Articolo metodologico

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

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DOI:

10.3791/61388

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14 novembre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Abstract

L'ictus ischemico è una condizione clinica caratterizzata da ipoperfusione di tessuto cerebrale, che porta alla privazione di ossigeno e glucosio, e la conseguente perdita neuronale. Numerose prove suggeriscono che l'interazione tra cellule gliali e neuronali esercitano effetti benefici dopo un evento ischemico. Pertanto, per esplorare potenziali meccanismi protettivi, è importante sviluppare modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia in un ambiente ischemico. Qui presentiamo un approccio semplice per isolare gli astrociti e neuroni dalla corteccia embrionale del ratto, e che utilizzando specifici mezzi di coltura, permette la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia con alto rendimento e riproducibilità.

Per studiare il crosstalk tra astrociti e neuroni, proponiamo un approccio basato su un sistema di co-coltura in cui i neuroni colti in coperture vengono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti placcati in piastre multiwell. Le due culture sono tenute a parte da piccole sfere di paraffina. Questo approccio consente la manipolazione indipendente e l'applicazione di trattamenti specifici per ogni tipo di cellula, che rappresenta un vantaggio in molti studi.

Per simulare ciò che accade durante un ictus ischemico, le colture sono sottoposte a un protocollo di privazione di ossigeno e glucosio. Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per studiare il ruolo delle interazioni neurone-glia nell'ictus ischemico.

Introduzione

Secondo i dati dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 5,5 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di un ictus ischemico1. Questa condizione è caratterizzata dall'interruzione del flusso sanguigno in una determinata regione del cervello, con conseguente perdita reversibile o irreversibile nell'apporto di ossigeno e sostanze nutritive al tessuto, che altera la funzione del tessuto e porta a disfunzione mitocondriale, disregolazione del calcio, ecitotossicità del glutammato, infiammazione e perdita cellulare2,3.

Oltre alle cellule vascolari, le cellule neuronali e gliali sono coinvolte nella fisiofisiologia dell'ictus ischemico4. In particolare, gli astrociti sono essenziali per il mantenimento dei neuroni e recentemente hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico nella risposta alla lesione ischemica5. Questo tipo di cellula gliale svolge funzioni di supporto strutturale, difesa contro lo stress ossidativo, sintesi di neurotrasmettitori, stabilizzazione della comunicazione cellulare-cellula, tra gli altri6. Insieme ai neuroni, gli astrociti svolgono un ruolo diretto nella trasmissione sinaptica, regolando il rilascio di molecole come l'adenosina triphosfato, l'acido gamma-aminobutyrico e il glutammato7. Parte della lesione indotta dall'ischemia è causata dall'eccessivo rilascio di glutammato e dal suo accumulo alla fessura sinaptica, che porta all'eccessiva attivazione dei recettori N-methyl-D-aspartate, attivando le cascate di segnalazione a valle, con conseguente ecitotossicità8. Poiché gli astrociti sono in grado di rimuovere il glutammato dalla fessura sinaptica e convertirlo in glutammina, sono fondamentali per difendersi dall'eccitatossicità, esercitando così un effetto neuroprotettivo sull'ischemia. Queste cellule svolgono anche un ruolo nella neuroinfiammazione indotta da ischemia. Dopo l'insulto ischemico, gli astrociti attivati subiscono cambiamenti morfologici (ipertrofia), proliferano e mostrano un aumento dell'espressione della proteina acida fibrillale gliale (GFAP). Possono diventare reattivi (astrogliosi), rilasciando citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-α, l'interleuchina-1 e l'interleuchina-1β, e producendo radicali liberi, tra cui ossido nitrico e superossido, che a sua volta possono indurre la morte neuronale9,10. Al contrario, gli astrociti reattivi possono anche svolgere un effetto neuroprotettivo, poiché rilasciano citochine antinfiammatorie, come trasformare il fattore di crescita-β, che viene regolato dopol'ictus 11. Inoltre, possono generare una cicatrice gliale, che può limitare la rigenerazione dei tessuti inibendo la germogliazione assonale; tuttavia, questa cicatrice gliale può isolare il sito di lesione dal tessuto vitale, impedendo così un'ondata a cascata di danni ai tessutiincontrollati 12,13.

