Questo articolo presenta un protocollo per studiare l'effetto dei singoli batteri dell'intestino di zanzara, tra cui l'isolamento e l'identificazione di microbi cultivable delle zanzare, l'esaurimento antibiotico dei batteri dell'intestino di zanzara e reintrodurre una specie di batteri specifici.
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Articolo metodologico
Un saggio di alimentazione orale batterico con zanzare trattate con antibiotici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La zanzara midgut ospita un microbioma altamente dinamico che influenza il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza vettoriale. Sono stati condotti studi per studiare l'effetto dei microbi intestinali nel loro complesso; tuttavia, microbi diversi potrebbero esercitare effetti distinti verso l'ospite. Questo articolo fornisce la metodologia per studiare l'effetto di ogni microbo specifico dell'intestino di zanzara e il potenziale meccanismo.
Questo protocollo contiene due parti. La prima parte introduce come sezionare la zanzara midgut, isolare colonie batteriche cultivable, e identificare le specie di batteri. La seconda parte fornisce la procedura per generare zanzare trattate con antibiotici e reintrodurre una specie di batteri specifici.
Introduzione
Le zanzare sono considerate i vettori più importanti delle malattie patogene umane, trasmettendo oltre un centinaio di patogeni tra cui il virus zoika, il virus Dengue e i parassiti del Plasmodium 1. Quando le zanzare prendono un pasto di sangue per acquisire nutrienti per l'oviposizione, possono accidentalmente ingerire agenti patogeni da un ospite infetto tramite il tratto digestivo2. È importante sottolineare che la zanzara midgut, che svolge un ruolo fondamentale sia nella digestione dei pasti sanguigni che nell'ingresso di agenti patogeni, ospita un microbiomaaltamente dinamico 3.
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Protocollo
1. dissezione midgut e isolamento batterico cultivable bacteria isolation
- Preparare la zanzara per la dissezione.
- Raccogliere le zanzare 7-9 giorni dopo l'emergere con un aspiratore. Anestetizzare le zanzare raccolte sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato fino alla dissezione.
- Sterilizzare gli strumenti di laboratorio e la superficie della zanzara.
- Sterilizzare il banco dell'esperimento, sezionare microscopio, forze e vetrate spruzzando 75% di etanolo per evitare la contaminazione da batteri pr....
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Risultati
I midguts di zanzare trattate con antibiotici e senza antibiotici sono stati prelevati per l'estrazione del DNA, e qPCR è stato eseguito con primer batterici universali. La figura 1 mostra l'espressione del rRNA 16S batterico nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che circa il 98% dei batteri intestinali sono stati rimossi e la sterilizzazione intestinale della penicillina e della streptomicina ha avuto successo.
Con i metodi desc.......
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Discussione
La ricerca sulle interazioni ospite-microbi ha scoperto che diversi microbi intestinali influenzano la loro fisiologia ospite attraverso meccanismi divergenti. Questo articolo introduce il metodo per studiare il rispettivo ruolo del microbo intestinale della zanzara, tra cui sezionare la zanzara midgut, culturing batteri intestinali culti, trattamento antibiotico, e reintrodurre i batteri di interesse.
Per un trattamento antibiotico di successo, i seguenti dettagli devono essere considerati ne.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), e dal Science and Technology Plan Project della provincia di Hunan (2019RS1036).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato | Sigma | A2383 | Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato è stato utilizzato per preparare soluzioni standard di adenosina trifosfato (ATP) |
| Aedes aegypti | Zanzare femmine | ||
| Tubo anticoagulante | BD Vacutainer | 363095 | Raccogliere sangue fresco |
| Tubo da centrifuga | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1,5 ml, naturale, graduato, sterile |
| Batuffoli | |||
| Pestello monouso per la macinazione dei tessuti | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm di lunghezza, conico, blu, sterile |
| Etanolo assoluto | Paini | Diluirlo al 75% Pinza per etanolo | |
| RWD | F11029 | Dissezione | |
| Alimentazione a membrana Hemotek Sistema | Hemotek | Componenti del sistema di alimentazione, tra cui Regolatore di temperatura Hemotek, gruppo alimentatore-alloggiamento, alimentatore in metallo assemblato. | |
| Agitatore | ZQZY-78AN | ||
| Anelli di inoculazione | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μ l, Polvere |
| Agar | LB Sangon Biotech | A507003 | Triptone 10,0 g, Estratto di lievito 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g. |
| LB Brodo in Polvere | Sangon Biotech | A507002 | Triptone 10,0 g, Estratto di Lievito 5,0 g, NaCl 10,0 g. |
| Microscopio | Zeiss | Stemi508 | |
| Bicchiere | Posto zanzara | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Piastra di Petri | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillina G sale di procaina idrato | Sangon Biotech | A606248 | polvere bianca. Solubile in acqua, solubile in metanolo, leggermente solubile in acqua, etanolo |
| Pipettatore singolo Channal Gilson | |||
| Streptomycin solfato | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin solfato è un antibiotico glucosamina che interferisce con la sintesi delle proteine procariotiche. |
| Saccarosio | Sangon Biotech | A502792 | Solubile in acqua, etanolo e metanolo, leggermente solubile in glicerolo e piridina. |
| Kit DNA per batteri TIANamp TIANGEN | DP302 | Estratto di DNA | |
| Tessuto di utilità-Zanzariera Miscelatore a | |||
| Scintic Industries | S1-0246 | ||
| Tubo EP da 1,5 ml | Sangon Biotech | F600620 | |
| tampone PBS 10X | Sangon Biotech | E607016 | Questo prodotto è una soluzione 10X. Si prega di diluirlo 10 volte prima dell'uso. Il valore del pH è 7,4. |
Riferimenti
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Re....
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Ristampe e permessi
