Quantificazione dell'aggregazione proteica insolubile in Caenorhabditis elegans durante l'invecchiamento con un nuovo flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati

Sommario

Questo nuovo flusso di lavoro estrae e isola in modo efficiente le proteine insolubili SDS (insolublome) da Caenorhabditis elegans con un materiale di partenza minimo per l'analisi proteomica differenziale quantitativa. Il protocollo utilizza un'analisi completa della spettrometria di massa ad acquisizione indipendente dai dati per quantificare l'insolubloma e l'analisi bioinformatica per ottenere informazioni biologiche sui meccanismi e sulle patologie dell'invecchiamento.

Abstract

Noi e altri abbiamo dimostrato che il processo di invecchiamento provoca un accumulo di proteine insolubili in tutto il proteoma. L'abbattimento dei geni che codificano per le proteine insolubili oltre il 40% delle volte si traduce in un prolungamento della durata della vita in C. elegans, suggerendo che molte di queste proteine sono determinanti chiave del processo di invecchiamento. L'isolamento e l'identificazione quantitativa di queste proteine insolubili sono fondamentali per comprendere i processi biologici chiave che si verificano durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo un protocollo modificato e migliorato che descrive in dettaglio come estrarre e isolare le proteine insolubili SDS (insolubloma) da C. elegans in modo più efficiente per semplificare i flussi di lavoro della spettrometria di massa tramite una nuova analisi proteomica quantitativa senza marcatura. Questo protocollo migliorato utilizza un sonicatore altamente efficiente per la lisi dei vermi che aumenta notevolmente l'efficienza per l'estrazione delle proteine e ci consente di utilizzare una quantità significativamente inferiore di materiale di partenza (circa 3.000 vermi) rispetto ai protocolli precedenti (in genere utilizzando almeno 40.000 vermi). La successiva analisi proteomica quantitativa dell'insolubloma è stata eseguita utilizzando l'acquisizione data-dipendente (DDA) per la scoperta e l'identificazione delle proteine e l'acquisizione data-independent (DIA) per una quantificazione completa e più accurata delle proteine. L'analisi bioinformatica di proteine quantificate fornisce potenziali candidati che possono essere facilmente seguiti con altri metodi molecolari in C. elegans. Con questo flusso di lavoro, identifichiamo regolarmente più di 1000 proteine e quantifichiamo più di 500 proteine. Questo nuovo protocollo consente uno screening efficiente dei composti con C. elegans. Qui, abbiamo convalidato e applicato questo protocollo migliorato al ceppo N2-Bristol di C. elegans wild-type e abbiamo confermato che i vermi N2 invecchiati al giorno 10 mostravano un maggiore accumulo dell'insolubloma rispetto ai giovani vermi al giorno 2.

Introduzione

L'omeostasi proteica diminuisce progressivamente con l'invecchiamento e si traduce in un aumento dell'aggregazione proteica ^1,2,3. L'aggregazione proteica è associata a diverse malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica⁴. L'invecchiamento è considerato uno dei principali fattori di rischio per l'insorgenza di malattie neurodegenerative associate all'aggregazione proteica. Le proteine che tendono a formare aggregati insolubili sono spesso collegate alla tossicità cellulare e alla disfunzione tissutale, che potrebbero accelerare ulteriormente l'aggregazione di altre proteine ^5,6,7. In alternativa, gli aggregati proteici insolubili possono attivare meccanismi di difesa cellulare per rimuovere le forme oligomeriche tossiche della proteina dal sistema. L'abbattimento di geni selezionati che codificano proteine insolubili modula la durata della vita di Caenorhabditis elegans (C. elegans) sia nel contesto della malattia legata all'età che del normale invecchiamento ^5,8,9. Pertanto, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari dell'aggregazione proteica è fondamentale per comprendere l'invecchiamento e, in ultima analisi, può portare ad approcci per il trattamento delle malattie neurodegenerative.

Il nematode C. elegans è diventato uno degli organismi modello più utilizzati per studiare l'aggregazione proteica nell'invecchiamento e nelle malattie legate all'età grazie alle sue caratteristiche uniche, come una durata di vita relativamente breve (circa 2 settimane), facilità di coltivazione e manipolazione genetica.

La capacità di estrarre e caratterizzare proteine insolubili ha svolto un ruolo fondamentale nel determinare i cambiamenti legati all'età associati all'aggregazione proteica nei modelli di C. elegans. Per studiare il contributo dell'aggregazione proteica ai normali processi di invecchiamento, noi⁵ e altri² abbiamo precedentemente estratto e digerito proteoliticamente l'insolubloma di C. elegans giovane rispetto a quello invecchiato, marcato chimicamente utilizzando i reagenti iTRAQ ("marcatura isobarica per la quantificazione relativa e assoluta"), e quindi quantificato utilizzando metodi basati sulla MS. Utilizzando un metodo di marcatura isobarica e 120 mg di vermi umidi (circa 40.000 vermi), siamo stati in grado di ottenere una significativa profondità e copertura dell'insolubloma proteico⁵. L'analisi quantitativa ha dimostrato che 203 delle 1200 proteine identificate erano significativamente arricchite nell'insolubloma di C. elegans invecchiato rispetto a frazioni insolublome simili di giovani vermi⁵. In modo indipendente, David et al. hanno anche utilizzato un flusso di lavoro iTRAQ LC-MS/MS per esaminare le alterazioni negli aggregati proteici con invecchiamento normale². Partendo da circa 300 mg di vermi, hanno identificato ~ 1000 proteine insolubili utilizzando due repliche biologiche e hanno determinato che ~ 700 su circa 1000 proteine si accumulavano di 1,5 volte o più con l'età rispetto ai giovani vermi². Nel complesso, questi risultati indipendenti indicano che l'insolubilità e l'aggregazione proteica diffuse sono una parte intrinseca del normale invecchiamento e possono influenzare sia la durata della vita che l'incidenza della malattia neurodegenerativa ^2,5.