Pertanto, è imperativo stabilire modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia sotto una lesione ischemica al fine di trovare strategie terapeutiche che limitino o inverodino gli effetti della lesione ischemica. Rispetto ad altri modelli utilizzati per studiare le lesioni ischemiche, vale a dire i modelli in vivo 14,15,16, le colture organotipiche17,18,19 e le fette cerebrali acute20,21,22, le colture cellulari primarie sono meno complesse, il che rende possibile lo studio dei singoli contributi di ogni tipo di cellula nella fisiofisiologia dell'ictus ischemico e come ogni tipo di cellula risponde a possibili bersagli terapeutici.22 Tipicamente, al fine di studiare le interazioni tra colture arricchite di neuroni e colture arricchite di astrociti, i neuroni e le cellule gliali di origine postnatale vengonoutilizzati 23,24, o cellule gliali postnatali e neuroni embrionali25,26. Qui viene proposto un approccio semplice per stabilire colture arricchite di neuroni o astrociti e colture neurone-glia dallo stesso tessuto. Queste cellule primarie sono ottenute dalla corteccia embrionale del ratto, una regione spesso colpitadall'ictus 27,28. Inoltre, la dissociazione del tessuto viene eseguita solo con una procedura meccanica. Pertanto, questo protocollo consente di isolare le cellule nella stessa fase di sviluppo, in modo rapido ed economico e con elevate prestazioni e riproducibilità.

L'incrocio tra astrociti e neuroni può essere esplorato utilizzando un sistema di co-coltura in cui i neuroni colturati in co-lips sono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti semi di placche multiwell. Piccole sfere di paraffina possono essere utilizzate per garantire la separazione delle due colture cellulari. Questo approccio consente la manipolazione indipendente di ogni tipo di cella prima che siano portati in contatto. Ad esempio, è possibile silenziare un gene specifico negli astrociti e vedere come può influenzare la vulnerabilità neuronale o la protezione contro i danni indotta dall'ischemia. Un metodo consolidato per indurre condizioni ischemiche in vitro è la privazione di ossigeno e glucosio (OGD)3, che consiste nel sostituire l'atmosfera regolare (95% aria e 5% CO2) da un'atmosfera anossica (95% N2 e 5% CO2), associata all'omissione di glucosio.

Il metodo descritto è adatto per studiare le interazioni tra neuroni e astrociti nel contesto dell'ictus ischemico, in modo semplice, veloce, riproducibile ed economico.

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Protocollo

Tutti gli animali utilizzati sono stati allevati presso il Centro di ricerca sulla scienza della salute CICS-UBI in conformità con i requisiti etici nazionali per la ricerca sugli animali e con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (direttiva 2010/63/UE).

