Un saggio di alimentazione orale batterico con zanzare trattate con antibiotici

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo per studiare l'effetto dei singoli batteri dell'intestino di zanzara, tra cui l'isolamento e l'identificazione di microbi cultivable delle zanzare, l'esaurimento antibiotico dei batteri dell'intestino di zanzara e reintrodurre una specie di batteri specifici.

Abstract

La zanzara midgut ospita un microbioma altamente dinamico che influenza il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza vettoriale. Sono stati condotti studi per studiare l'effetto dei microbi intestinali nel loro complesso; tuttavia, microbi diversi potrebbero esercitare effetti distinti verso l'ospite. Questo articolo fornisce la metodologia per studiare l'effetto di ogni microbo specifico dell'intestino di zanzara e il potenziale meccanismo.

Questo protocollo contiene due parti. La prima parte introduce come sezionare la zanzara midgut, isolare colonie batteriche cultivable, e identificare le specie di batteri. La seconda parte fornisce la procedura per generare zanzare trattate con antibiotici e reintrodurre una specie di batteri specifici.

Introduzione

Le zanzare sono considerate i vettori più importanti delle malattie patogene umane, trasmettendo oltre un centinaio di patogeni tra cui il virus zoika, il virus Dengue e i parassiti del Plasmodium ¹. Quando le zanzare prendono un pasto di sangue per acquisire nutrienti per l'oviposizione, possono accidentalmente ingerire agenti patogeni da un ospite infetto tramite il tratto digestivo². È importante sottolineare che la zanzara midgut, che svolge un ruolo fondamentale sia nella digestione dei pasti sanguigni che nell'ingresso di agenti patogeni, ospita un microbioma^{altamente dinamico 3}.

Diversi studi hanno caratterizzato il microbiota di zanzara allevato in laboratorio e raccolto sul campo utilizzando un metodo dipendente dalla coltura o un asquencing di sequenziamento^{batterico 4,5,6}. Specie tra cui Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, e Enterococcus sono comunemente isolati dalle zanzare in vari^{studi 5,7,8,9}. È interessante notare che il microbiota dell'intestino di zanzara fluttua dinamicamente sia nella diversità della comunità che nella quantità di specie batteriche, influenzate dalla fase di sviluppo, dalle specie, dall'origine geografica e dal comportamento alimentare⁴. Gli studi dimostrano che l'alimentazione del sangue aumenta drammaticamente il carico batterico totale con una rapida espansione delle specie da Enterobacteriaceae e una riduzione della diversità^{complessiva 10,11}. Inoltre, il microbiota intestinale della zanzara dello stadio larvale viene solitamente sradicato quando l'insetto subisce la metamorfosi durante la pupazione e l'eclosione; quindi, le zanzare adulte appena emerse hanno bisogno di ripopolare il loro microbiota⁴.

Il microbiota intestinale modula la fisiologia degli insetti in vari aspetti, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, l'immunità, lo sviluppo, la riproduzione e la competenza^{vettoriale 12}. Le larve di zanzara ascia non riescono a svilupparsi oltre la prima instar mentre un approvvigionamento orale batterico salva lo sviluppo, indicando che il microbo intestinale della zanzara è essenziale per lo sviluppo larvale^13,14. Inoltre, l'esaurimento dei batteri intestinali ritarda la digestione dei pasti nel sangue e l'assorbimento dei nutrienti, influisce sulla maturazione degli oociti e diminuisce l'oviposizione¹⁵. Inoltre, le zanzare con microflora intestinale suscitano risposte immunitarie più elevate rispetto alle zanzare trattate con antibiotici, con espressione di peptidi antimicrobici costantemente elevata contro altri patogeni per^{infettare 16}. Gli antibiotici sono di solito somministrati per via orale per rimuovere i batteri intestinali pan in questi studi, e poi vengono condotti esperimenti per confrontare la differenza tra zanzare asceniche e zanzare con microbi commensal. Tuttavia, la zanzara midgut ospita una comunità diversificata di microbi, e ogni specie di batteri potrebbe esercitare un effetto distinto verso la fisiologia ospite.

Il microbiota delle zanzare regola la competenza vettoriale con effetti divergenti. La colonizzazione da parte di Proteus isolato dalle zanzare derivate dal campo delle aree dengue-endemiche conferisce l'espressione di peptidi antimicrobici e la resistenza contro l'infezione da virus dengue¹⁶. Il fungo entomopatogenico Beauveria bassiana attiva il percorso immunitario Toll e JAK-STAT contro l'infezione da arbovirus¹⁷. Al contrario, il fungo Talaromyces isolato da Aedes aegypti midgut facilita l'infezione da virus dengue modulando l'attività di trypsina^{intestinale 18}. Inoltre, Serratia marcescens promuove la trasmissione dell'arbovirus attraverso una proteina secretoria chiamata SmEnhancin, che digerisce lo strato di mucina sull'epitelio intestinale delle zanzare¹⁹.