Lo studio dell'insolubloma ci ha permesso di determinare come le influenze ambientali possano accelerare o decelerare il processo di invecchiamento. Klang et al. hanno stabilito flussi di lavoro proteomici label-free in C. elegans per studiare il ruolo della metallostasi nella longevità¹⁰. In questo studio, sono stati utilizzati almeno 40.000 vermi per estrarre l'insolubloma¹⁰. I dati hanno mostrato che i livelli di ferro, rame, calcio e manganese aumentano con l'invecchiamento e che l'alimentazione dei vermi con una dieta ad alto contenuto di ferro ha accelerato significativamente l'accumulo di proteine insolubili legato all'età¹⁰. Utilizzando lo stesso flusso di lavoro per esaminare gli effetti della vitamina D sull'insolubloma di C. elegans, sono state quantificate 38 proteine nei vermi giovani (Giorno 2) e 721 proteine nei vermi anziani (Giorno 8). L'alimentazione con vitamina D ha ridotto significativamente l'insolubloma dei vermi anziani da 721 a 371 proteine¹¹. Ulteriori indagini hanno rivelato che l'alimentazione di vitamina D sopprime l'insolubilità proteica con l'età, promuove l'omeostasi proteica e prolunga la durata della vita nei vermi selvatici C.elegans N2¹¹. Pertanto, lo studio dell'insolubloma può aiutare a identificare nuovi modulatori dell'invecchiamento e delle malattie legate all'età.

Mentre lo studio dell'insolubloma è stato prezioso per far progredire la comprensione del processo di invecchiamento, è stato ostacolato dalla necessità di raccogliere grandi quantità di materiale campione di partenza. Groh et al. hanno recentemente introdotto un flusso di lavoro di quantificazione proteomica label-free per studiare i cambiamenti intrinseci dell'aggregazione proteica in C. elegans con l'invecchiamento ; Tuttavia, richiedeva grandi quantità di materiale di partenza (350 mg di vermi macinati)¹². Nel presente rapporto, abbiamo stabilito un nuovo protocollo di estrazione e isolamento migliorato (Figura 1). L'uso del sonicatore ad alta efficienza durante la lisi delle viti senza fine ha migliorato significativamente l'efficienza dell'estrazione e successivamente ha ridotto la quantità di materiale di partenza necessaria, da 40.000 a 3.000 vermi. La combinazione di questo nuovo protocollo di isolamento dell'insolubloma con un flusso di lavoro di spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati (DIA) senza marcatura ha migliorato significativamente la profondità e la copertura delle proteine. Il protocollo qui presentato è conveniente e facilmente modificabile per consentire l'esecuzione di analisi insolublome in altri sistemi modello.

Protocollo

NOTA: Per una migliore comprensione della procedura sperimentale, vedere la Figura 1 per uno schema del flusso di lavoro.

1. Coltura di massa dell'invecchiamento sincronizzato di C. elegans

1. Preparazione del piatto
   1. Versare 30 mL di agar NGM con o senza 50 mM di fluorodesossiuridina (FUdR) in ciascuna piastra da 90 mm e lasciare asciugare le piastre per 2 giorni in cappe di coltura.
   2. Il giorno prima della semina della piastra di agar NGM, inoculare un'aliquota di 50 μl di stock di glicerolo congelato del ceppo batterico OP50 in 1 L di terreno LB pre-autoclavato in un pallone da 2 L.
   3. Far crescere i batteri a 37 °C in un'incubatrice agitante a 250 giri/min per 16 ore.
   4. Dopo 16 ore, centrifugare le colture batteriche a una velocità di 5.000 x g per 10 minuti.
   5. Scartare il surnatante e risospendere completamente il pellet batterico in 40 mL di soluzione S-basale autoclavata (contenente 50 mM K₃PO₄, 100 mM NaCl in acqua) per generare la coltura di E. coli OP50 concentrata 25x.
   6. Erogare 2 mL di coltura batterica concentrata 25x su ciascuna piastra di agar NGM e distribuire uniformemente in modo che la coltura batterica copra l'intera superficie dell'agar.
   7. Rimuovere i coperchi dalle piastre in una cappa di coltura batterica per 2-3 ore fino a quando le piastre non si saranno asciugate correttamente.
      NOTA: Assicurati di distribuire uniformemente i batteri facendo roteare le piastre ogni 15 minuti. Questo è importante in quanto i batteri tendono a concentrarsi su un lato della piastra, dando luogo a regioni con bassa densità batterica.
   8. Dopo che le piastre sono asciutte, chiudere i coperchi e lasciare le piastre a temperatura ambiente per 48 ore per garantire la completa asciugatura della fonte alimentare OP50 E. coli .
      NOTA: Le piastre possono essere preparate con 2 settimane di anticipo e conservate a 4 °C prima dell'uso.
2. Mantenimento e preparazione di coorti sincronizzate di C. elegans
   1. Per ottenere l'input richiesto di lisato proteico (1,0-1,5 mg) per l'isolamento della frazione insolubile SDS, utilizzare circa 3.000 vermi sincronizzati per campione.
   2. Trasferire ~100 vermi adulti gravidi di tipo selvatico N2 su una piastra NGM 25x OP50 con semi di E. coli e mantenere i vermi a 20 °C per ~72 ore fino a quando la piastra non è piena di vermi adulti gravidi.
   3. Pipettare ~10 mL di soluzione S-basale su ciascuna piastra e raccogliere tutti i vermi in una provetta da 15 mL.
      NOTA: È importante utilizzare puntali a bassa ritenzione o pipette Pasteur durante questa e tutte le fasi future che prevedono la raccolta dei vermi per prevenire qualsiasi perdita di vermi dovuta all'attaccamento alle superfici dei puntali.
   4. Centrifugare il campione a 520 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante dopo la centrifuga. Per eliminare l'eventuale OP50 E. coli, aggiungere 10 mL di soluzione S-basale al pellet e centrifugare di nuovo, seguito dalla rimozione del surnatante. Ripetere questo passaggio.
   5. Aggiungere 10 mL di soluzione sbiancante di ipoclorito di sodio (contenente 0,5 M KOH e 0,48% di ipoclorito di sodio in acqua) al pellet di vermi in una provetta conica da 15 mL e agitare energicamente per 2 minuti a temperatura ambiente.
   6. Centrifugare a 520 x g per 30 s a temperatura ambiente per centrifugare i corpi dei vermi e le uova non completamente disciolti. Quindi rimuovere il surnatante.
   7. Ripetere i passaggi 1.2.5 e 1.2.6 per garantire la rimozione completa di tutti i corpi dei vermi e il rilascio delle uova (tubo di visualizzazione al microscopio per assicurare).
   8. Lavare il pellet d'uovo almeno 4 volte con 10 ml di soluzione S-basale per garantire la completa rimozione della soluzione di candeggina.
      NOTA: La rimozione completa della candeggina è importante in quanto la candeggina rimanente può ostacolare la schiusa delle uova.
   9. Lasciare le uova risospese in 5 mL di terreno S-basale in una provetta da 15 mL e metterle nel rotore a 20 °C per 24 ore per consentire la schiusa delle uova.
   10. Dopo 24 ore, prelevare 10 μL di soluzione di larve S-basali per contare il numero di vermi in essa contenuti. Utilizzare almeno tre aliquote separate di 10 μL di soluzione di larve S-basali per la replicazione della conta dei vermi. Calcola la media delle tre concentrazioni larvali. Sulla base della concentrazione media, diluire la soluzione di verme per ottenere ~3.000 larve per 200 μL di soluzione.
       NOTA: Assicurati di scuotere delicatamente il tubo capovolgendolo poiché le larve tendono a depositarsi se lasciate indisturbate e ciò può influire sul numero di larve.
   11. Mescolare bene e aggiungere 200 μl di soluzione di larve S-basali su ciascuna delle piastre con semi batterici NGM da 90 mm.
       NOTA: Aggiungere gocce di soluzione di larve S-basali in tutta la piastra per una distribuzione uniforme delle larve per evitare l'esaurimento batterico da determinati punti.
   12. Lasciare asciugare la soluzione S-basale e quindi posizionare le piastre capovolte in un'incubatrice a 20 °C per 48 ore.
   13. Dopo 48 ore, raccogliere i vermi dalla piastra in soluzione S-basale e trasferirli in una piastra fresca con semi NGM contenente 50 mM di FUDR e incubare le piastre a 20 °C.
       NOTA: È importante trasferire le viti senza fine all'inizio della fase L4 per garantire l'efficienza FUDR.
   14. Raccogliere i campioni del giorno 2 di giovani adulti dopo 48 ore aggiungendo 10 mL di soluzione S-basale sulla piastra e trasferendo la soluzione in una provetta da 15 mL. Lasciare che i vermi si depositino per gravità e rimuovere la soluzione S-basale dopo che diventa limpida.
   15. Lavare il pellet di verme 2-3 volte in 5 ml di soluzione S-basale per rimuovere eventuali batteri attaccati. Rimuovere quanta più soluzione S-basale possibile e congelare il pellet di verme (in provette da 15 mL) in un bagno di ghiaccio secco/etanolo. I campioni congelati vengono conservati a -80 °C.
   16. Trasferire i vermi del campione su una piastra NGM OP50 E . coli fresca contenente FUDR a giorni alterni fino al giorno 10. Raccogliere e congelare i vermi come descritto nei passaggi 1.2.14 e 1.2.15.
       NOTA: Iniziare con un numero maggiore di vermi per i campioni del giorno 10 per tenere conto di eventuali perdite di numero di vermi dovute al trasferimento e allo scavo.