1. Coltura delle cellule primarie della corteccia embrionale di ratto

  1. Preparazione media della coltura
    1. Preparare il Neurobasal Medium (NBM) aggiungendo i seguenti integratori: 2% B27, 0,5 mM di glutammina, 25 glutammato di M e 120 g/mL di gentamina. Omogeneizzare, regolare il pH a 7,2 e sterilizzare il mezzo con una fase di filtrazione sottovuoto, utilizzando un filtro da 0,22 m. Per la coltura di cellule neurone-glia, integrare il mezzo di coltura cellulare NBM con il 10% del siero bovino fetale inattivato dal calore (HI-FBS).
    2. Preparare il mezzo minimo di aquila media essenziale (MEM) con i seguenti integratori: carbonato di idrogeno di sodio 2,2 g/L, insulina da pancreas bovino 5 mg/L, anidrosio D-glucosio 3,4 g/L, penicillina (12 U/mL) /streptomycin (12 g/mL) e 10% HI-FBS. Omogeneizzare, regolare il pH a 7.2 e sterilizzare il mezzo con un passo di filtrazione.
  2. Preparazione dei materiali e delle attrezzature
    1. Forare la parte terminale di una punta di micropipette di plastica da 1 mL da un lato all'altro, utilizzando un ago con un diametro specifico (0,5 mm per S; 0,6 mm per M; 0,8 mm per L) e sigillare l'apertura della punta utilizzando una fiamma.
    2. Sterilizzare tutte le vetreria. Durante la dissezione tenere gli strumenti utilizzati (ad esempio, forbici, pinzette, bisturi) immersi nel 70% di etanolo. Spruzzare i materiali con il 70% di etanolo prima di entrarli nella camera di flusso laminare.
    3. Impostare la temperatura del bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e posizionare il mezzo di coltura cellulare nel bagno d'acqua prima di iniziare la procedura.
      NOTA: Per i test di immunocitochimica, il rivestimento poli-D-lisina deve essere eseguito in piastre multiwell contenenti coperture.
  3. Coltura della corteccia embrionale del ratto
    1. Rimuovere gli embrioni di ratto da un ratto Wistar femmina con 15-16 giorni di gestazione (la fine dell'accoppiamento, che dovrebbe durare 24 h, è considerata il primogiorno dello sviluppo embrionale). A tal fine, anestetizzare la femmina con ketamina (87,5 mg/kg) e xylazina (12 mg/kg) e rimuovere gli embrioni. Quindi eutanasia il ratto femmina per lussazione cervicale, seguendo il protocollo standard.
    2. Mettere gli embrioni in un tubo sterile di 50 mL, aggiungere la salina tampone di fosfato (PBS) fino a quando non copre gli embrioni e portarli rapidamente nella stanza di coltura.
    3. Ancora all'interno del sacco del tuorlo, mettere gli embrioni in un piatto Petri contenente 25 mL di PBS freddo. Con l'aiuto di forbici e pinzette, rompere il sacco tuorlo, rimuovere l'embrione e trasferirlo in un altro piatto Petri contenente anche PBS freddo. Il PBS nel piatto Petri dovrebbe essere sufficiente a coprire l'intero embrione.
      NOTA: Fare attenzione quando si apre il sacco del tuorlo per evitare di danneggiare l'embrione. In 1.3.3 e 1.3.4 abbiamo utilizzato piatti Petri di 90 mm di diametro posti sopra confezioni di ghiaccio ricoperte di carta assorbente per mantenere il PBS a bassa temperatura.
    4. Per la dissezione dell'embrione, trasferirlo in un altro piatto Petri contenente 30 mL di PBS freddo. Posizionare l'embrione sotto un microscopio sezionante e immobilizzarlo usando una pinze. Rendere l'incisione iniziale parallela alla corteccia, passando dalla cavità oculare alla fine del muso e fare attenzione a non decapitare l'animale.
    5. Rimuovere con attenzione il cuoio capelluto e le meningi utilizzando una pinzetta, al fine di non danneggiare il tessuto cerebrale corticale. Fare l'incisione successiva per separare la corteccia. Trasferire il tessuto corticale in un tubo di 15 mL contenente 5 mL di PBS utilizzando una pipetta Pasteur.
    6. Eseguire la digestione meccanica del tessuto cerebrale corticale utilizzando le punte di plastica da 1 mL preparate in 1.2.1. Triturate 10 volte con una pipetta regolare e ripetere il processo utilizzando pipette con fori progressivamente più piccoli (L, M e S), fino a quando i pezzi sono caduti a pezzi.
    7. Dopo la digestione meccanica, centrifugare la sospensione a 400 x g per 3 min. Scartare il supernatant e risundere il sedimento con il mezzo di coltura cellulare appropriato precedentemente riscaldato a 37 gradi centigradi.
    8. Determinare il numero totale di cellule presenti nella sospensione cellulare (densità cellulare) utilizzando una camera Neubauer, effettuare le diluizioni appropriate e placcare le cellule. La densità cellulare iniziale è stata definita sulla base di uno studio precedente5.
      1. Per una coltura arricchita da neuroni, utilizzare 0,21 x 106 cellule/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule nel mezzo di coltura NBM senza HI-FBS.
      2. Per le colture neurone-glia utilizzare 0,14 x 106 cellule/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule nel mezzo di coltura NBM integrato con 10% HI-FBS.
      3. Per una coltura arricchita di astrociti, utilizzare 0,26 x 106 celle/cm2 come densità cellulare iniziale e mantenere le cellule in MEM integrate come indicato in precedenza.
      4. Collocare le cellule in un'incubatrice fissata a 37 gradi centigradi, 95% O2 e 5% CO2.
        NOTA: Per periodi di coltura più lunghi, è necessario aggiungere un anti-mitotico, ad esempio 27 s M 5-fluoro-2, con 68 sM uridina, per sopprimere la crescita cellulare.

