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Articolo metodologico

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

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DOI:

10.3791/61403

⸱

7 ottobre 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Abstract

Gli organoidi testicolari forniscono uno strumento per studiare lo sviluppo testicolare, la spermatogenesi e l'endocrinologia in vitro. Sono stati sviluppati diversi metodi per creare organoidi testicolari. Molti di questi metodi si basano sulla matrice extracellulare (ECM) per promuovere l'assemblaggio dei tessuti de novo, tuttavia, ci sono differenze tra i metodi in termini di morfologia biomimetica e funzione dei tessuti. Inoltre, vi sono pochi confronti diretti dei metodi pubblicati. Qui, viene effettuato un confronto diretto studiando le differenze nei protocolli di generazione organoide, con i risultati forniti. Vengono descritti quattro metodi di generazione archetipica: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free e (4) 3D ECM culture. Tre parametri di riferimento primari sono stati utilizzati per valutare la generazione organoide testicolare. Questi sono l'auto-assemblaggio cellulare, l'inclusione dei principali tipi di cellule (Sertoli, Leydig, germe e cellule peritubulari) e l'architettura dei tessuti opportunamente compartimentata. Dei quattro ambienti testati, le colture 2D ECM e 3D ECM-free hanno generato organoidi con morfologie interne più simili ai tester nativi, tra cui la compartimentazione de novo dei tipi di cellule tubolari rispetto a quelle interstiziali, lo sviluppo di strutture simili a tubuli e una funzione endocrina consolidata a lungo termine. Tutti i metodi studiati utilizzavano sospensioni cellulari testicolari murine primarie nonsortite e usavano risorse di coltura comunemente accessibili. Queste tecniche di generazione organoide testicolare forniscono un toolkit altamente accessibile e riproducibile per iniziative di ricerca sull'organogenesi testicolare e la fisiologia in vitro.

Introduzione

Gli organoidi testicolari sono una tecnica pionieristica per lo studio dello sviluppo testicolare, della spermatogenesi e della fisiologia in vitro1,,2,,3,,4. Diversi metodi sono stati esplorati per la generazione organoide; questi includono una varietà di sistemi di coltura extracellulari (ECM) e senza ECM, sia negli orientamenti bidimensionali (2D) che tridimensionali (3D). Diversi metodi di generazione possono promuovere strategie di assemblaggio cellulare distinte; ciò si traduce in un alto livello di variabilità morfologica e funzionale tra i modelli organoidi pubblicati. Lo scopo di questo articolo è discutere lo stato attuale dei modelli testicolari in vitro e servire da modello per i futuri ricercatori, quando si progettano esperimenti organoidi testicolari. All'interno del presente studio, quattro diversi archetipi del sistema di coltura sono definiti e caratterizzati in processo sperimentale e risultato biologico. Questi includono: metodi di coltura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. Le strategie qui presentate sono destinate ad essere semplici, accessibili e altamente riproducibili tra diversi laboratori e gruppi di ricerca.

Storicamente per il testicolo, la designazione "in vitro", è stata utilizzata per diversi metodi di coltura di tessuti e cellule testicolari. Questi includono metodi dicolturaorganotipico di tessuti/organi (cioè coltura di espianto) 5 , coltura isolata di tubuli seminiferi6,coltura cellulare testicolare7e metodi di morfogenesi dei tessuti de novo (cioè costrutti biologici e organoidi)1. Le prime ricerche sulla spermatogenesi in vitro sono state eseguite circa 100 anni fa, con la coltura di espianto di testicoli di coniglio nel 19208e successivamente nel 1937 con espianto di topi9. All'interno di questi esperimenti iniziali la spermatogonia è stata osservata degenerare in gran parte durante la prima settimana di coltura, sebbene siano state identificate alcune cellule meioticamente differenzianti. Ricordando questi rapporti storici, la cultura dell'espianto del testicolo è stata ripresa e ottimizzata nel 2011 per diventare una tecnica fattibile per lo studio del testicolo10. Dal 2011, la coltura di espianto ha prodotto sperma competente per la fertilità in piùrapporti11,12,,13. Tuttavia, a causa della dipendenza della coltura di espianto dai tubuli dei testicoli nativi preesistenziati, questi recenti progressi sono descritti più accuratamente come esempi di funzione testicolare "ex vivo" e spermatogenesi, funzione tissutale che è stata mantenuta o ripresa al momento della rimozione dal corpo di un organismo. Nonostante la sua prevalenza in letteratura, il mantenimento e la differenziazione a lungo termine delle cellule germinali all'interno delle espianto,testicolari è difficile da replicare14,,15,16,17,18, specialmente in tempi abbastanza lunghi da osservare pienamente la spermatogenesi in vitro (~ 35 giorni neitopi 19 e 74 nell'uomo20).15 È intrigante apprezzare che molte delle stesse sfide vissute 100 anni fa, sono ancora oggi vissute all'interno della spermatogenesi ex vivo.