2. Estrazione della frazione insolubile SDS dai vermi

1. Scongelare il pellet di verme congelato con ghiaccio in presenza di 900 μL di cocktail di tampone per lisi di vermi ghiacciato contenente 20 mM di base Tris, pH 7,4, 100 mM di NaCl, 1 mM di MgCl₂ e inibitore della proteasi senza EDTA. Brevemente i campioni a vortice per garantire la completa risospensione del pellet di verme nel tampone di lisi.
2. Posizionare le provette da 15 mL nel bagno di sonicazione e impostare per 10 cicli di sonicazione (30 s on e 30 s off per ogni ciclo) ad alta intensità. Ripetere per un massimo di cinque cicli (assicurarsi che i vermi siano completamente lisati).
3. Centrifugare il lisato a 3.000 x g per 4 minuti in cella frigorifera. Dopo la centrifugazione, scartare il pellet contenente eventuali detriti di vermi e trasferire con cura il surnatante in provette da centrifuga da 1,5 ml fresche preraffreddate su ghiaccio.
4. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando il saggio BCA. Trasferire le aliquote di lisato, che in genere contengono circa 1 mg di proteine, in provette da centrifuga fresche pre-raffreddate da 1,5 mL.
5. Centrifugare il lisato proteico per 15 minuti a 20.000 x g in cella frigorifera.
6. Senza disturbare il pellet, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca da 1,5 ml e conservarlo come frazione proteica acquosa solubile.
7. Lavare il pellet del passaggio precedente in 500 μL di tampone di lisi vermiforme contenente l'1% di SDS a temperatura ambiente e centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e salvarlo come frazione solubile SDS. Ripetere questa fase di lavaggio due volte per rimuovere l'eventuale frazione solubile in SDS. Il pellet rimanente dopo il terzo ciclo di lavaggio è definito come la frazione proteica insolubile SDS all'1%.
8. Risospendere il pellet proteico insolubile SDS in 60 μL di acido formico al 70% e agitare energicamente per sciogliere le proteine. Ripetere il vortice energico tutte le volte che è necessario per sciogliere il pellet.
9. Sonicare il pellet per 30 minuti in un bagno d'acqua a ultrasuoni a temperatura ambiente.
   NOTA: Il pellet insolubile SDS è in genere difficile da sciogliere nel tampone. Tuttavia, alla fine l'intero pellet dovrebbe essere sciolto in questo passaggio.
10. Asciugare i campioni in un concentratore sottovuoto per 1 ora per rimuovere completamente la soluzione di acido formico.
11. Aggiungere 40 μl di 1x tampone gel per campioni LDS al pellet essiccato e riscaldare il campione a 95 °C per 10 minuti. Agitare brevemente e far girare i campioni. Caricare 13 μl su un gel NUPAGE Bis-Tris al 4-12% e far scorrere il gel. Colorare il gel con un colorante proteico fluorescente per l'imaging. Conservare il resto del campione per l'analisi della spettrometria di massa (MS).
12. Caricare il campione rimanente in un gel di Bis-Tris al 4-12% e farlo funzionare per circa 20 minuti per la digestione MS in gel.