2. Sistema di co-coltura

  1. Preparazione dei materiali
    1. Riscaldare la paraffina a 150 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento per circa 7 minuti. Tenere a 150 gradi centigradi fino a completare la procedura. Quindi, con l'aiuto di una pipetta Pasteur in vetro sterile di 1 mm di diametro, aggiungere una piccola goccia sopra le coperture sterilizzate e rivestite con PDL. Le sfere di paraffina sono irregolari, ma hanno un diametro di circa 2 mm. Le sfere permetteranno alle due culture di essere separate di circa 1,25 mm.
    2. Poiché la paraffina non è sterile, posizionare il multiwell con le sfere di paraffina sotto la radiazione ultravioletta per 15 min.
    3. Per stabilire la co-coltura, trasferire il coverslip con le sfere di paraffina utilizzando un pinzetta precedentemente immerso nel 70% di etanolo per 15 min.
  2. Co-cultura
    1. Quando le due colture sono pronte all'uso (cioè dopo 7 giorni in coltura alle condizioni di cui al punto 1.3.8), trasferire i neuroni semiti nelle coperture con sfere di paraffina ai pozzi contenenti gli astrociti.
    2. 24 h prima che le due culture siano portate a contatto, cambiare il mezzo di coltura dei neuroni e degli astrociti in NBM integrato, o meno, con HI-FBS, a seconda dello scopo dell'esperimento.
    3. Dopo aver messo entrambi i tipi di cellule in contatto, attendere 8-12 h prima di iniziare i diversi stimoli e procedure.
      NOTA: la rappresentazione schematica del sistema di co-impostazioni cultura è illustrata nella Figura 1.

3. Privazione di ossigeno e glucosio

  1. Preparazione media della cultura
    1. Per gli esperimenti OGD, utilizzare la soluzione di sale bilanciata di Hank (HBSS). Preparare il supporto HBSS con i seguenti reagenti: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Omogeneizzare e regolare il pH a 7.2. Sterilizzare il mezzo filtrando.
      NOTA: Se appropriato, integrare la soluzione HBSS con glucosio (HBSSglu), aggiungendo 5,56 mM di glucosio. Per le colture presentate a OGD non integrare il mezzo HBSS con glucosio (HBSSglu-).
  2. Procedura OGD
    1. 7 giorni dopo la semina delle cellule, rimuovere il mezzo di coltura e lavare due volte con HBSSglu-. Dopo il lavaggio aggiungere il mezzo di coltura delle cellule HBSSglu e posizionare il multiwell nella camera dell'ipossia.
    2. Sigillare la camera di ipossia e aggiungere una miscela di gas contenente 95% N2/5% CO2 per 4 min con un flusso di 20 L/min per rimuovere l'ossigeno presente all'interno della camera. Dopo questo, fermare il flusso e posizionare la camera di ipossia in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 4 h o 6 h, a seconda dell'estensione dell'ischemia prevista.
    3. Dopo il periodo di OGD, sostituire il supporto HBSSglu- con il mezzo di coltura appropriato per le procedure rimanenti.
      NOTA: L'esperimento OGD mira a simulare le condizioni in vitro che le cellule subiscono durante un evento ischemico, quindi è importante certificare che tutti i media utilizzati in precedenza vengono rimossi.

4. Analisi dell'immunocitochimica

NOTA: Eseguire l'analisi dell'immunocitochimica come descritto in precedenza5.

