Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

Summary

Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Abstract

L'analisi dell'espressione genica del tessuto renale umano è uno strumento importante per comprendere l'omeostasi e la fisiopatologia delle malattie. È necessario aumentare la risoluzione e la profondità di questa tecnologia ed estenderla al livello di cellule all'interno del tessuto. Sebbene l'uso del sequenziamento dell'RNA a singola e singola cellula si sia diffuso, le firme di espressione delle cellule ottenute dalla dissociazione tissutale non mantengono il contesto spaziale. La microdisezione laser (LMD) basata su specifici marcatori fluorescenti consentirebbe l'isolamento di strutture specifiche e gruppi cellulari di interesse con la localizzazione nota, consentendo così l'acquisizione di firme trascritomiche ancorate spazialmente nel tessuto renale. Abbiamo ottimizzato una metodologia LMD, guidata da una rapida macchia a base di fluorescenza, per isolare cinque compartimenti distinti all'interno del rene umano e condurre il successivo sequenziamento dell'RNA da preziosi campioni di tessuto renale umano. Presentiamo anche parametri di controllo qualità per consentire la valutazione dell'adeguatezza dei campioni raccolti. Il flusso di lavoro delineato in questo manoscritto mostra la fattibilità di questo approccio per isolare le firme trascrittimiche sottoserticate con grande fiducia. L'approccio metodologico qui presentato può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto con sostituzione di marcatori anticorpali pertinenti.

Introduction

I progressi tecnologici nello studio dei campioni di tessuto hanno migliorato la comprensione dello stato di salute e delle malattie in vari organi. Tali progressi hanno sottolineato che la patologia può iniziare in regioni limitate o in specifici tipi di cellule, ma hanno importanti implicazioni sull'intero organo. Pertanto, nell'attuale era della medicina personalizzata, è importante comprendere la biologia sia a livello cellulare che regionale e non solo a livello globale¹. Ciò è particolarmente vero nel rene, che è composto da varie cellule e strutture specializzate che avviano e/o rispondono in modo differenziato allo stress patologico. La patogenesi di vari tipi di malattia renale umana non è ancora ben compresa. La generazione di una metodologia per studiare i cambiamenti nell'espressione genica in specifici segmenti tubolari, strutture o aree dell'interstizio nel rene umano migliorerà la capacità di scoprire cambiamenti specifici della regione che potrebbero informare sulla patogenesi della malattia.

Gli esemplari di biopsia renale umana sono una risorsa limitata e preziosa. Pertanto, le tecnologie che interrogano la trascritomica nel tessuto renale dovrebbero essere ottimizzate per economizzare il tessuto. I metodi disponibili per studiare la trascrittomica a livello cellulare e regionale includono il sequenziamento dell'RNA a singola cella (scRNaseq), il RNaseq nucleare singolo (snRNaseq), l'ibridazione spaziale in situ e la microdisezione laser (LMD). Quest'ultimo è adatto per un preciso isolamento di regioni o strutture di interesse all'interno di sezioni tissutali, per il sequenziamento e l'analisi dell'RNA a valle^2,3,4,5. LMD può essere adottato per fare affidamento sull'identificazione di specifici tipi di cellule o strutture basate su marcatori convalidati utilizzando l'imaging a base di fluorescenza durante la dissezione.

Le caratteristiche uniche della trascrittomica regionale assistita da microdisezione laser includono: 1) la conservazione del contesto spaziale di cellule e strutture, che integra le tecnologie a singola cellula in cui le cellule sono identificate per espressione piuttosto che istologicamente; 2) la tecnologia informa ed è informata da altre tecnologie di imaging perché un marcatore anticorpale definisce le firme di espressione; 3) la capacità di identificare le strutture anche quando i marcatori cambiano nella malattia; 4) rilevazione di trascrizioni a bassa espressa in circa 20.000 geni; e 5) notevole economia tissutale. La tecnologia è scalabile a una biopsia renale con uno spessore inferiore a 100 μm di un nucleo necessario per una sufficiente acquisizione di RNA e consente l'uso di tessuti congelati archiviati, che sono comunemente disponibili in grandi depositi o centri accademici⁶.

Nel lavoro che ne è seguito, descriviamo in dettaglio la tecnologia trascrittamica regionale e di massa, ottimizzata con un nuovo protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per l'uso con tessuto renale umano. Questo approccio migliora le esplorazioni LMD classiche perché fornisce dati di espressione separati per i sottoserti di interstizio e nefrone rispetto all'espressione tubulointerstiziale aggregata. Sono incluse le misure di garanzia della qualità e di controllo attuate per garantire rigore e riproducibilità. Il protocollo consente la visualizzazione di cellule e regioni di interesse, con conseguente acquisizione soddisfacente di RNA da queste aree isolate per consentire il sequenziamento dell'RNA a valle.