Diversi dagli approcci ex vivo, gli organoidi testicolari sono microtissue assemblate de novo generate interamente in vitro da fonti cellulari (cioè cellule testicolari primarie). Gli organoidi testicolari forniscono una strategia creativa per aggirare la dipendenza storica del campo dal tessuto nativo preesiste e per ricapitolare la biologia testicolare completamente in vitro. Ci sono più requisiti condivisi dalla maggior parte dei modelli di tessuto organoide; questi includono (1) morfologia o architettura del tessuto in vivo-mimetico, (2) più tipi di cellule principali del tessuto rappresentato, (3) auto-assemblaggio o auto-organizzazione nella loro generazione e (4) la capacità di simulare un certo livello della funzione e della fisiologia del tessuto rappresentato21,22,23,24. Per il testicolo, questo può essere catturato in quattro segni distintivi principali: (1) l'inclusione dei principali tipi di cellule testicolari, germe, Sertoli, Leydig, cellule peritubulari e altre cellule interstiziali, (2) assemblaggio di tessuti diretti a cellule, (3) tipi di cellule opportunamente compartimentate in compartimenti tubolari separati (germe e Sertoli) e regioni interstiziali (tutti gli altri tipi di cellule) e (4) un certo grado di funzione tissutale (ad esempio, secrezione o risposte dei tessuti dell'ormone riproduttivo, mantenimento e differenziazione delle cellule germinali). Considerando le sfide storiche nel mantenimento della differenziazione delle cellule germinali ex vivo e in vitro, la ricapitolazione di architetture testicolari in vivo-mimetiche (cioè strutture simili a tubuli seminiferi) con marcatori aggiuntivi che suggeriscono la simulazione della fisiologia testicolare (ad esempio, la funzione endocrina), sono pietre miliari prioritarie verso la generazione di organoidi che un giorno potrebbero sostenere la spermatogenesi in vitro.

La maggior parte dei metodi organoidi testicolari pubblicati sfrutta l'ECM disponibile in commercio (ad esempio, collagene o formulazioni ECM proprietarie)25,26,,27 o ECM di origine personalizzata (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da testis ECM)28,29,30. L'ECM esogeno promuove la formazione di tessuti de novo fornendo un'impalcatura di supporto all'assemblaggio per la generazione di tessuti. I metodi ECM hanno offerto un livello impressionante di formazione dei tessuti, tra cui una certa presenza di cellule germinali e morfologia tessuto-mimetica25,,28. Tuttavia, gli EMM che utilizzano non sono sempre universalmente disponibili (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da ECM) e alcuni metodi richiedono sofisticati orientamenti di semina in gel e cellule (ad esempio, gradienti a 3 strati di ECM e stampa 3D)25,,31,32. I metodi senza impalcature (ad esempio, caduta sospesa e piastre di coltura non aderenti)33,34,35 hanno anche generato organoidi robusti e altamente riproducibili senza la necessità di gel O impalcature ECM. Tuttavia, la morfologia tissutale di questi organoidi senza impalcature è spesso dissimile dai testi in vivo, e la maggior parte di questi rapporti incorpora un additivo biochimico ECM per promuovere laformazione dei tessuti 33,34,36o, in alternativa, fare affidamento sulla centrifugazione per l'aggregazione forzata delle cellule e lacompattazione 34,rendendoli meno ideali per studiare la migrazione e l'auto-organizzazione dirette dalle cellule.