3. Digestione in gel con tripsina proteasi per isolare le proteine per l'analisi della SM

1. Preparare le seguenti soluzioni (fresche): 25 mM NH₄HCO₃ (pH 7-8), 25 mM NH₄HCO₃ in acetonitrile al 50% (ACN, pH 7-8) e ACN al 50% in acido formico.
2. Tagliare ogni fetta di gel in piccoli pezzi (in genere <1 mm²) e metterli in provette siliconate da 0,65 ml.
3. Aggiungere circa 100 μl (o abbastanza da coprire) di una soluzione 25 mM di NH₄HCO₃/50% ACN e agitare a temperatura ambiente per 10 minuti. Estrarre il surnatante e trasferirlo in una provetta separata (da scartare). Ripeti questo passaggio altre due volte.
4. Asciugare completamente i pezzi di gel in un concentratore sottovuoto (~20 min).
5. Preparare soluzioni fresche e aggiungere ~100 μL (o abbastanza da coprire) di 10 mM DTT in 25 mM NH₄HCO₃ ai pezzi di gel essiccati (utilizzare NH₄HCO₃ appena preparato). Vortice e gira brevemente. Lasciare procedere la reazione a 56 °C per 1 h e agitare a 1400 giri/min su un mixer.
6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 μL di 55 mM di iodoacetammide (IAA) in 25 mM NH₄HCO₃ ai pezzi di gel. Vortice e gira brevemente. Lasciare che la reazione proceda al buio per 45 minuti a RT.
7. Rimuovere il surnatante e gettarlo. Lavare i pezzi di gel aggiungendo ~100 μL di 25mM NH₄HCO₃ e agitare per 10 minuti. Centrifugare brevemente e rimuovere il surnatante, scartando quest'ultimo.
8. Disidratare i pezzi di gel aggiungendo ~100 μL (o abbastanza da coprire) di 25 mM NH₄HCO₃ in 50% ACN ai pezzi di gel e vortice per 10 minuti. Quindi centrifugare brevemente per rimuovere e scartare il surnatante. Ripeti questo passaggio due o anche una terza volta se i pezzi di gel non sono abbastanza asciutti, come indicato dalle dimensioni più piccole dei pezzi di gel e dal colore bianco torbido.
9. Asciugare completamente i pezzi di gel in un concentratore sottovuoto (~20 min).
10. Inizialmente aggiungere 15 μL di soluzione di tripsina (250 ng di tripsina) a ciascun campione, quindi aggiungere una quantità sufficiente di 25 mM NH₄HCO₃ per coprire i pezzi di gel (~100 μL). Vortice per 10 min. Quindi centrifugare brevemente e incubare a 4 °C in cella frigorifera per 30 minuti senza mescolare.
11. Aggiungere 25 mM NH₄HCO₃ secondo necessità per coprire completamente i pezzi di gel. Centrifugare e incubare a 37 °C per una notte per 16-20 ore a 1400 giri/min su un mixer.
12. Il giorno successivo, agitare brevemente e far girare la digestione. Aggiungere circa 100 μl di acqua HPLC, centrifugare, filmare la provetta e sonicare continuamente per 10 minuti. Girare brevemente dopo la sonicazione.
13. Trasferire la soluzione di digestione, che rappresenta l'estrazione acquosa, in una provetta siliconata pulita da 0,65 mL.
14. Aggiungere ~100 μL di acido formico al 50% ACN/5% ai pezzi di gel (abbastanza per coprirli), agitare 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare brevemente e raccogliere la soluzione e ripetere una volta. Raggruppare tutte le soluzioni contenenti i peptidi estratti da questa fase e dalla fase precedente 3.13 in un'unica provetta.
15. Vortice le digestioni estratte. Essiccare completamente i peptidi in un concentratore sottovuoto (~2 h).
16. Aggiungere 30 μL di acido formico allo 0,2% per risospendere i peptidi su un mixer nella cella frigorifera per 10 minuti.
17. Centrifugare i campioni a 1850 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Aspirare la soluzione peptidica e trasferirla in una nuova provetta siliconata pulita da 0,65 mL. Quindi desalinizzare la soluzione di peptidi utilizzando i puntali di desalinizzazione C18 (vedi sotto).

4. Desalinizzazione dei peptidi digeriti con punta di desalinizzazione C18

1. Impostare la pipetta su 10 μl e collegare il puntale di desalinizzazione C18. Inumidire il puntale di desalinizzazione pipettando 10 μl di ACN al 100% e poi eliminandolo. Ripetere questo passaggio 2 volte.
2. Lavare il puntale di desalinizzazione C18 pipettando 10 μl di ACN al 50%, acqua al 49,8% e FA allo 0,2% e quindi eliminandolo. Ripetere questo passaggio 2 volte.
3. Equilibrare il puntale di desalinizzazione C18 pipettando 10 μl di FA allo 0,2% in acqua e quindi eliminandolo. Ripetere questo passaggio 2 volte.
4. Impostare la pipetta a 10 μl e caricare i peptidi dalla soluzione alla resina pipettando i peptidi digeriti attraverso la resina su e giù per 15 volte.
   NOTA: L'azione ripetuta garantirà il legame di tutti i peptidi alla resina delle punte di desalinizzazione.
5. Dissalare i peptidi digeriti legati alla resina pipettando 10 μl di FA allo 0,2% in acqua e poi scartandoli. Ripetere questo passaggio 4 volte per completare la fase di desalinizzazione.
6. In una nuova provetta, eluire i peptidi con 10 μl di ACN al 50%, acqua al 49,8% e FA allo 0,2% pipettando su e giù 10x. Ripeti questo passaggio una volta per eluire il digestato proteico per la seconda volta nella stessa provetta.
7. Essiccare completamente i peptidi dissalati in un concentratore sottovuoto (~20 min).
8. Risospendere i peptidi in 15 μL di FA allo 0,2% + 1 μL di peptidi iRT (tempo di ritenzione indicizzato). Voxtex per 10 minuti, centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti, quindi trasferire in una fiala di autocampionatore per l'analisi della MS (vedi sotto).