Questa procedura fornisce un metodo sistematico e intuitivo per la dissezione della zanzara midgut, l'isolamento delle colonie di batteri cultizzabili, l'identificazione delle specie batteriche e la reintroduzione tramite alimentazione orale. Fornisce risultati rappresentativi dell'alimentazione del sangue con un batterio commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sullo sviluppo dell'ovaio delle zanzare e sull'oviposizione.

Protocollo

1. dissezione midgut e isolamento batterico cultivable bacteria isolation

1. Preparare la zanzara per la dissezione.
   1. Raccogliere le zanzare 7-9 giorni dopo l'emergere con un aspiratore. Anestetizzare le zanzare raccolte sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato fino alla dissezione.
2. Sterilizzare gli strumenti di laboratorio e la superficie della zanzara.
   1. Sterilizzare il banco dell'esperimento, sezionare microscopio, forze e vetrate spruzzando 75% di etanolo per evitare la contaminazione da batteri provenienti dall'ambiente.
   2. Preparare un piatto Petri sterile contenente il 75% di etanolo e due piatti Petri contenenti salina tamponata sterile 1x fosfato (1x PBS).
   3. Superficie-sterilizzare la zanzara immergendoli e scuotendoli in 75% etanolo per 3 min, e risciacquare due volte con 1x tampone PBS nel caso in cui l'etanolo colpisce la flora intestinale sezionata.
3. Dissacre la zanzara midgut.
   1. Trasferire la zanzara sterilizzata in superficie sullo scivolo di vetro con una goccia di tampone sterile 1x PBS. Dissect sotto il microscopio sezionante.
   2. Sotto l'ingrandimento inferiore del microscopio sezionante, rimuovere con attenzione le gambe, le ali e la testa della zanzara per evitare la fuga. Rimuovere l'ultimo somite della zanzara tagliando direttamente, piuttosto che tirarla, per evitare che il tratto digestivo si rompa.
   3. Bloccare il torace della zanzara e l'estremità dell'addome con le forcetti. Estrarre delicatamente il tratto digestivo della zanzara. Il tratto digestivo acquisito di solito contiene il raccolto, il foregut, il midgut, il hindgut e i tubi Malpighian.
   4. Regolare il microscopio sezionante su un ingrandimento più elevato. Rimuovere il raccolto, il foregut, il hindgut e i tubi Malpighian dal tratto digestivo sezionato per ottenere il midgut della zanzara.
   5. Fare attenzione durante la rimozione del raccolto, come il raccolto si gonfia e assomiglia al midgut dopo che la zanzara prende un pasto di zucchero. I tubi Malpighian, un gruppo di tubi escretori lunghi e sottili, si trovano al confine tra il midgut e il hindgut.
4. Isolare i batteri intestinali.
   1. Trasferire il midgut sezionato in un tubo sterile da 1,5 mL con 200 L di tampone sterile 1x PBS.
   2. Macinare accuratamente il midgut su una panca sterile con un pestello sterile per consentire il rilascio completo di batteri intestinali al tampone.
   3. Diluire l'omogenea a tre diluizioni da 10 volte. Aggiungere 50 L di ogni diluizione alla piastra di agar LB (brodo di Luria), quindi stenderla sul piatto. Se il midgut contiene un'alta concentrazione di flora intestinale, è essenziale fare più diluizioni seriali per scegliere singole colonie.
   4. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 1-2 giorni fino a quando non sono visibili singole colonie.
5. Identificazione delle specie
   1. Raccogliere singole colonie e inocularle rispettivamente in un flacone conico da 150 mL contenente 50 mL di media brodo LB.
   2. Agitare i batteri a 37 gradi centigradi durante la notte.
   3. Estrarre il DNA totale dal kit di estrazione del DNA genomico batterico. Amplificare 16S rDNA mediante reazione a catena di polimerasi (PCR).
      NOTA: Ci sono più segmenti in 16S rDNA che sono conservati. Sulla base di queste regioni conservate, primer universali per i batteri possono essere progettati per amplificare frammenti 16S rDNA di tutti i batteri. Questi primer sono specifici per i batteri, e la differenza nella regione variabile di 16S rDNA può essere utilizzata per distinguere diversi batteri. Pertanto, 16S rDNA è ampiamente utilizzato per l'identificazione batterica.
   4. Recuperare e purificare i frammenti di DNA dai prodotti PCR mediante elettroforesi gel agarose e un kit di recupero gel commerciale.
   5. Eseguire il sequenziamento del DNA sui frammenti di DNA purificati per ottenere sequenze geniche batteriche.
   6. Confrontare la sequenza genica 16S rRNA con la sequenza batterica disponibile in GenBank. Selezionare il database Batteri e Archaea.
      NOTA: l'identificazione al livello della specie è stata definita come somiglianza della sequenza rDNA del 99% 16S con la voce GenBank più vicina. L'isolato è stato assegnato al genere corrispondente quando la sua somiglianza di sequenza 16S rDNA era <99% e 95%.