I quattro metodi di generazione organoide presentati in questo manoscritto includono sia strategie dipendenti dall'ECM che strategie indipendenti, ognuna delle quali utilizza una semplice semina cellulare che consente l'osservazione dell'auto-assemblaggio organoide guidato dalle cellule. Tutte e quattro le tecniche possono essere eseguite dalle stesse sospensioni cellulari o possono utilizzare popolazioni arricchite personalizzate e di tipo cellulare. Un punto di forza di questi metodi è la capacità di osservare gli organoidi auto-assemblarsi in tempo reale e di confrontare direttamente come le strutture testicolari si auto-assemblano tra diversi microambientati di coltura. Le differenze fenotipiche tra questi quattro metodi di coltura dovrebbero essere prese in considerazione per il loro impatto sulla questione della ricerca o sull'oggetto dello sperimentatore. Ogni metodo produce costrutti biologici o organoidi entro 24 ore o meno. In conclusione, i metodi qui presentati forniscono un toolkit di tecniche di assemblaggio organoide per lo studio dell'assemblaggio organoide testicolare, dello sviluppo tissutale e della fisiologia testicolare in vitro.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University, e tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla IACUC.

1. Preparazione di soluzioni enzimatiche di dissociazione tissutale

  1. Utilizzare due diverse soluzioni enzimatiche (Soluzione 1 e Soluzione 2), entrambe realizzate utilizzando una soluzione media di coltura basale (BM).
  2. Per preparare il BM, aggiungere siero e penicillina-streptomicina a concentrazioni minime essenziali medio-finali rispettivamente del 10% e dell'1% (vedi Tabella dei materiali per reagenti specifici). Quindi filtrare sterilemente il BM attraverso un filtro da 0,22 μm. Prima dell'uso con le cellule, pre-equilibrare il BM sterile in un pH neutro erogando in un piatto di coltura e posizionando all'interno di un incubatore di CO2 umidificato al 5% a 37 °C per un minimo di 1 h.
    NOTA: Il BM può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana, dopo di che deve essere prodotto un BM fresco.
  3. Per preparare le soluzioni stock di collagenasi I, sciogliere prima 100 mg di collagenasi I in 1 mL di embrione sterile di grado H2O (concentrazione finale 10% m/v), invertire o ruotare per dissolversi e conservare 20 μL aliquote a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote devono essere scongelate una sola volta.
  4. Per preparare soluzioni stock di deossiribonucleasi I (DNasi I), aggiungere 20 mg di DNasi I in 1 mL di embrione sterile di grado H2O (concentrazione finale 2% m/v), invertire o ruotare per dissolversi (non vortice) e conservare 20 μL aliquote a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote devono essere scongelate una sola volta.
  5. Per le soluzioni di stock di ialuronidasi, aggiungere 30 mg in 1 mL di salina tamponata di fosfato sterile (PBS; concentrazione finale 3% m/v ialuronidasi in PBS contenente Ca++/Mg++), invertire o ruotare per dissolversi e conservare 100 aliquote μL a -20 °C per un uso successivo. Le aliquote possono essere scongelate e ri-congelate più volte senza perdita di attività enzimatica.
  6. Per preparare la dissociazione Soluzione 1, aggiungere 10 μL collagenasi I e 10 μL DNasi I in 1 mL di BM sterile pre-equilibrato (concentrazioni finali: 1 mg/mL collagenasi I e 5 μg/mL DNasi I). Triturare delicatamente con una pipetta per mescolare la soluzione e pre-riscaldare a 37 °C prima dell'uso con il tessuto.
    NOTA: La soluzione 2 viene preparata aggiungendo 33 μL di ialuronidasi (preconventata a 37 °C) per 1 mL della soluzione 1 (ad una concentrazione finale di 1 mg/mL). Ciò avviene a metà strada attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto testicolo al passaggio 2.5 sottostante.