5. Analisi in spettrometria di massa di peptidi digeriti mediante DDA e DIA

NOTA: I campioni possono essere analizzati utilizzando i metodi DDA o DIA LC-MS/MS. In questo studio, i campioni sono stati analizzati utilizzando un sistema HPLC nano-LC 2D accoppiato a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

1. Utilizzare un sistema HPLC combinato con un sistema HPLC basato su chip direttamente collegato a uno spettrometro di massa a tempo di volo a quadrupolo (possono essere utilizzate anche altre configurazioni e sistemi LC-MS).
2. Analizza i campioni utilizzando HPLC-ESI-MS/MS in fase inversa.
   1. Costruisci il protocollo cromatografico per caricare il campione di peptidi su un chip pre-colonna C18. Lavare e desalinizzare i peptidi caricati con solvente di carica (acido formico allo 0,1%) per 10 minuti a una velocità di flusso di 2 μl/min.
   2. Trasferire i peptidi in una colonna analitica chip C18 ed eluire a una velocità di flusso di 300 nL/min con un gradiente di 3 ore utilizzando la fase mobile A (2% acetonitrile, 0,1% acido formico) e B (98% acetonitrile, 0,1% acido formico). La prima fase di eluizione consiste in un gradiente lineare dal 5% B al 35% B per un periodo di 80 minuti.
   3. Aumentare la fase mobile B all'80% in 5 minuti, quindi mantenere la fase mobile B all'80% per 8 minuti prima di passare al 5% B per riequilibrare la colonna per 25 minuti.
3. Impostare un metodo MS instrument per DDA e definire i parametri dello strumento come segue.
   1. Utilizzare i seguenti parametri per l'Esperimento 1:Scansione ionica precursore MS1 da m/z 400 a 1500 (tempo di accumulo di 250 ms); impostare la soglia di intensità per attivare le scansioni MS/MS per ioni di stati di carica da 2-5 a 200 conteggi; impostare l'esclusione dinamica degli ioni precursori a 60 s).
   2. Utilizzare i seguenti parametri per l'Esperimento 2: Scansioni ioniche del prodotto MS/MS con un intervallo di scansione MS2 compreso tra m/z 100 e 1500 (tempo di accumulo di 100 ms per ciascuna delle 30 scansioni ioniche del prodotto per ciclo); impostare la diffusione dell'energia di collisione su CES=5 e selezionare "Modalità di scansione ionica del prodotto ad alta sensibilità".
      NOTA: Il metodo di acquisizione DDA viene utilizzato per creare librerie spettrali come descritto nel passaggio 6.3 (vedere di seguito). Qui, acquisirà spettri MS/MS per i 30 ioni precursori più abbondanti dopo ogni scansione MS1 per ciclo; Il tempo di ciclo totale è di circa 3,3 s.
4. Impostare un metodo di strumento MS per DIA e definire i parametri strumentali come segue.
   1. Utilizzare i seguenti parametri per l'Esperimento 1: scansione ionica precursore MS1 da m/z 400-1250 (tempo di accumulo di 250 ms).
   2. Utilizzare i seguenti parametri per l'Esperimento 2: Scansioni ioniche del prodotto MS/MS per 64 segmenti SWATH variabili con un intervallo di scansione MS2 da m/z 100-1500 (tempo di accumulo di 45 msec per ciascuna delle 64 scansioni ioniche del prodotto per ciclo); impostare la diffusione dell'energia di collisione su CES=10, selezionare "Modalità di scansione ionica del prodotto ad alta sensibilità".
      NOTA: Utilizzare il metodo di acquisizione DIA/SWATH a finestra a 64 variabili come descritto da Schilling et ^al.13 per eseguire la quantificazione senza marcatura con un tempo di ciclo totale di circa 3,2 s. Per l'acquisizione DDA, invece di utilizzare il quadrupolo Q1 per trasmettere lo ione precursore di un intervallo di massa ristretto alla cella di collisione, viene utilizzato un intervallo di larghezza variabile della finestra (ad esempio m/z 5-90) per passare in modo incrementale sull'intero intervallo m/z (m/z 400-1250) con 64 segmenti SWATH, tempo di accumulo di 45 ms per ciascun segmento, con un tempo di ciclo di 3,2 secondi, che include una scansione MS1 con un tempo di accumulo di 250 ms. La larghezza variabile della finestra viene regolata in base alla complessità della tipica corrente ionica MS1 osservata entro un certo intervallo m/z utilizzando un algoritmo SCIEX "calcolatore a finestra variabile"¹³ (finestre più strette vengono applicate agli intervalli m/z "occupati", finestre più larghe vengono applicate agli intervalli m/z con pochi ioni precursori a eluizione). Su altre piattaforme MS, è possibile implementare anche strategie alternative di selezione delle finestre DIA.

6. Analisi dei dati

NOTA: Alcune impostazioni di analisi dei dati devono essere adattate a specifiche condizioni sperimentali. Ad esempio, il database delle proteine (file fasta) selezionato dipenderà dalla specie da cui è stato preparato il campione (in questo protocollo abbiamo utilizzato C. elegans).

