Questo articolo fornisce protocolli per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture da oligomeri di acido nucleico peptidico modificati gamma in miscele di solventi organici.
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Articolo metodologico
Auto-assemblaggio di acidi nucleici peptidici modificati gamma in nanostrutture complesse in miscele di solventi organici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le attuali strategie nella nanotecnologia del DNA e dell'RNA consentono l'auto-assemblaggio di una varietà di nanostrutture di acido nucleico in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati. In questo articolo, descriviamo protocolli dettagliati che consentono la costruzione di architetture in nanofibra in miscele di solventi organici attraverso l'auto-assemblaggio di piastrelle di acido nucleico peptidico (γPNA) univocamente adattabili, a singolo filamento e modificate gamma. Ogni piastrella a singolo filamento (SST) è un oligomero γPNA a 12 basi composto da due domini modulari concatenati di 6 basi ciascuno. Ogni dominio può legarsi a un dominio reciprocamente gratuito presente sui filamenti vicini utilizzando la complementarità programmata per formare nanofibre che possono crescere fino a micron in lunghezza. Il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche. In contrasto con le analoge nanostrutture del DNA, che formano strutture monodisperse di diametro, questi sistemi γPNA formano nanofibre che si raggruppano lungo le loro larghezze durante l'auto-assemblaggio in miscele di solventi organici. I protocolli di auto-assemblaggio qui descritti includono quindi anche un tensioattiva convenzionale, sodio dodecil solfato (SDS), per ridurre gli effetti di raggruppamento.
Introduzione
Costruzione di successo di numerose nanostrutturecomplesse1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati realizzati utilizzando naturalmente in opere precedenti sono stati mostrati acidi nucleici presenti come DNA1....
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Protocollo
1. Progettazione della sequenza γPNA
- Scarica la DNA Design Toolbox22 sviluppata dal Winfree Lab al Caltech23 nella cartella contenente script di programmazione per la progettazione di sequenze.
- All'interno di tale cartella di progettazione della sequenza, aprire un linguaggio di programmazione di quarta generazione compatibile con l'estensione di file ".m", quindi aggiungere la cartella "DNAdesign" scaricata in precedenza al percorso utilizzando il comando seguente:
>> addpath DNAdesign - Successivamente eseguire il seguente script denominato "PNA3nanofiber.m" (vedere la figura comp....
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Risultati
I protocolli discussi nelle sezioni precedenti descrivono la progettazione di un motivo SST adattato dalle nanofibre di DNA per la robusta generazione di strutture di nanofibre auto-assemblate utilizzando oligomeri γPNA multipli e distinti. Questa sezione descrive l'interpretazione dei dati ottenuti dalla ricreazione riuscita dei protocolli descritti.
Seguendo il protocollo descritto nella sezione 5 per l'imaging TIRF di campioni di oligomeri γPNA ricotti in DMSO al 75%: H2O (v/v) f.......
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Discussione
Questo articolo si concentra sull'adattamento e il miglioramento dei protocolli di nanotecnologia degli acidi nucleici esistenti verso miscele di solventi organici. I metodi qui descritti si concentrano sulle modifiche e sulla risoluzione dei problemi all'interno di uno spazio sperimentale definito di solventi organici aprotici polari selezionati. Esiste ancora un potenziale inesplorato per altri protocolli consolidati di nanotecnologia dell'acido nucleico da adattare all'interno di questo spazio. Ciò potrebbe migliorare.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation 1739308, dalla sovvenzione NSF CAREER 1944130 e dal numero di sovvenzione FA9550-18-1-0199 dell'Air Force Office of Science Research. Le sequenze γPNA erano un generoso dono del Dr. Tumul Srivastava di Trucode Gene Repair, Inc. Vorremmo ringraziare il Dr. Erik Winfree e il Dr. Rizal Hariadi per le loro utili conversazioni sul codice MATLAB di DNA Design Toolbox. Ringraziamo anche Joseph Suhan, Mara Sullivan e il Center for Biological Imaging per la loro assistenza nella raccolta dei dati TEM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| γ Filamenti/oligomeri di PNA | Trucode Gene Repair Inc. | Sezione 2.1 | |
| Spettrofotometro UV-Vis | Agilent | Varian Cary 300 | Sezione 3.1.2 |
| Cuvette di quarzo | Starna | 29-Q-10 | Sezione 3.1.1 |
| Termociclatore | Bio Rad | C1000 touch | Sezione 4.1 |
| Provette PCR da 0,2 mL | VWR | 53509-304 | Sezione 4.5 |
| DMF anidra | VWR | EM-DX1727-6 | Sezione 4.6 |
| Anidro DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Sezione 4.6 |
| Anidro 1,4-Dioxano | Fisher Scientific AC615121000 | Sezione 4.6 | |
| 10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | VWR | 75800-994 | Sezione 3.1.1 |
| Vetrini per microscopio | VWR | 89085-399 | Sezione 5.2 |
| Vetrini coprioggetto | VWR | 48382-126 | Sezione 5.2 |
| 2% Collodio in acetato di amile | Sigma-Aldrich | 9817 | Sezione 5.2 |
| Acetato di isoamile | VWR | 200001-180 | Sezione 5.2 |
| Albumina sierica bovina biotinilata (Biotina-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Sezione 5.3 |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Sezione 5.4 |
| Streptavidina | Sigma-Aldrich | 189730 | Sezione 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Sezione 5.7 |
| Microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale | Nikon | Nikon Ti2-E | Sezione 5.8 |
| Microscopio elettronico a trasmissione | Joel | JEM 1011 | Sezione 6.6 |
| Pinzette | Dumont | 0203-N5AC-PO | Sezione 6.3 |
| Acetato di uranile | Elettrone Scienze della microscopia | 22400 | Sezione 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, griglie di rame | Ted Pella Inc. | 1701-F | Sezione 6.2 |
| Formvar-Monossido di silicio Tipo A, 300 mesh, Griglie in rame | Ted Pella Inc. | 1829 | Sezione 6.2 |
| Oligomeri/filamenti di DNA | IDT | Sezione 7.1 | |
| Sodio Dodecil Solfato (SDS) | VWR | 97064-860 | Sezione 8.1 |
Riferimenti
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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Ristampe e permessi