2. Dissociazione tissutale di Testis

NOTA: Tutti i topi erano alloggiati all'interno di gabbie di polipropilene e dotati di cibo e acqua ad libitum. Gli animali venivano nutriti con chow irradiato che non contiene fitoestrogeni. Topi CD-1 giovanili, 5 giorni dopo parto (dpp), sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti e anestetizzati prima dell'eutanasia e della raccolta dei tessuti, all'interno di una camera di anestesia attaccata a un vaporizzatore di isoflurane (2,5 L/min in O2). I topi sono stati confermati per l'anestesia completa attraverso l'assenza di una risposta alla puntura di piedi, dopo di che i topi sono stati eutanasiati tramite decapitazione.

  1. Anestetizzare i topi in una camera isoflurana, garantire l'anestesia tramite una puntura di punta e quindi decapitare il topo usando una forbice affilata. Posizionare la supina di topo eutanasiata su un tappetino di dissezione e sterilizzare l'addome con il 70% di etanolo. Tenda la pelle dell'addome inferiore con le forcep e apri l'addome con le forbici.
  2. Individuare i teste nelle regioni inguinali in basso a sinistra e a destra dell'addome. Tagliare le loro connessioni ai deferenti vas e a qualsiasi tessuto connettivo ancorante, quindi sollevare l'intero testicolo (con epididimo ancora attaccato) dall'animale. Posizionare i tester in una piastra di Petri di BM pre-equilibrato.
  3. Al microscopio a dissezione e all'interno di un campo sterile, fare una piccola incisione nella tunica albuginea su un'estremità di ogni testicolo con una piccola forbice a microdisezione o strappando delicatamente usando due forcep sottili.
    1. Quindi, tenendo il testicolo dall'estremità opposta dell'incisione, spremere delicatamente il testicolo con forcep fini e spingere in un delicato movimento di spazzamento verso il foro nella tunica; questo rilascerà il tessuto testicolare come un unico pezzo coeso.
  4. Tagliare i tester in pezzi più piccoli (≤ 2 mm3) e metterli in 1 mL di dissociazione preri warmed (37 °C) Soluzione 1.
    1. Incubare a 37 °C per 10 minuti.
    2. Per più di 10 teste, aumentare il volume totale della soluzione di dissociazione di 1 mL, garantendo un minimo di 1 mL di soluzione di dissociazione per 10 teste (ad esempio, 2 mL per 20 teste, 3 mL per 30 teste, ecc.).
    3. Triturare delicatamente i pezzi di testicolo 50 volte (50x) nella soluzione 1 utilizzando una pipetta P1000. Assicurarsi che i tubuli si separino l'uno dall'altro e dal tessuto interstiziale a questo punto. Se rimangono grumi, incubare per altri 5 minuti e triturare ancora una volta (50x).
  5. Aggiungere 33 μL di soluzione di stock di ialuronidasi (prerifavolato a 37 °C, dal passo 1.5) per 1 mL di miscela di dissociazione della soluzione 1 (contenente il tessuto testicolare parzialmente dissociato e i tubuli). Dopo aver aggiunto l'ialuronidasi, questa è chiamata soluzione 2.
    1. Triturato (50x) utilizzando un P1000 e incubare a 37 °C per 5 min.
    2. Triturato (50x) utilizzando una pipetta P200.
    3. Assicurarsi che a questo punto non siano presenti tubuli o grumi visibili di cellule. Se i grumi persistono, incubare fino a 5 minuti in più, con ulteriore triturazione utilizzando una pipetta P200 (50x).
  6. Dissetare gli enzimi di dissociazione aggiungendo siero bovino fetale (FBS) al 10% del volume totale della soluzione 2. Triturare più volte utilizzando una pipetta P200 per garantire che non rimangano grumi e filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per produrre una sospensione a cella singola.
  7. Centrifugare le cellule a 100 x g per 7 minuti, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in BM fresco.
  8. Contare le concentrazioni cellulari totali e vitali utilizzando l'esclusione blu del tripano su un emocitometro. Aggiungere 10 μL di 1:1 diluito, sospensione cellulare: soluzione blu tripano, nella camera di conteggio delle celle dell'emocitometro (vedi Tabella dei materiali).
    1. Ri-centrifugare le cellule a 100 x g per 7 minuti e rimosi in BM fresco.
      NOTA: Utilizzare solo cellule vitali per calcolare la concentrazione e il numero delle cellule. Utilizzare solo sospensioni cellulari di ≥'80% di vitalità per la generazione di organoidi.
    2. Preparare la sospensione a cella singola in concentrazioni cellulari come descritto al fine di aliquota di 280.000 celle dati i volumi utilizzati nei passaggi specifici del protocollo riportati di seguito nella sezione 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 celle/mL, ECM 2D – 0,56 x 106 celle/mL , 3D ECM-Free – 4,66 x 106 celle/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 celle/mL.
      NOTA: Tutti gli esperimenti di coltura presentati qui iniziano con 280.000 cellule sementi per coltura bene. Questi numeri corrispondono ai dati rappresentativi della figura 1, figura 2, figura 3 e figura 4.