1. Utilizza un motore di ricerca di database MS per analizzare le acquisizioni di DDA e identificare le proteine. Genera un metodo del motore di ricerca darabase come segue:
   1. Per Parametri descrizione campione, selezionare Identificazione; in Tipo di campione, selezionare Acido iodoacetico; in Alchilazione della cisteina, selezionare Tripsina; in Digestione (supponendo la scissione C-terminale alla lisina e all'arginina), selezionare il nome dello spettrometro di massa in Strumento; e seleziona Caenorhabditis elegans in Specie.
   2. Per i parametri di Lavorazione Specifici, controllare Modifiche Biologiche; alla voce ID Focus, selezionare SwissProt; in Database, selezionare ID completo; in Sforzo di ricerca, selezionare 0,05 (10%) in Soglia proteica rilevata; e selezionare Esegui analisi del tasso di falsi rilevamenti in Qualità risultati. Salva il metodo del motore di ricerca e invia i file non elaborati MS al motore di ricerca del database per l'elaborazione, utilizzando il metodo generato.
      NOTA: In un processo iterativo, tutte le scansioni MS e MS/MS sono state ricalibrate automaticamente dal motore di ricerca in base alle annotazioni e ai risultati iniziali.
2. Fare clic su Esporta riepilogo peptide al termine della ricerca e filtrare tutti i risultati dell'identificazione dei peptidi in base alla soglia di confidenza di 99 in Excel (tasso di falsa scoperta (FDR) = 1%).
3. Costruire librerie spettrali MS/MS per l'ulteriore elaborazione del file di dati grezzi DIA e per un'ulteriore quantificazione dei dati relativi.
   1. Aprire il software di analisi quantitativa DIA. Seleziona la scheda Libreria , quindi (nella parte inferiore della pagina) fai clic su Genera libreria spettrale da "Motore di ricerca database" e apri un rapporto FDR "Motore di ricerca database" (il file del foglio di calcolo *FDR.xlsx) che è stato generato automaticamente come parte del processo di ricerca del database del file di dati grezzi DDA.
   2. Fare clic su Avanti, selezionare lo schema delle impostazioni della libreria e fare clic su Avanti. Selezionare Uniprot_Caenorhabditis _proteome come database, quindi fare clic su Fine, verrà generata la libreria spettrale.
4. Utilizza il software di analisi quantitativa DIA per analizzare le acquisizioni DIA per una quantificazione completa delle proteine relative. La pipeline di analisi dei dati DIA è descritta come segue.
   1. Per analizzare e quantificare i peptidi, aprire il software di analisi quantitativa DIA per impostare uno schema di analisi utilizzando lo schema modello. Lo schema del modello è disponibile nel software facendo clic su Impostazioni, quindi su Analisi DIA e infine su Impostazioni di fabbrica BGS.
   2. Impostare i parametri nello schema del modello come segue:
      1) in Identificazione selezionare Localizzazione PTM (cutoff di probabilità = 0,75).
      2) in quantificazione, selezionare Quantità gruppo principale come Somma quantità peptide, impostare il gruppo principale N come Max 7 e Min 1, selezionare Quantità gruppo minore come quantità precursore Somma e impostare il gruppo minore N come Max 10 e Min 1 e selezionare Filtro dati come Qvalue sparso e non selezionare Normalizzazione Cross Run.
5. Esecuzione dell'analisi di quantificazione relativa.
   1. Selezionare la scheda Pipeline , fare clic su Imposta un'analisi DIA da file, aprire i file raw MS DIA di interesse (ad esempio: campione e controllo), fare clic su Assegna libreria spettrale, selezionare la libreria generata nella versione 6.3, fare clic su Carica e infine fare clic su Avanti.
   2. Selezionare lo schema di analisi impostato nella versione 6.5.1 e fare clic su Avanti. Selezionare il file fasta del database appropriato (in questo protocollo: Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) e fare clic su Avanti. Definire l'impostazione della condizione e assegnare le diverse condizioni in base ai campioni, quindi fare clic su Avanti.
   3. Esaminare la panoramica dell'analisi (riepilogo della configurazione dell'esperimento) e passare alla directory di output e fare clic su Fine. Infine, fare clic su Esegui pipeline per eseguire l'analisi quantitativa senza etichetta.
      NOTA: I moduli statistici del "DIA Quantitative Analysis Software" eseguono automaticamente l'analisi FDR, generano mappe di calore e grafici vulcanici confrontando le diverse condizioni, generano elenchi di peptidi e proteine identificati e quantificati e forniscono valori Q insieme a variazioni di piega relative confrontando diverse condizioni. In questo caso, l'impostazione delle condizioni campione includeva vermi invecchiati al giorno 10 con due repliche biologiche e vermi giovani al giorno 2 con due repliche biologiche come controllo.

Risultati

I metodi tradizionali di lisi dei vermi presentano vari svantaggi. Ad esempio, la sonicazione basata su sonda e i metodi di battitura delle microsfere producono un calore eccessivo consentendo il contatto della punta o delle perle metalliche direttamente con i campioni, con conseguente recupero e denaturazione variabili delle proteine. La macinazione dell'azoto liquido, seguita dalla sonicazione nel tampone di lisi, può richiedere molto tempo e richiede un gran numero di vermi. A causa delle limitazioni dei metodi tradizionali di lisi dei vermi, i precedenti flussi di lavoro MS, come i metodi di marcatura iTRAQ o i metodi label-free che sono stati storicamente utilizzati nel sistema di modelli di C. elegans per ottenere informazioni quantitative sull'insolubloma, richiedono un grande input di materiale di partenza (almeno 40.000 vermi). Per ottenere questo numero di vermi è necessario un laborioso lavoro di coltura dei vermi. Inoltre, i metodi di etichettatura richiedono costose etichette chimiche isobariche. I metodi di quantificazione senza marcatura sono convenienti e hanno metodi di preparazione ed etichettatura dei campioni più semplici e diretti, ma richiedono un numero significativamente elevato di vermi per ottenere una copertura sufficiente dell'analisi MS.

Il sonicatore che abbiamo utilizzato aumenta notevolmente l'efficienza e la riproducibilità della lisi dei vermi lisando più campioni di vermi contemporaneamente in un sonicatore a bagno d'acqua a temperatura controllata senza contaminazione incrociata¹⁴, riducendo così significativamente la quantità di materiale di partenza dei vermi richiesto. Combinando il metodo di sonicazione altamente efficiente e l'approccio MS quantitativo senza marcatura DIA, siamo stati in grado di quantificare in modo robusto l'insolubloma di vermi vecchi e giovani utilizzando ~3.000 vermi. Qui abbiamo testato e convalidato l'efficienza del protocollo e confrontato l'insolubolma di vermi vecchi e giovani di un ceppo di vermi di tipo selvatico, N2-Bristol C. elegans. Abbiamo applicato questo protocollo per estrarre e isolare l'insolubloma da ~3.000 N2 C. elegans di età e giovani (due repliche biologiche per ciascuna condizione), seguita dall'analisi MS con uno spettrometro di massa a tempo di volo a quadrupolo o altri sistemi MS utilizzando una combinazione di acquisizione dipendente dai dati (DDA) e acquisizioni indipendenti dai dati (DIA/SWATH) per l'identificazione e la quantificazione delle proteine. Le proteine insolubili sono state prima analizzate su un gel a gradiente Bis-Tris 4-12% per determinare la quantità di proteine in ciascun campione di insolubloma. Come dimostrato nella Figura 2, il campione di insolubloma di vermi di età N2 (corsie 2 e 3, esperimenti di replicazione biologica) ha significativamente più proteine rispetto ai campioni di vermi giovani N2 (corsie 1 e 4, esperimenti di replicazione biologica).

Dopo la digestione in gel, i profili proteici dell'insolubloma sono stati analizzati mediante HPLC-MS. Utilizzando questo flusso di lavoro, siamo in grado di identificare in genere 1000-1500 proteine e quantificare 500-1.000 proteine dalla frazione insolubile SDS con un'elevata riproducibilità (dati non pubblicati). Qui siamo stati in grado di quantificare 989 proteine dall'insolubloma di N2-Bristol C. elegans analizzando i dati DIA e rimuovendo la ridondanza: 768 proteine erano significativamente arricchite e 27 proteine erano significativamente diminuite nell'insolubloma del verme N2 invecchiato (giorno 10) rispetto ai giovani (giorno 2) utilizzando un fold-change di almeno 1,5 e un valore Q inferiore a 0,01 (Figura 3A). Come si vede nel grafico dell'istogramma (Figura 3B), il fold-change di proteine significativamente alterate mostra una distribuzione normale. È stato dimostrato che i vermi invecchiati sono significativamente arricchiti per l'insolubloma: il cambiamento più grande osservato ha mostrato che l'abbondanza relativa di proteine nell'insolubloma è 592 volte superiore nei vermi anziani rispetto a quelli giovani; E per 32 proteine, l'abbondanza proteica relativa nell'insolubloma era >250 volte superiore nei vermi anziani rispetto a quelli giovani, indicando drammatici cambiamenti nell'insolubloma con l'età.

