione.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui, ma lasciare le ootece in ambienti a bassa umidità per lunghi periodi di tempo (da giorni a settimane) li farà disidratare e perderà vitalità.

4. Sterilizzazione e incubazione delle ootecae

1. Acqua sterile aliquota per risciacquo post-sterilizzazione. Per sterilizzare ogni ooteca, riempire due tubi di centrifuga da 1,5 ml con 1 ml di acqua sterile.
2. Aggiungere 10 μL di concentrato (32%) soluzione di stock di acido peracetico a 3,2 ml di ddH₂O in un tubo di centrifuga da 5 ml per creare una soluzione allo 0,1% per la sterilizzazione. Cappuccio e invertire più volte per mescolare.
   ATTENZIONE: L'acido peracetico è dannoso a contatto con la pelle o i polmoni. Diluire in una cappa dei fumi.
   NOTA: Questo deve essere fatto lo stesso giorno della sterilizzazione. Se diluita in anticipo, la soluzione si decompone rapidamente e quindi non sterilizza correttamente. Fino a cinque ootece pulite possono essere sterilizzate in 3,2 mL di acido diluito.
3. Posizionare (fino a cinque) ootece pulite nella soluzione di acido peracetico allo 0,1% per 5 min. Invertire il tubo più volte ogni 60 s.
4. In una cappa a flusso laminare, utilizzare forcep sterili per trasferire ciascuna ooteca al proprio tubo di centrifuga con acqua di risciacquo sterile aliquota (fase 4.1). Invertire più volte per mescolare. Ripetere per un secondo risciacquo, quindi trasferire ogni ooteca risciacquata sulla propria inclinazione BHI utilizzando forcep sterili.
5. Posizionare le inclinazioni nel contenitore secondario sterilizzato. Spostare il contenitore nell'incubatore umidificato a 30 °C per 4−5 settimane fino alla schiusa.
   NOTA: Le inclinazioni possono essere tenute in posizione verticale da un piccolo porta provetta o da un becher medio/piccolo.
6. Controllare regolarmente le inclinazioni (1−2 volte a settimana). Se la crescita fungina o batterica della colonia appare sull'agar, rimuovere l'inclinazione contaminata. Quando il punto di tempo di quattro settimane si avvicina, controllare le inclinazioni ogni giorno.
   NOTA: Una volta tratteggiate, le ninfe possono sopravvivere fino a diverse settimane solo su BHI ma non cresceranno in modo ottimale.

5. Mantenimento delle ninfe gnotobiotiche

1. In una cappa di flusso laminare, trasferire aseticamente un pellet di chow di ratto sterilizzato in un pallone BHI preparato (dal passo 1.3.3) con forcep sterili. Come controllo di sterilità, posizionare il pallone nel contenitore secondario in un incubatore di 30 °C per 24 ore e non utilizzare se appare la crescita.
2. Aggiungere ninfe al pallone BHI con pellet di cibo sterile. Scuoterli dalla loro inclinazione BHI e lasciarli cadere nel pallone in un cappuccio di flusso laminare.
   NOTA: Le ninfe non hanno trazione sulle pareti di vetro della provetta. Scuotere il tubo per farli cadere dall'inclinazione e quindi ribaltare il tubo per consentire loro di scivolare giù per il vetro nel pallone è efficace. Mentre le ninfe possono essere trasferite usando le forcep, il rischio di lesioni mortali è elevato.
3. Ninfe d'acqua con 300 μL di acqua sterile una volta alla settimana in una cappa di flusso laminare tubazione direttamente sul pavimento BHI del pallone.
4. Quando le feci delle ninfe iniziano a coprire il pavimento BHI, trasferire in un nuovo pallone BHI, aggiungendo il chow di ratto sterilizzato con 24 ore di anticipo (per verificare la sterilità) come nel passaggio 5.1.