3. Preparazione di piatti di coltura organoide e semina di cellule

NOTA: Per garantire un ECM omogeneo, pre-scongelare le aliquote congelate di ECM durante la notte prima della sperimentazione. Le aliquote ECM devono essere immerse all'interno di un secchio di ghiaccio all'interno di un frigorifero a 4 °C o di una cella frigorifere per garantire un lento e graduale aumento della temperatura. Tutti gli ECM vengono utilizzati in una diluizione finale 1:1 in BM per la cultura. Mantenere l'ECM scongelato e l'ECM diluito 1:1 sul ghiaccio fino a immediatamente prima dell'uso, altrimenti l'ECM potrebbe polimerizzare prematuramente.

  1. Per la coltura priva di ECM 2D, non è necessaria alcuna preparazione speciale, sospensioni a cella singola a piastre (500 μL di 0,56 x 106 celle / mL in BM) direttamente su scivoli a camera a 4 pozzi e posizionare in un incubatore a 35 °C per la coltura.
    NOTA: Le cellule devono aderire al fondo del piatto di coltura entro le prime 24 ore di coltura e possono presentare alcuni piccoli cluster di cellule 3D in questo stesso periodo.
  2. Per la coltura 2D ECM, erogare 100 μL di mezzo a matrice basale extracellulare diluito a freddo 1:1 in uno scivolo a camera a 4 porri, assicurando che il gel copra l'intero fondo del piatto.
    1. Posizionare lo scivolo della camera in un incubatore a 35 °C per un minimo di 30 minuti per consentire all'ECM di polimerizzare in un gel.
    2. Aggiungere la sospensione cellulare (500 μL di 0,56 x 106 celle/mL in BM) direttamente sulla parte superiore del gel 2D una volta polimerizzata.
      NOTA: le celle devono raggrupparsi per formare piccoli cluster 3D all'interno delle prime 24 ore di coltura.
  3. Per la coltura senza ECM 3D, preparare gli inserti della piastra di Petri 3D ad agarosio prima di iniziare la coltura cellulare.
    1. In primo luogo, autoclave 1,5 g di polvere di agarosio in un becher da 100 mL, quindi aggiungere 75 mL di acqua sterile distillata e microonde per produrre agarosio fuso al 2% per la fusione di piastre di Petri 3D.
    2. All'interno di uno spazio di lavoro sterile, distribuire l'agarosio fuso nello stampo della piastra di Petri 3D fino a quando il menisco non è livellato con i lati dello stampo.
    3. Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio. Quando è solido, capovolgere lo stampo e flettere delicatamente ripetutamente fino a quando la piastra di Petri 3D di agarosio non cade libera dallo stampo.
      NOTA: A questo punto, è possibile preparare molte piastre di Petri 3D ad agarosio e conservarle in H2O sterile o DPBS a 4 °C per un mese in su.
    4. Prima di coltivare, mettere i piatti di Petri 3D di agarosio in un piatto da 24 po 'di coltura e coprirli con 1 mL di BM. Lasciare che le piastre 3D Petri equilibrano in BM per almeno 30 minuti all'interno di un incubatore di coltura a 37 °C. Scartare il BM e ripetere ancora una volta l'equilibrazione con BM fresco da 1 mL. Dopo l'equilibrazione delle piastre di Petri 3D in BM, appariranno dello stesso colore del BM (cioè rosa).
