Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.
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Articolo metodologico
RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microRNA (miRNA) sono una classe di RNA non codificanti endogenamente espressi, da 21 nt piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell'espressione genica sia nelle piante che negli animali. La maggior parte dei miRNA agisce come interruttori negativi dell'espressione genica mirata ai geni chiave. Nelle piante, le trascrizioni primarie di miRNA (pri-miRNA) sono generate dalla polimerasi RNA II e formano lunghezze variabili di strutture stabili ciclo-stelo chiamate pre-miRNA. Un endonuclease, simile a Dicer1, elabora i pre-miRNA in duplex miRNA-miRNA. Uno dei filamenti del duplex miRNA-miRNA è selezionato e caricato sulla proteina Argonaute 1 o sui suoi omologhi per mediare la scissione degli mRNA bersaglio. Sebbene i miRNA siano molecole chiave di segnalazione, il loro rilevamento viene spesso effettuato con metodi non ottimali basati sulla PCR anziché con un'analisi sensibile delle macchie settentrionali. Descriviamo un metodo settentrionale semplice, affidabile ed estremamente sensibile che è ideale per la quantificazione dei livelli di miRNA con una sensibilità molto elevata, letteralmente da qualsiasi tessuto vegetale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per confermare la dimensione, la stabilità e l'abbondanza di miRNA e dei loro precursori.
Introduzione
La recente scoperta di piccoli RNA regolatori, i microRNA, ha guidato la ricerca nella loro comprensione e del loro ruolo nelle piante e negli animali1. I precursori lunghi dei miRNA vengono elaborati in miRNA maturi da 21 a 24 nt da HYL1 e specifiche proteine simili adicer2,,3. Un miRNA da 22 nt può avviare il silenziamento a cascata generando siRNA secondari4. Gli studi hanno dimostrato il ruolo dei miRNA e dei siRNA secondari nello sviluppo, nel destino cellulare e nelle risposte allo stress5,6.
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Protocollo
1. Preparazione di un gel di poliacrilammide denatura 15%
- Pesare e aggiungere 4,8 g di urea, aggiungere 3,75 mL del 40% di acrilammide: soluzione bisacrilamide (19:1) e 1 mL di 10x TBE pH 8.2 in un tubo sterile da 50 mL.
- Sciogliere l'urea con un bagno d'acqua impostato a 60 gradi centigradi in una soluzione chiara.
- Make-up il volume a 10 mL utilizzando acqua sterile appena autoclaved e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione fresca per solifati di ammonio al 10%.
2. Assemblaggio delle lastre di vetro e dell'unità di elettroforesi
- Lavare tutto l'apparat....
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Risultati
In questa dimostrazione, abbiamo rilevato e quantificato l'espressione di miR397 in diversi tessuti di indica var whiteponni (Figura 1). miR397 è un miRNA da 22 nt e miRNA conservato. L'espressione di miR397 può essere rilevata in tutti i campioni testati. Secondo i dati di sequenziamento di nuova generazione, il campione 1 (tessuto di semina) ha miR397 a 5 letture per milione (rpm). Abbiamo rilevato il suo segnale comodamente, indicando che il metodo è molto sensibile e pu.......
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Discussione
Questo metodo può essere ampiamente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di piccoli RNA, compresi i miRNA meno abbondanti. Il protocollo descrive principalmente i passaggi per decolorare l'RNA totale in un buffer di carico, la separazione delle dimensioni mediante elettroforesi gel, il trasferimento di RNA in una membrana, il collegamento incrociato dell'RNA sulla membrana e l'ibridazione utilizzando sonde oligo radioetichettate desiderate.
Il passo critico per qualsiasi esperime.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono l'accesso al laboratorio di radiazioni fornito dall'istituto ospitante e BRIT per il radioisotopo. Il laboratorio PVS è supportato dal National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Svizzera/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India. MP riconosce DBT-Research Associateship, DBT, Government of India.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40% | Sigma | A9926 | |
| Persolfato di ammonio (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Carta assorbente carta assorbente | whatmann I | 1001-125 | |
| Blu di bromofenolo | Sigma | B5525-5G | |
| Punte di caricamento capillare | BioRad | 2239915 | |
| Deionizzato formamide | Ambion | AM9342 | |
| Blocco riscaldante | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon | membrana GE | RPN203B | |
| Bottiglia di ibridazione | Sigma | Z374792-1EA | |
| Forno di ibridazione | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Scanner per tifoni | 29187194 | |
| Schermo e cassetta PhosphorImager | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipette | Gilson, modelli: P20 e P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Pipetta in plastica | Falcon | 357550 | |
| Apparecchio in gel di poliacrilammide | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 colonna | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac concentratore | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polinucleotide chinasi (PNK) | NEB | M0201S | |
| Apparecchio Transblot | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb tampone di ibridazione | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Bagno d'acqua | NEOLAB | D-8810 | |
| Xilene cianolo | Sigma | X4126-10G |
Riferimenti
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.
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Ristampe e permessi
