Preparazione della piega vocale del ratto per le analisi neuromuscolari

Sommario

Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per preparare le corde vocali dei ratti per lo studio neuromuscolare istochimico.

Abstract

Lo scopo di questo tutorial è descrivere la preparazione della piega vocale del ratto per lo studio neuromuscolare istochimico. Questo protocollo delinea le procedure per la dissezione laringea del ratto, il congelamento flash e la criosezione delle corde vocali. Questo studio descrive come criosezionare le corde vocali sia sul piano longitudinale che su quello della sezione trasversale. Una novità di questo protocollo è il tracciamento laringeo durante la criosezione che garantisce un'accurata identificazione dei muscoli laringei intrinseci e riduce la possibilità di perdita di tessuto. Le cifre dimostrano la criosezione progressiva in entrambi i piani. Ventinove emi-laringi di ratto sono state criosezionate e tracciate dall'emergere della cartilagine tiroidea alla comparsa della prima sezione che includeva l'intera piega vocale. La piega vocale completa è stata visualizzata per tutti gli animali in entrambi i piani. C'era un'alta variabilità nella distanza dalla comparsa della cartilagine tiroidea alla comparsa della piega vocale completa in entrambi i piani. Il peso non era correlato alla profondità dei punti di riferimento laringei, suggerendo che la variabilità individuale e altri fattori legati alla preparazione dei tessuti possono essere responsabili dell'elevata variabilità nell'aspetto dei punti di riferimento durante il sezionamento. Questo studio descrive in dettaglio una metodologia e presenta dati morfologici per la preparazione della piega vocale del ratto per l'indagine neuromuscolare istochimica. A causa dell'elevata variabilità individuale, i punti di riferimento laringei devono essere monitorati attentamente durante la criosezione per prevenire la sovraselezione di tessuti e perdite di tessuto. L'uso di una metodologia coerente, compresa un'adeguata preparazione dei tessuti e la consapevolezza dei punti di riferimento all'interno della laringe del ratto, aiuterà con risultati coerenti in tutti gli studi e aiuterà i nuovi ricercatori interessati a utilizzare la piega vocale del ratto come modello per studiare i meccanismi neuromuscolari laringei.

Introduzione

La laringe di ratto è un modello consolidato per studiare gli adattamenti laringei neuromuscolari strutturali e funzionali allo sviluppo, all'invecchiamento, alla malattia e agli agenti farmacologici1,2,3,4,5. La coerenza dei metodi istologici è fondamentale per questa linea di lavoro, in quanto vi sono molteplici complessità coinvolte nella preparazione e nell'analisi muscolare, nonché sfide associate alle dimensioni laringee, alla forma e alla topografia dei muscoli incapsulati all'interno delle cartilagi....

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee della New York University School of Medicine.

1. Sezionare la laringe di ratto

1. Eutanasia ratto secondo il protocollo istituzionalmente approvato. Rasare il collo ventrale dalla mandibola al manubrio e tamponare con alcool per prevenire la contaminazione della pelliccia nei campioni di tessuto.
2. Sotto un cannocchiale di dissezione con ingrandimento 10x asportare l'intera laringe creando un'incisione del collo della linea mediana con un bisturi fino a quando la trachea non è esposta.
3. Separare i muscoli laringei estrinsec....

Risultati

I risultati rappresentativi facevano parte di un'indagine in corso sugli effetti dell'esercizio vocale sul sistema neuromuscolare laringeo. Ventinove ratti maschi Fischer 344/brown Norway (12 di 9 mesi, 17 di 24 mesi) sono stati pesati ed eutanasizzati con inalazione di _CO2 seguita da una toracotomia bilaterale.

Le procedure hanno seguito il protocollo delineato per etichettare NMJ e dimensioni delle fibre dei muscoli TA laterali e mediali. La distanza tra i punti di riferimento lar.......

Discussione

La preparazione delle corde vocali dei ratti per l'analisi neuromuscolare può presentare varie sfide. Non solo i muscoli laringei sono piccoli e circondati da cartilagine, rendendo così difficile estrarre direttamente il muscolo bersaglio, ma è stata trovata anche un'elevata variabilità tra gli animali nella profondità dei punti di riferimento anatomici laringei. Per il muscolo il protocollo del piano della sezione trasversale, le sezioni complete della piega vocale sono apparse tra 21-85 sezioni (10 μm per sezione) dopo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-metilbutano certificato	Fisher Chemical	35514
foglio di alluminio	Fisherbrand	1213101
Cryo Tongs SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Lame per criostato	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Stampi base monouso 15mm x Sottopolsini monouso da 15 mm	Thermo Scientific	41-741
	Medline	23-666-062
Kit di dissezione	Thermo Scientific	9996969
Gibco	salino tamponato con fosfati di Dulbecco	14190136
sezione congelata media	Fisher Healthcare	23-730-571
Secchiello per il ghiaccio	Bel-Art
Camera di Umidità Immunocolorante	Ted Pella Inc	NC9425474
Portaaghi	Assi	ASSI. B148
Spugne in tessuto non tessuto, 4 strati	Quick Medical	9023
Agitatore orbitale	Troemner	02-217-987
Pap pen
Paraformaldeide, 16% p/v aq. soln., senza metanolo	Alfa Aesar	50-00-0
Provette per microcentrifuga Premium	Fisherbrand	5408129
Conservazione dei campioni Sacchetti	Fisherbrand	19240093
Acciaio inossidabile Misura graduata 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Fisherbrand	12-550-15
Task Wiper	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Forbici	Assi	ASSI.
NOTA: Per tutte le forniture, questi sono esempi di attrezzature da acquistare. Il modello esatto non è necessario per completare i nostri metodi.

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