    5. Per prepararsi alla semina cellulare, rimuovere tutto il BM dal pozzo e erogare 200 μL di BM fresco intorno, ma non all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D. Inoltre, raccogliere l'eventuali BM rimanenti dall'interno della rientranza centrale di semina cellulare dell'inserto microwell.
    6. Erogare la sospensione a cella singola (4,66 celle/mL in 60 μL di BM) nella rientranza centrale della piastra di Petri 3D di agarosio. Triturare delicatamente su e giù per mescolare le cellule e garantire una sospensione a singola cella all'inizio della coltura.
    7. Mettere in un incubatore umidificato a 35 °C per la coltura. Il giorno seguente, rimuovere i 200 μL di BM dall'inserto del microwell e sostituirli con 1 mL di BM fresco. Questo porterà il livello del liquido sopra il piano dell'inserto, immergendo l'intera coltura.
    8. Rimuovere/aggiungere lentamente e con cura i supporti dall'esterno della piastra di Petri 3D agarosio. Gli organoidi avrebbero dovuto compattarsi durante la notte, permettendo loro di riposare sul fondo e consentendo ai cambiamenti dei supporti di lasciare gli organoidi indisturbati.
  4. Per le impostazioni cultura 3D ECM, preparare una sospensione a cella singola combinando, in parti uguali, la sospensione cellulare in BM con ECM freddo pre-scongelato (concentrazione finale = 2,8 x 106 celle/mL).
    1. Erogare immediatamente la miscela cell-ECM in uno scivolo a camera a 4 po porsi, assicurando che la miscela copra l'intero fondo della piastra.
    2. Posizionare la camera scivola a 35 °C in un incubatore e lasciare che il suo contenuto si polimerizzi. Questo dovrebbe richiedere almeno 30 minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 μL di BM sulla parte superiore della coltura.
      NOTA: Le celle dovrebbero essere raggruppate per formare piccoli aggregati 3D all'interno delle prime 24 ore di coltura.

4. Manutenzione organoide

  1. Coltura tutti i tipi di modello organoide a 35 °C. Per tutti i tipi di cultura scambia metà dei loro supporti con BM fresco ogni 2 giorni. Per assicurarsi che gli organoidi non vengano raccolti accidentalmente durante lo scambio di mezzi, raccogliere sempre i supporti lentamente da un angolo della piastra di scorrimento della camera e da un punto esterno al di fuori delle piastre di Petri 3D di agarosio. Tutti i supporti possono essere conservati a -20 °C per l'uso con immunoanalisi o altre analisi in seguito (cioè quantificazione di ormoni riproduttivi secreti o citochine).
  2. Dopo 7 giorni in coltura, utilizzare BM contenente ormone follicolo stimolante (concentrazione finale 20 mIU/mL) e gonadotropina corionica umana (concentrazione finale 4.5 UI/mL). Questo vale per tutti i tipi di coltura organoide.
  3. Immagine di routine di tutte le colture organoidi (ad esempio, imaging time-lapse) per caratterizzare la formazione organoide e quantificare metriche di auto-assemblaggio, sviluppo e crescita nel tempo.

5. Collezione Organoide

NOTA: Tutti gli organoidi possono essere fissati con paraformaldeide al 4% in PBS per l'immunoetichettatura a valle e le analisi istologiche. Fissare per 2 ore a temperatura ambiente con rotazione o pernottamento a 4 °C.