Protocol

Lo studio è stato approvato per l'uso da parte dell'Institutional Review Board (IRB) dell'Indiana University.

NOTA: Utilizzare questo protocollo con tessuto nefromia renale (fino a 2 cm sia nelle dimensioni X che Y) conservato nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) e conservato a -80 °C. Eseguire tutto il lavoro in modo da limiti la contaminazione da RNA, utilizzare guanti monouso puliti e una maschera facciale. Garantire la pulizia di tutte le superfici. L'apparecchiatura per la quale questo protocollo è stato ottimizzato è un sistema di microdisezione laser con laser UV pulsato.

1. Criosezione

1. Esporre diapositive a membrana PPS LMD da 1,2 μm (solfuro di poli(p-fenilene) alla luce UV (in una cappa di flusso laminare di coltura tissutale) per 30 minuti, immediatamente prima della criosezione. Conservare le diapositive a temperatura ambiente per un'aderenza ottimale ai tessuti.
2. Raffreddare il criostato a -20 °C. Pulire le superfici di lavoro e installare una nuova lama da taglio.
3. Posizionare una piccola scatola scorrevole (pulita con soluzione di decontaminazione superficiale RNasi) all'interno della camera criostatica per conservare le diapositive con tessuto appena tagliato.
4. Aderire il campione in OCT a un porta tessuto e consentirgli di equilibrare per alcuni minuti per raggiungere la temperatura della camera e rafforzare l'adesione tra il blocco OCT e il supporto. Aiutare il processo utilizzando un estrattore di calore.
5. Tagliare il campione a uno spessore di 12 μm e apporrlo sul vetrino LMD specializzato, utilizzando l'adattatore di scorrimento. Ogni diapositiva contiene una sezione di nefrectomia per diapositiva o fino a due sezioni di biopsia renale per diapositiva. Conservare i vetrini a -80 °C con una cartuccia essiccante e all'interno di un sacchetto di plastica ben chiuso per evitare che l'umidità in eccesso si accumuli all'interno della scatola scorrevole.
6. Etichettare ogni diapositiva con un ID campione, una data e un numero di diapositiva.
7. Utilizzare le diapositive con campioni entro 10 giorni dalla data iniziale della criosezione.

2. Microdisezione laser

1. Immediatamente prima della colorazione, preparare la miscela di anticorpi (Ab-Mix) in BSA al 10% in PBS privo di RNasi aggiungendo quanto segue: 4 μL di FITC-Phalloidin, 1,5 μL di DAPI, 2 μL di anticorpo della proteina Tamm-Horsfall (THP) coniugati direttamente ad Alexa Fluor 546, 3,3 μL di inibitore della RNasi e 89,2 μL di 10% di BSA in PBS (per raggiungere un volume di 100 μL).
   NOTA: Anticorpi alternativi possono essere utilizzati al posto dell'anticorpo THP. Ad esempio, 2 μL di anticorpo megalina/LRP2, coniugato direttamente ad Alexa Fluor 568, possono essere utilizzati per etichettare il tubulo prossimale. L'Ab-Mix contiene anticorpi LRP2 o THP (per visualizzare rispettivamente tubuli prossimali o arti ascendenti spessi). Altri anticorpi possono essere convalidati in base alle esigenze dell'utente.
2. Lavare lo scivolo in ghiaccio freddo (-20 °C) acetone al 100% per 1 minuto e spostarlo nella camera di umidità.
3. Lavare la parte superiore della diapositiva con PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
4. Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
5. Applicare l'Ab-Mix per 5 min.
6. Lavare la parte superiore dello scivolo con BSA al 10% in PBS privo di RNasi per 30 s. Ripetere.
7. Asciugare all'aria lo scivolo per 5 minuti e caricarlo sulla piattaforma di taglio della microdisezione laser.
8. Installare i tubi di raccolta (tubi di microcentrifugo autoclavati da 0,5 ml) appropriati per il lavoro pcr, contenenti 50 μL di extraction buffer dal kit di isolamento dell'RNA.
9. Procedere con LMD. Completa ogni sessione LMD entro un massimo di 2 ore.
   1. Raccogli immagini immunofluorescenza pre e post-LMD, utilizzando la fotocamera del microscopio per convalidare la dissezione per la variabilità inter-operatore, nonché scopi di archiviazione, formazione e valutazione della qualità del protocollo eseguito. Per ottenere 0,5 - 1 ng di RNA, è richiesta un'area minima di 500.000^{μm 2.} Ciò richiede spesso l'uso di sezioni spesse fino a 8 x12 μm per ottenere una quantità sufficiente di materiale per tutti i sottoserti di interesse.
   2. Identificare le regioni di interesse macchiando, morfologia e posizione e asportandole utilizzando una potenza laser superiore a 40.
      NOTA: Ecco i criteri di dissezione. Il tubulo prossimale è definito dall'etichettatura FITC-Phalloidin e LRP2. L'arto ascendente spesso è definito dall'etichettatura THP. Il condotto di raccolta è definito dalla morfologia nucleare (DAPI) e dall'assenza di altre macchie. Il glomerulus è definito da FITC-Phalloidin e morfologia. L'interstizio è definito come l'area tra i tubuli macchiati.
10. Ottenere una firma di espressione di sezione trasversale di massa apporre due sezioni da 12 μm su una diapositiva LMD e sezionare le intere sezioni nel buffer di estrazione.
11. Al termine del processo LMD, chiudere i tubi di microcentrifugo di raccolta e svolazzarlo vigorosamente per assicurarsi che il contenuto si sposti dal tappo alla parte inferiore del tubo
12. Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 30 s.
13. Incubare i tubi in bagno d'acqua a 42 °C per 30 minuti.
14. Centrifugare i tubi a 3.000 x g per 2 min.
15. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 0,5 ml e conservarlo in -80 °C.