2. Trattamento antibiotico e reintroduzione del batterio

1. Preparare la soluzione antibiotica.
   1. Pesare la quantità richiesta di saccarosio, penicillina e streptomicina per preparare una soluzione di saccarosio del 10%, comprendenti 20 unità di penicillina e 20 g di streptomicina per mL.
2. Nutrire le zanzare con la soluzione antibiotica.
   1. Anestetizzare le zanzare in 4 gradi centigradi per 3-5 min. Trasferire le zanzare in un tazza di carta. Coprire la parte superiore con garza e avvolgere la garza con del nastro adesivo per evitare che le zanzare s scappatono.
   2. Immergere le batuffoli di cotone sterili nella soluzione antibiotica e posizionarle con attenzione sulla coppa di zanzara. Spremere i batuffoli di cotone prima dell'uso per evitare che le zanzare annegano nei palline di cotone gocciolanti.
   3. Coprire i batuffoli di cotone con un piatto Petri da 10 cm per evitare l'evaporazione dell'umidità. Sostituire i batuffoli di cotone due volte al giorno per tre giorni consecutivi.
3. Confermare l'efficacia del trattamento antibiotico.
   1. Secondo il metodo di cui sopra, sezionare il midgut di zanzare trattate con antibiotici.
   2. Trasferire i midguts sezionati in un tubo sterile da 1,5 mL con 200 L di tampone sterile 1x PBS.
   3. Macinare accuratamente i midguts in una panca sterile con un pestello sterile per consentire il rilascio completo di batteri intestinali al tampone.
   4. Estrarre il DNA microbico intestinale dal kit di estrazione del DNA genomico batterico.
   5. Eseguire la quantificazione batterica mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR) sul DNA genomico utilizzando primer eubacteria universali (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT e R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
4. Preparazione delle sospensioni batteriche
   1. Misurare la soluzione batterica con uno spettrofotometro. Aggiungere 1 sospensione batterica OD (OD600) in un tubo da 1 mL. Centrifugare la sospensione a 5.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   2. Eliminare il supernatant e aggiungere 1 mL di tampone sterile 1x PBS a tubo da 1,5 mL per le precipitazioni delle sospensioni.
   3. Centrifuga a 5.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi; scartare il supernatant.
   4. Ripetere i passaggi 2.4.2 e 2.4.3.
   5. Aggiungere 200 L di tampone sterile 1x PBS alla precipitazione batterica.
   6. Aggiungere 600 L della soluzione di saccarosio del 10%, 200 L di 10 mm ATP (che agisce come fagostimolante) e 200 L di sospensione batterica in un tubo sterile da 1,5 mL. Mescolare per vortice. In alternativa, sospendere i batteri pelletati nel sangue inattivato dal calore.
   7. Preparazione del sangue inattivato dal calore
      1. Raccogliere sangue fresco con un tubo anticoagulante.
      2. Prendere 2-3 mL di sangue fresco. Centrifuga a 1.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per separare plasma e cellule del sangue. Si noti che il sangue andrà perso durante la centrifugazione e il processo di lavaggio; è necessario calcolare l'utilizzo in anticipo.
      3. Raccogliere il plasma in un nuovo tubo da 1,5 mL e inattivare il calore a 56 gradi centigradi per 1 h.
      4. Aggiungere 500 L di tampone sterile 1x PBS a 1,5 mL tubo per la sospensione delle cellule del sangue. Centrifuga a 1.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e quindi scartare il supernante.
      5. Ripetere il passaggio 2.4.7.4 due volte.
      6. Riespondare le cellule del sangue con plasma inattivato dal calore per ottenere sangue inattivato dal calore.
      7. Seguire i passaggi da 2.4.1 a 2.4.4 per ottenere 1 OD batterico pelleted.
      8. Riesosponda i batteri pelletati con 1 mL di sangue inattivato dal calore.
5. Nutrire la zanzara con sospensione batteri.
   1. Affama le zanzare per 24 h, permettendo agli antibiotici di metabolizzare prima di nutrire i batteri.
   2. Assemblare il sistema di alimentazione a membrana.
   3. Sigillare l'unità di alimentazione sterilizzata con un parafilm, in alternativa una membrana di collagene.
   4. Mettere su un anello di plastica e fissarlo con parafilm per evitare la rottura a causa di attrito durante l'alimentazione.
   5. Aggiungere lentamente la soluzione batterica preparata all'unità di alimentazione. Si noti che solo un pozzo dell'unità di alimentazione a due pozzo può essere riempito con la soluzione e coprire l'unità di alimentazione solo dal lato di caduta del reagente.
   6. Collegare l'unità di alimentazione a un sistema di alimentazione preriscaldato a 37 gradi centigradi, che simula la temperatura umana per attirare le zanzare. Posizionare il dispositivo di alimentazione su una tazza di carta piena di zanzare e nutrirsi per 90 min.
   7. Dopo l'alimentazione, anestetizzare le zanzare sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato.
   8. Scegli le zanzare completamente engorged per ulteriori studi.