6. Controllo di qualità della sterilità

1. Rimuovere una ninfa dal pallone BHI da sacrificare per un controllo di qualità indipendente dalla cultura dello stato gnotobiotico tramite polimorfismo di restrizione della lunghezza del frammento (RFLP). Per fare questo, versare la ninfa in un tubo di centrifuga sterile (simile al trasferimento ninfa dal passo 5.1) o posizionare un applicatore di legno sterile nel pallone e attendere che una ninfa inizi a salire, quindi trasferirlo nel tubo di centrifuga.
2. Aggiungere 0,5 ml di 1x soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) alla ninfa nel tubo di centrifuga e omogeneizzare con una micropestola sterile fino a quando tutti i pezzi di grandi dimensioni non vengono scomposti. Vortice bene.
3. Estrarre il DNA dall'omogeneato di ninfe utilizzando un kit di estrazione del DNAbatterico (Table of Materials)come segue.
   1. Centrifugare la ninfa omogeneizzata per 10 min a 5.000 x g e rimuovere il supernatante. Preriscaldare uno shaker termico a 37 °C.
   2. Aggiungere 100 μL di 1x Tris-EDTA e vortice per rimorsi completamente il pellet. Aggiungere 10 μL di lisozima e mescolare, seguito da un'incubazione di 30 minuti (senza scuotimento) nello shaker termico preriscaldato a 37 °C.
   3. Aggiungere 25 mg di perline di vetro ai campioni e vortice alla velocità massima per 5 minuti. Preriscaldare lo shaker termico a 55 °C.
   4. Lasciare depositare le perline prima di trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 ml con 100 μL di tampone proteica k e 20 μL di proteinasi K. Vortex da mescolare accuratamente.
   5. Incubare, con scuotimento a 600 giri/min, in uno shaker termico a 55 °C per 60 min. Centrifuga a 10.000 x g per 2 min e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 ml. Preriscaldare lo shaker termico a 65 °C. Iniziare a preriscaldare il tampone di eluizione in un forno di ibridazione a 65 °C.
   6. Aggiungere 220 μL di etanolo al 100%. Vortice alla velocità massima per 20 s. Rompere qualsiasi precipitato visibile tubazione su e giù 10x.
   7. Inserire una colonna di DNA in un tubo di raccolta da 2 ml e trasferire il campione nella colonna, incluso qualsiasi precipitato che potrebbe aver formato. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min, scartare il filtrato dal tubo di raccolta e sostituire il tubo di raccolta.
   8. Aggiungere 500 μL di tampone di legame alla colonna e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. Scartare il filtrato dal tubo di raccolta e sostituire il tubo di raccolta.
   9. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio del DNA alla colonna e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. Scartare il filtrato dal tubo di raccolta e sostituire il tubo di raccolta. Ripetere per un secondo passaggio di lavaggio.
   10. Centrifugare la colonna vuota per 2 minuti per asciugarla, trasferendo la colonna in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 ml in seguito. Aggiungere 50 μL di tampone di eluizione preriscaldato direttamente alla matrice della colonna di DNA e incubare a 65 °C per 5 min.
   11. Centrifuga a 10.000 x g per 1 minuto per elutare. Quantificare il DNA estratto nel filtrato tramite spettrofotometria o fluorometria.
4. Amplificare e digerire l'intero gene 16S. Visualizzare i frammenti usando l'elettroforesi del gel.
   1. Utilizzare 12,5 μL di mix master 2x, 0,5 μL di ogni primer 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) e 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng di DNA e acqua di grado molecolare per un volume di reazione totale di 25 μL.
   2. Eseguire il seguente programma termociclometro: 94 °C per 60 s; seguito da 35 cicli di 94 °C per 30 s, 50 °C per 45 s, 68 °C per 90 s; seguito da 68 °C per 5 min.
   3. Purificare il prodotto di reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando un kit di purificazione del DNA(Table of Materials).
      1. Aggiungere 120 μL di tampone purificante al prodotto PCR e al vortice da mescolare. Centrifugare brevemente per raccogliere goccioline all'interno del coperchio. Inserire una colonna di DNA in un tubo di raccolta da 2 ml, trasferire il liquido nella colonna preparata e centrifugare a ≥13.000 x g per 1 min.
      2. Scartare il filtrato e sostituire il tubo di raccolta. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio del DNA e centrifuga a ≥13.000 x g per 1 min. Scartare il filtrato e sostituire il tubo di raccolta. Ripetere per un secondo passaggio di lavaggio.
      3. Centrifugare la colonna vuota per 2 minuti per asciugare e trasferire la colonna in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 50 μL di tampone di eluizione preriscaldato direttamente alla matrice della colonna di DNA e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
      4. Centrifuga a 10.000 x g per 1 minuto per elutare. Quantificare il DNA estratto in filtrato tramite spettrofotometria o fluorometria.
   4. Aggiungere 1 μg di prodotto PCR purificato a 5 μL di tampone di digestione, 10 unità RsaI e acqua di grado molecolare per un volume di reazione totale di 50 μL. Mescolare pipettando su e giù e incubando a 37 °C per 60 min.
   5. Separare il prodotto digerito tramite elettroforesi gel eseguendo 20 μL di DNA digerito su un gel di agarosio al 2%. Visualizza il gel per confermare lo stato gnotobiotico.
      NOTA: Gli insetti gnotobiotici dovrebbero provocare solo bande a 402 bp, 201 bp e uno striscio da 163 a 148 bp, basato sulla sequenza 16S rDNA dell'endosimbionte, Blattabacterium. Tutte le bande extra viste nel gel sono indicative di contaminare le specie microbiche.