3. Isolamento dell'RNA

NOTA: Per questo protocollo di isolamento dell'RNA, abbiamo adattato un protocollo da un kit di isolamento dell'RNA commerciale. Il protocollo del produttore è stato modificato per soddisfare i requisiti di controllo qualità stabiliti per il progetto.

1. Aggiungere 250 μL di Tampone condizionato (CB) a ciascuna colonna di purificazione dell'RNA (PC) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Centrifuga tutti i PC per 1 min a 16.000 x g.
3. Aggiungere 50 μL di 70% di etanolo (fornito nel kit) nei tubi con campioni di tessuto. Mescolare bene i campioni pipettando su e giù. Non vortice. Non centrifugare.
4. Trasferire la miscela in PC condizionati e centrifugare per 2 min a 100 x g (per legare l'RNA), seguire rapidamente con centrifugazione per 30 s a 16.000 x g (per rimuovere il flusso attraverso). Ripetere questo passaggio se sono disponibili più di 1 tubo con campioni di tessuto per un determinato sottosezione.
5. Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 1 (WB1) nei PC e centrifugare per 1 minuto a 8.000 x g.
6. Preparare 40 μL di DNasi per ogni campione (aggiungere 5 μL di DNA a 35 μL di tampone RDD). Quindi aggiungere 40 μL della miscela direttamente sulla membrana del PC e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 40 μL di WB1 sulla membrana del PC e centrifugare per 15 s a 8.000 x g.
8. Aggiungere 100 μL di Wash Buffer 2 (WB2) sulla membrana del PC e centrifugare per 1 min a 8.000 x g.
9. Aggiungere 100 μL di WB2 sulla membrana del PC, centrifugare per 2 min a 16.000 x g,seguire immediatamente per centrifugazione per 1 min a 16.000 x g.
10. Trasferire il PC su un nuovo tubo da 0,5 ml.
11. Aggiungere 12 μL di Elution Buffer (EB) sulla membrana e incubare per 7 minuti a temperatura ambiente. Pertanto, il volume finale di tutti i campioni di tessuto sezionato raggruppati è di 12 μL per sottoseme.
12. Centrifugare i campioni per 1 min a 1.000 x g e quindi per 2 minuti a 16.000 x g.
13. Trasferire 2 μL in un tubo fresco per l'analisi del bioanalyzer (per prevenire eventi di congelamento-disgelo).
14. Conservare tutti i tubi a -80 °C fino a quando non sono pronti per un'ulteriore lavorazione.