Risultati

I midguts di zanzare trattate con antibiotici e senza antibiotici sono stati prelevati per l'estrazione del DNA, e qPCR è stato eseguito con primer batterici universali. La figura 1 mostra l'espressione del rRNA 16S batterico nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che circa il 98% dei batteri intestinali sono stati rimossi e la sterilizzazione intestinale della penicillina e della streptomicina ha avuto successo.

Con i metodi desc...

Discussione

La ricerca sulle interazioni ospite-microbi ha scoperto che diversi microbi intestinali influenzano la loro fisiologia ospite attraverso meccanismi divergenti. Questo articolo introduce il metodo per studiare il rispettivo ruolo del microbo intestinale della zanzara, tra cui sezionare la zanzara midgut, culturing batteri intestinali culti, trattamento antibiotico, e reintrodurre i batteri di interesse.

Per un trattamento antibiotico di successo, i seguenti dettagli devono essere considerati ne...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato	Sigma	A2383	Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato è stato utilizzato per preparare soluzioni standard di adenosina trifosfato (ATP)
Aedes aegypti			Zanzare femmine
Tubo anticoagulante	BD Vacutainer	363095	Raccogliere sangue fresco
Tubo da centrifuga	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 ml, naturale, graduato, sterile
Batuffoli
Pestello monouso per la macinazione dei tessuti	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm di lunghezza, conico, blu, sterile
Etanolo assoluto	Paini		Diluirlo al 75% Pinza per etanolo
	RWD	F11029	Dissezione
Alimentazione a membrana Hemotek Sistema	Hemotek		Componenti del sistema di alimentazione, tra cui  Regolatore di temperatura Hemotek, gruppo alimentatore-alloggiamento, alimentatore in metallo assemblato.
Agitatore		ZQZY-78AN
Anelli di inoculazione	Sangon Biotech	F619312-0001	10 μ l, Polvere
Agar	LB Sangon Biotech	A507003	Triptone 10,0 g, Estratto di lievito 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.
LB Brodo in Polvere	Sangon Biotech	A507002	Triptone 10,0 g, Estratto di Lievito 5,0 g, NaCl 10,0 g.
Microscopio	Zeiss	Stemi508
Bicchiere			Posto zanzara
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 inx 125 ft
Piastra di Petri	Sangon Biotech	F611203
Penicillina G sale di procaina idrato	Sangon Biotech	A606248	polvere bianca. Solubile in acqua, solubile in metanolo, leggermente solubile in acqua, etanolo
Pipettatore singolo Channal Gilson
Streptomycin solfato	Sangon Biotech	A610494	Streptomycin solfato è un antibiotico glucosamina che interferisce con la sintesi delle proteine procariotiche.
Saccarosio	Sangon Biotech	A502792	Solubile in acqua, etanolo e metanolo, leggermente solubile in glicerolo e piridina.
Kit DNA per batteri TIANamp TIANGEN		DP302	Estratto di DNA
Tessuto di utilità-Zanzariera Miscelatore a
	Scintic Industries	S1-0246
Tubo EP da 1,5 ml	Sangon Biotech	F600620
tampone PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Questo prodotto è una soluzione 10X. Si prega di diluirlo 10 volte prima dell'uso. Il valore del pH è 7,4.

di cotone per incubatori di Giallo di carta vortice bianco