7. Tracciamento asettico della crescita ninfa

1. Registra la lunghezza del corpo per tenere traccia della crescita delle ninfe misurando gli insetti attraverso il pavimento BHI traslucido del pallone.
   NOTA: Le ninfe possono essere posizionate a 4 °C per 15 minuti per rallentare il loro movimento, rendendole così più facili da misurare.

I serbatoi di serie sono impostati come illustrato nella figura 1. Le femmine "incinte" sono identificate dall'ootheca attaccata all'addome posteriore, come nella figura 2. L'incubazione di ootecae su agar BHI consente il controllo della qualità gnotobiotico in modo non distruttivo. In alcuni casi, la sterilizzazione non ha successo e la crescita appare intorno alle ootecae come nella figura 3B. Queste ootecae devono essere rimosse e scartate. Nelle nostre mani, è stato osservato un tasso medio di fallimento del 10% per la sterilizzazione (n = 51). Le ootecae si schiudono in media 34 giorni dopo la sterilizzazione senza crescita sul mezzo, come si vede nella figura 3A. Abbiamo osservato tassi tipici di schiusa del 41% (n = 46) per le ooteca sterilizzate e non contaminate, con una media di 11 ninfe per ootheca. Le ninfe più grandi vengono trasferite a mastri BHI ricoperti di foglio, come nella figura 4. Il foglio previene la contaminazione e le ninfe hanno spazio per crescere. RFLP del 16S rDNA da una ninfa omogeneizzata viene utilizzato per confermare lo stato gnotobiotico. Le ninfe gnotobiotiche sono state osservate crescere ad un ritmo più lento rispetto alle loro controparti non sterili, come rappresentato figura 5. La figura 6 mostra i risultati degli insetti gnotobiotici con successo e delle ninfe standard (nonsterili).

Sebbene questo test non abbia ancora identificato la contaminazione in assenza di un risultato di coltura positivo, questo passaggio è stato effettuato regolarmente durante esperimenti critici per escludere la presenza di microbi contaminanti sensibili all'ossigeno o fastidiosi. La crescita più lenta è stata osservata negli scarafaggi gnotobiotici rispetto agli insetti standard / nonsterili.

Figura 1: Configurazione della cultura delle scorte di scarafaggi.
I tubi di cartone possono essere visti impilati all'estremità del serbatoio. Cibo e acqua sono entrambi vicino alla parte anteriore del serbatoio. Il coperchio in stoffa di cotone e la fascia elastica sono stati rimossi per la visibilità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Uno scarafaggio americano "incinta".
La freccia indica l'ootheca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini di ninfe gnotobiotiche tratteggiate con successo e ootecae sterilizzate senza successo su inclinazioni BHI.
Le ootece sono state sterilizzate e incubate come descritto in questo protocollo. (A) La mancanza di crescita microbica sull'inclinazione BHI indica che gli insetti sono privi di organismi culturabili. (B) Le ootecae su inclinazioni che vengono alla formazione di colonie devono essere scartate come contaminate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Apparecchio di allevamento gnotobiotico.
Gli insetti sono tenuti in contenitori sterili coperti da un coperchio di lamina per prevenire la contaminazione. Il contenitore secondario (coperchio verde) viene sterilizzato con candeggina al 2% seguita dal 70% di etanolo. Il flusso d'aria non è limitato nel contenitore secondario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Dati rappresentativi sul tasso di crescita che confrontano le lunghezze corporee delle ninfe gnotobiotiche e non estere. Entrambi i gruppi di insetti sono stati nutriti con dieta autoclavata dei roditori. Gli insetti gnotobiotici (qui: n = 105) sono tenuti su BHI come descritto. Gli insetti nonsterili (qui: n = 50) vivono in fiasche con biancheria da letto in trucioli di legno autoclavati con piccoli piatti per l'acqua. Le ninfe nonsterili crescono ad un tasso medio di 0,059 mm/giorno, mentre le ninfe gnotobiotiche crescono a 0,028 mm/giorno (p < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagine in gel rappresentativa dei risultati RFLP per il controllo di qualità.
Gli ampliconi genetici dell'intero 16S sono stati digeriti con RsaI. Il DNA per PCR è stato estratto da ninfe omogeneizzate in 1x PBS. Le corsie "G nymph" corrispondono alle ninfe gnotobiotiche, mentre le corsie "conv nymph" corrispondono a controparti convenzionali e nonsterili. Sulla base del digest di restrizione virtuale, l'endosymbiont (Blattabacterium) dovrebbe avere bande delle dimensioni di 402 bp, 206 bp e 163 bp, con uno striscio di bande tra 163 bp e 148 bp. Un insetto gnotobiotico dovrebbe mostrare solo il modello di bande blattabacterium. Si prevede che una comunità batterica mista abbia uno striscio di bande di varie dimensioni, etichettate qui come "altri frammenti batterici 16S". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.