Dopo aver estratto l'elenco delle proteine insolubili che sono significativamente aumentate nei vermi invecchiati e identificate dalla base del verme (WS271), sono state eseguite analisi del percorso KEGG e dell'ontologia genica (GO) per determinare i percorsi che sono arricchiti nell'insolubloma invecchiato per ottenere informazioni biologiche su come questi si relazionano all'invecchiamento. L'analisi della via KEGG delle proteine identificate in questo studio mostra l'arricchimento di diverse vie che coinvolgono ribosomi, mitocondri, proteasoma e spliceosoma (Figura 4A). L'analisi dell'ontologia genica mostra che l'insolubloma dei vermi invecchiati comprende molte proteine in categorie particolari, tra cui le proteine mitocondriali, dello sviluppo, determinanti della durata della vita adulta e ribosomiali (Figura 4B e Tabella supplementare 1A). Abbiamo poi confrontato l'elenco delle proteine identificate in questo studio con il lavoro precedentemente pubblicato da David et ^al.2 e Mark et ^al.11 , come dimostrato nei diagrammi di Venn (Figura 5A, 5B). Il confronto ha mostrato una significativa sovrapposizione delle proteine identificate 394/721 e 444/721 con lo studio di David et al (Figura 5A) e Mark et al. (Figura 5B), rispettivamente. I percorsi biologici rivelati dall'analisi KEGG dell'insolubloma da questo studio sono stati identificati anche in passato, convalidando così la nostra metodologia (Tabella supplementare 1B). L'identificazione di questi percorsi e proteine suggerisce che potrebbero servire come candidati per ulteriori indagini biologiche riguardo alla loro funzione nel contesto dell'invecchiamento.

In sintesi, l'uso dell'efficiente metodo di sonicazione consente la lisi di più campioni di vermi contemporaneamente in un ambiente con temperature ben controllate e ridotta contaminazione incrociata per ottenere un'elevata copertura proteica con una quantità significativamente inferiore di materiale di vermi di partenza. La combinazione dell'efficiente metodo di sonicazione con un flusso di lavoro di quantificazione delle proteine senza marcatura DIA ha fornito risultati affidabili e riproducibili per la quantificazione delle proteine insolubili dei vermi.

Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale del protocollo. C. elegans veniva allevato e raccolto in giorni diversi. Dopo la lisi dei vermi con un sonicatore, la frazione proteica insolubile SDS all'1% (insolubloma) è stata estratta e isolata dal lisato. L'insolubloma è stato quindi digerito tramite digestione di tripsina in gel e quantificato tramite spettrometria di massa DIA, seguita da analisi bioinformatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Gel SDS-PAGE dell'insolubloma isolato giovani contro vecchi vermi del ceppo N2-Bristol. Gli insolublomi dei vermi giovani rispetto a quelli vecchi del ceppo N2-Bristol sono stati analizzati mediante SDS-PAGE per determinare la quantità di proteina presente. Il gel SDS-PAGE è stato colorato con un colorante proteico fluorescente per visualizzare le bande proteiche. Corsie 1 e 4: Insolubloma da due esperimenti di replica biologica di giovani vermi N2 (Giorno 2). Corsie 2 e 3: Insolubloma da due esperimenti di replica biologica di vermi N2 invecchiati (Giorno 10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Le proteine candidate sono state identificate come caratterizzate da un'alterazione significativa nell'insolubloma anziano rispetto a quello giovane e nelle loro distribuzioni di fold-change. (A) Grafico del vulcano per la quantificazione dell'insolubloma dei vermi N2-Bristol invecchiati rispetto a quelli giovani. I candidati con una variazione di piega assoluta >=1,5 e un valore Q <0,01 vengono visualizzati come punti rossi. (B) Grafico a istogramma per la distribuzione a variazione di piega di proteine insolubili SDS significativamente arricchite in campioni di vermi anziani rispetto a giovani campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Analisi del percorso KEGG e dell'ontologia genica (GO). (A) Analisi della via KEGG dell'insolubloma del giorno 10 organizzato in base al valore p con la via altamente significativa mostrata in alto. (B) L'analisi dell'ontologia genica mostra che l'insolubloma dei vermi invecchiati è arricchito per molte proteine in particolari categorie tra cui le proteine mitocondriali, dello sviluppo, determinanti della durata della vita adulta e ribosomiali. La visualizzazione del grafico a dispersione visualizza i termini GO in uno "spazio semantico" in cui i termini più simili sono posizionati più vicini tra loro. Il colore della bolla riflette il valore p ottenuto nell'analisi STRING, mentre la sua dimensione riflette la generalità del termine GO nel database UniProt-GOA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Sovrapposizione delle proteine insolublome identificata nell'insolubloma del giorno 10 confrontando questo studio con gli studi (A) David et ^al.2 e (B) Mark et ^al.11 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1 (relativa alla Figura 4 e alla Figura 5). (A) Ontologia genica (processo biologico) analizzata con database STRING. (B) Elenco dettagliato delle proteine e delle vie KEGG identificate in questo studio con codici colore che descrivono la loro sovrapposizione con il lavoro pubblicato. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo protocollo, riportiamo un metodo di preparazione del campione migliorato per l'estrazione di proteine insolubili da C. elegans. Sostituendo la tradizionale lisi dei vermi (ad esempio, la sonicazione della sonda o le tecniche di battitura delle microsfere) con l'efficiente sonicatore, abbiamo aumentato la resa dell'estrazione delle proteine insolubili e ridotto il numero di vermi necessari per l'analisi MS senza marcatura da 40.000 a 3.000 vermi. È stato utilizzato un motore di ricerca in un database per l'identificazione delle proteine a partire dai dati DDA e la libreria spettrale di C. elegans è stata creata utilizzando il "DIA Quantitative Analysis Software" e i corrispondenti risultati di ricerca nel database DDA (importando i rapporti dei file FDR generati dal motore di ricerca del database). La quantificazione relativa dei dati insolublomi di C. elegans invecchiati e giovani è stata effettuata utilizzando il "DIA Quantitative Analysis Software" per elaborare il nuovo set di dati DIA e la libreria spettrale generata.