4. Sequenziamento dell'RNA

1. Valutare ogni campione, destinato al sequenziamento, per la qualità utilizzando un Bioanalyzer commerciale e un chip dedicato alla misurazione di piccole quantità di RNA.
2. Sono necessari seguenti parametri di controllo qualità (QC) prima della preparazione e del sequenziamento della libreria: quantità di RNA maggiore di 4 ng per la massa e maggiore di 0,5 - 1 ng per ogni sottosezione; La percentuale di trascrizioni più lunghe di 200 nucleotidi (DV200) deve essere superiore al 25% per i campioni LMD (ottimale > 75%).
3. Eseguire la preparazione della biblioteca con un kit di preparazione della libreria cDNA commerciale destinato a piccole quantità di RNA degradato. Per il kit commerciale elencato nel supplemento, si consiglia di utilizzare l'opzione 2, che richiede un DV200 minimo del 25% e nessuna frammentazione. Alcune tecnologie di sequenziamento potrebbero richiedere soglie DV200 minime più elevate, ad esempio il 30%⁷.
4. Aggiungere adattatori e indici cDNA.
5. Purificare le librerie RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche.
6. Esaurire il cDNA ribosomiale utilizzando un kit di rimozione dell'rRNA commerciale prima della fase di amplificazione della libreria RNAseq.
7. Purificare l'ultima libreria RNAseq utilizzando la tecnologia delle perline magnetiche a una concentrazione di libreria cDNA da 2 ng/μL.
8. Effettuare il sequenziamento dell'RNA di 75 bp abbinato su un sistema di sequenziamento commerciale con 30 milioni di letture/campioni per la massa e 100 milioni di letture/campioni per le sezioni sottoserticate.
9. Utilizzare un RNA di riferimento (25 μg) ad ogni corsa di sequenziamento per consentire il controllo dell'effetto batch. La concentrazione iniziale del nostro RNA di riferimento è di 1 μg/μL, mentre la concentrazione finale utilizzata nel sequenziamento è di 25 ng/μL.
10. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando l'applicazione FastQC per valutare la qualità delle letture sequenzianti, intergeniche e mitocondriali e per determinare le letture attribuite a un gene.
11. Utilizzare Integrative Genomics Viewer (IGV) per l'allineamento e edgeR/rbamtools per le misure di espressione della trascrizione.
12. Rimuovere campioni con meno di 100.000 letture. Quantile normalizza le letture grezze nel set di dati dopo aver filtrato i geni poco espressi a una soglia definita dall'utente.
13. Quantificare l'espressione come rapporto tra il sottosezione di interesse e la media di tutti gli altri sottoserti e log2-transform. L'espressione relativa dello stesso gene può essere confrontata tra sottosemi e campioni; tuttavia, non è ideale confrontare l'espressione relativa tra due geni diversi a causa di potenziali differenze di degradazione tra geni e specie di RNA.
14. Effettuare un'analisi di arricchimento per confrontare l'espressione genica per un insieme di produttori specifici di ogni sottosezione di nefro, mentre i campioni di RNA di riferimento vengono confrontati tra i lotti. Un effetto batch entro 1 deviazione standard dell'espressione media con valore R > 0,9 è considerato accettabile. È necessaria una normalizzazione aggiuntiva per un punteggio di effetto batch più elevato. Qualsiasi esecuzione che si discosta dall'effetto batch accettato può essere contrassegnata. Il Q30 deve essere maggiore di >90% per ogni esecuzione di sequenziamento.

Results

Campioni

Presentiamo i dati di nove nefrectomie di riferimento (3 esemplari ottenuti presso l'Indiana University e 6 esemplari ottenuti attraverso Kidney Precision Medicine Project), utilizzando il protocollo di colorazione a fluorescenza rapida per isolare i segmenti di nefro renale e le aree interstiziali. Le sezioni utilizzate in questo processo sono state ottenute da donatori renali deceduti o nefrectomie tumorali non colpite. Questi campioni non hanno avuto prove patologi...

Discussion

La trascritomica basata su LMD è una tecnologia utile che ancora l'espressione genica a aree specifiche all'interno del tessuto. La base di questa tecnologia e la sua potenziale applicazione nel rene è stata descritta in precedenza⁸. Tuttavia, l'ottimizzazione, la modernizzazione e la razionalizzazione della dissezione basata sulla fluorescenza specificamente finalizzata alla dissezione ad alta precisione per il sequenziamento dell'RNA a valle è meno onnipresente. Poiché questa metodologia è spazi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalizzatore	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Cartuccia essiccante	Bel-Art	F42046-0000
Il tampone DNAse	Qiagen	79254	RDD è incluso nel
pacchetto Microscopio per microdissezione laser	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Anticorpo	Abcam	ab76969	Direttamente coniugato ad Alexa Fluor 568
Provette per microcentrifuga	ThermoFisher	AB-0350
Fotocamera per microscopio	Leica	DFC700T
PBS ( Senza RNAsi)	VWR	K812-500ML
Falloidina (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
vetrini a membrana PPS	Leica	11505268
qPCR Riferimento umano RNA totale 25 &; g	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAsi Inhibitor ThermoFisher		AM2696
Sequencer (HiSeq o NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R& D Systems	AF5144	Direttamente coniugato ad Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583