  1. In breve, per caratterizzare le diverse colture corticali, incubare le cellule durante la notte a 4 gradi centigradi con coniglio anti-GFAP (1:2000) e proteina associata al topo anti-microtubulo 2 (MAP2; 1:500); e poi 1 h a temperatura ambiente con i seguenti anticorpi secondari: anti-coniglio coniugato ad Alexa Fluor 546 e anti-mouse coniugato ad Alexa Fluor 488, entrambi a 1:1000 diluizione.
  2. Etichettare i nuclei cellulari mediante incubazione con 2 M Hoechst 33342 per 10 min a temperatura ambiente.
  3. Montare le coperture in fluorescenza nel mezzo di montaggio e acquisire immagini su un microscopio epifluorescenza con un ingrandimento 63x.

5. Analisi statistica

  1. Esprimere i dati come percentuale del numero totale di cellule o come percentuale di controllo e presentati come l'errore standard medio ± della media (SEM) di almeno 3 esperimenti indipendenti eseguiti in triplice.
  2. Eseguire analisi statistiche con il software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), utilizzando il test t di Student non accoppiato. I risultati sono stati considerati significativi quando i valori di p < 0.05.

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Risultati

Per caratterizzare le colture, l'immunocitochimica per valutare il numero di cellule che esprimevano GFAP o MAP2, marcatori ampiamente utilizzati di astrociti e neuroni (Figura 2), è stata eseguita in ogni tipo di coltura corticale. Questa analisi ha rivelato che le colture arricchite di astrociti presentavano il 97% delle cellule che esprimevano GFAP (Figura 2A). Per quanto riguarda la coltura arricchita di neuroni 78% delle cellule espresse MAP2, 4% delle cell...

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Discussione

Il metodo qui descritto consiste nell'isolamento dell'astrocito e del neurone dal tessuto corticale embrionale del ratto, consentendo la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia. È stato adattato da un precedente studio del nostro gruppo5, dove sono stati descritti l'isolamento delle colture embrionali corticali neurone-glia e neurone-arricchite e le due culture caratterizzate. Utilizzando queste colture, Roque et al. ha scoperto che gli astrociti svolgono un r...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario da parte di Fundao para a Ciància e a Tecnologia attraverso i progetti UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e la borsa di studio SFRH/BD/135936/2018 a JP, di ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' attraverso il progetto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e il finanziamento alla Piattaforma PPBI-Portoghese di BioImaging attraverso il Progetto POCI-01-0145-FEDER-022122.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di coltura a 24 pozzettiThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 bombola di gasArLí quido
Anti-topo coniugato ad Alexa Fluor 488InvitrogenA11001diluizione 1/1000; periodo di incubazione - 1 h a temperatura ambiente
Anti-coniglio coniugato ad Alexa Fluor 546InvitrogenA11010diluizione 1/1000; periodo di incubazione - 1 h a temperatura ambiente
integratore di B27 (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescence Mounting MediumDakoS3023
D-glucosio anidroFisher ScientificG/0450/603,4 g/L
Microscopio per epifluorescenzaZeissAxioObserver Z1x63x obiettivo
Fetale Siero Bovino (FBS)BiochromS061510%
GentamicinaSigma-AldrichG1272120 &; g/mL
GlutammatoSigma-AldrichG841525µ M
GlutamminaSigma-AldrichG31260,5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µ M; periodo di incubazione - 10 minuti a temperatura ambiente
Camera di incubazione per ipossiaStemcell Technologies27310Camera utilizzata per l'induzione dell'OGD
Insulina da pancreas bovinoSigma-AldrichI55005 mg/L
KetaminaSigma-AldrichK-00287,5 mg/Kg
Minimo Essenziale Medio Eagle medioSigma-AldrichM0268riscaldare fino a 37 ° C prima dell'uso
Topo Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421diluizione 1/500; periodo di incubazione durante la notte a 4 ° C
Mezzo neurobasaleGibco21103-049riscalda fino a 37 gradi C prima dell'uso
Pastiglie di paraffina per istologiaSigma-Aldrich1.07164Punto di solidificazione 56-58° C
ParaformaldeideSigma -AldrichP61484% in PBS
Penicilina/StreptomicinaBiochromA 2213penicillina (12U/mL) /streptomicina (12µ g/mL)
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP1024
Coniglio Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 diluizione; periodo di incubazione durante la notte a 4 ° C
Carbonato acido di sodioFisher ScientificS/4240/602,2 g/L
XilazinaSigma-AldrichX112612 mg/Kg

Riferimenti

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