Diversi passaggi sono fondamentali nel protocollo. La breve durata di vita di C. elegans lo rende un sistema ideale per studiare l'invecchiamento, rispetto ad altri eucarioti come le cellule dei mammiferi, ma è fondamentale isolare una popolazione omogenea di vermi quando si studiano i fenomeni legati all'invecchiamento. FUDR è stato utilizzato in questo protocollo per ottenere worm con invecchiamento sincronizzato. È importante trasferire i vermi all'inizio del loro stadio L4 sulla piastra con semina NGM contenente FUDR per garantirne l'efficacia. Durante la lisi delle viti senza fine con l'efficiente sonicatore, la temperatura del bagno d'acqua deve essere impostata a 4 °C e la sonicazione a 30 s ON e 30 s OFF per evitare il surriscaldamento dei campioni. Dopo il primo ciclo di sonicazione per 10 cicli (10 minuti), è importante controllare al microscopio per assicurarsi che tutti i vermi siano stati lisati in modo efficiente. In caso contrario, sono necessari più cicli di sonicazione. Durante il processo di digestione in gel, ogni fetta di gel deve essere tagliata a cubetti in pezzi della dimensione corretta (<1 mm²): se troppo piccoli, potrebbero andare persi nel processo di preparazione del campione e, se troppo grandi, la digestione potrebbe essere inadeguata.

La necessità di una quantità di materiale di partenza molto inferiore riduce significativamente il laborioso lavoro associato alla coltura di vermi per ottenere campioni per le analisi dell'insoluboloma. Tuttavia, l'estrazione e l'isolamento della frazione proteica insolubile SDS all'1% comporta più fasi di lavaggio ed è necessaria un'attenta manipolazione del campione per evitare la perdita di campione e garantire risultati riproducibili. La quantità di materiale generata per l'analisi MS è sufficiente per ~3 iniezioni per le successive analisi DDA e DIA, ma non per risparmiare per esperimenti futuri. Inoltre, nonostante i suoi effetti potenzialmente confondenti¹⁵, abbiamo utilizzato la più bassa concentrazione possibile di FUdR per sterilizzare i vermi durante il processo di invecchiamento. Studi futuri potrebbero eludere l'uso del FUdR utilizzando mutanti sterili o trasferendo e raccogliendo manualmente i vermi.

L'uso del sonicatore altamente efficiente per la lisi dei vermi consente un'estrazione efficiente dell'insolubloma, consentendo una buona copertura proteica e un'analisi DIA MS senza marcatura a costi contenuti per quantificare l'insolubloma utilizzando un numero notevolmente ridotto di vermi. Riduce significativamente il carico di lavoro, consentendo lo screening di più condizioni per esperimento. Inoltre, il flusso di lavoro MS DIA senza marcatura è conveniente e fornisce profondità e copertura delle proteine a livelli paragonabili ai metodi di marcatura tra cui iTRAQ, TMT o SILAC. Il modello di C. elegans è un sistema di screening rapido per la ricerca sull'invecchiamento. Il flusso di lavoro può essere facilmente modificato e applicato per studiare l'invecchiamento e la ricerca sulle malattie legate all'età in questo e in altri organismi. Ad esempio, negli studi in corso stiamo applicando questo flusso di lavoro per studiare i profili proteici dell'insolubloma e della proteostasi in vari modelli di C. elegans per la malattia di Alzheimer (AD), tra cui Abeta, tau e doppi vermi Abeta/tau con o senza diversi interventi farmacologici per un futuro screening farmacologico ad alto rendimento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppi utilizzati
Esherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (Bristol)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Solution
NGM (Nematode Growth Media)			Ricetta: 3&sottilesp; g/L NaCl, 23  g/L agar; 2,5&sottile; g/L peptone; 1&sottile; mM CaCl2, 5  mg/L di colesterolo, 1  mM MgSO4, 25&sottilesp; mM KH2PO4
Soluzione basale			S Ricetta: 5,85 g/L di NaCl, 1 g/L di K2HPO4, 6 g/L di KH2PO4, H2O in 1 L di
		candeggina di ipoclorito di sodio	Ricetta: Mescolare 0,5 mL di NaOH 5 N con 1 ml di ipoclorito di sodio (5%) e portare il volume a 5 mL con H20.
Materiale/ Attrezzatura
Agar	Difco Agar granulato, BD Biosciences	90000-782
Dispositivo di sonicazione Bioruptor Plus	Diagenode, USA	B01020001
Colesterolo	Sigma	c8503
2'-deossi-5-fluorouridina	VWR	TCD2235
glicerolo	Millipore Sigma	356350-1000ML
LB brodo, Miller	Millipore Sigma	60801-450
Sodio dodecil solfato (SDS?	Sigma	L4509-250G
Cloruro di sodio	Sigma	59888
M880 Bagno ad ultrasuoni, 117 V, contiene 5,5 galloni	VWR, USA	89375-458
Solfato di magnesio	Sigma	M506
Cloruro di magnesio	Sigma	208337
NGM piastra di agar	VWR Piastre di Petri monouso VWR	25384-342
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE protein gels, 4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
Cocktail di inibitori della proteasi (PIC)	Roche	11836170001
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Ipoclorito di sodio 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S12000
MS Section
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 colonna	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Ammonio bicarbonato	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	9830 (1 kg)
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	T1317-1EA
Acido formico	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Standard del peptide di normalizzazione del tempo di ritenzione indicizzato (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, Svizzera	Ki-3002-2
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
Metanolo, HPLC Grade	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	34885
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (chip pre-colonna) (200 um x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 300 A)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 um da 15cm, C18-CL, 3 um, 120 A (chip per colonna analitica)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001
Spettrometro di massa a quadrupolo ortoganolo a tempo di volo (QqTOF) TripleTOP 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Per preventivo
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	download del software Sciex
Concentratore Savant SPD131DDA Speedvac	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Tripsina liofilizzata di grado sequenziale	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurigo, Svizzera	Sw-3001
SWATH 2.0 plugin in PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	download del software Sciex
Sistema HPLC Ultra Plus nano-LC 2D	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	Modello # 845
Water, Burdick e Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	600-30-76
Sistema di pompaggio HPLC binario Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Rivelatore UV a doppia lunghezza d'onda Waters 2487	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Autocampionatore Waters 717plus	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878