  1. Per le colture senza ECM 2D, sciacquare prima il campione con PBS fresco, quindi aggiungere il fissatore direttamente sopra i costrutti aderenti.
  2. Per i metodi di coltura ECM (2D e 3D), sciacquare una volta con PBS, quindi aggiungere fissatore direttamente sulla parte superiore del campione organoide ECM (per fissare insieme il gel ECM e gli organoidi) o, in alternativa, pipettare delicatamente gli organoidi su e giù per liberarli dall'ECM circostante e trasferirli in un tubo separato per la fissazione.
  3. Per una coltura priva di ECM 3D, pipettare delicatamente gli organoidi su e giù all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D di agarosio; questo sciacqua gli organoidi facilitandone la facile raccolta con una pipetta. Quindi trasferire gli organoidi in un tubo separato per la fissazione.
  4. Prima di lavorare in paraffina, incorporare molti organoidi (≥ 20) all'interno di un piccolo volume (~ 30 μL) di gel per la lavorazione dei tessuti; questo aiuta ad orientare e concentrare gli organoidi in una piccola area all'interno di blocchi di paraffina, facilitando l'osservazione durante la sezione e una più facile identificazione visiva all'interno delle sezioni di paraffina.
    NOTA: Gli organoidi possono essere difficili da identificare dopo l'incorporamento e la sessatura della paraffina su un microtomo.

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Risultati

La generazione organoide è stata considerata non riuscita se le cellule testicolari non si sono auto-assemblate entro 72 ore dalla coltura, tuttavia, tutti i metodi qui presentati si assemblano entro 24 ore quando si utilizzano cellule murine giovanili (5 dpp). Fallimento della generazione di costrutti biologici presentato come una continuazione di cellule liberamente sospese (colonna 0 h nella figura 1) anche dopo una coltura estesa (72 h). In assenza di auto-assemblaggio dei tessuti, tutti...

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Discussione

Con il completamento di questo protocollo di generazione organoide, l'utente avrà a disposizione quattro diverse tecniche di coltura per assemblare costrutti testicolari e organoidi in ambienti privi di ECM o ECM. È importante sottolineare che tutti e quattro i metodi consentono al ricercatore di osservare in modo non invasivo l'auto-assemblaggio organoide nel tempo attraverso l'imaging time-lapse o la registrazione video, e di raccogliere in modo non invasivo mezzi condizionati per l'analisi di ormoni e citochine secret...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dal National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03 e dalla Cattedra commemorativa di Thomas J. Watkin.

Gli autori ringraziano Eric W. Roth per la loro assistenza nella microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro ha fatto uso della struttura BioCryo del NUANCE Center della Northwestern University, che ha ricevuto il supporto della risorsa soft and hybrid nanotechnology experimental (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); il programma MRSEC (NSF DMR-1720139) presso il Centro ricerche materiali; l'Istituto Internazionale di Nanotecnologia (IIN); e lo Stato dell'Illinois, attraverso l'IIN. Ha anche fatto uso dell'apparecchiatura CryoCluster, che ha ricevuto supporto dal programma MRI (NSF DMR-1229693). La grafica nella figura 1 è stata progettata utilizzando BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtri Sterili per Terreni da 0,22 umMillipore Sigmascgpu05rePer Media Filtranti Sterili
3β Anticorpo primario HSDCosmo Bio CoK0607Marcatore cellulare di Leydig, diluizione 1:500
AlexaFluor 568 α-MouseThermo Fisher ScientificA-21202Anticorpo secondario marcato con fluorescenza
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Anticorpo secondario marcato con fluorescenza
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Base del terreno di coltura
Collagenasi IWorthington BioLS004197Per soluzione di dissociazione 1
Matrice di membrana Corning Matrigel, priva di LDEVCorning354234Matrice extracellulare utilizzata per la colata di gel di coltura ECM 2D e 3D
Countess Contatore di celluleThermo Fisher ScientificC10227Contatore di cellule automate (macchina ematometrica)
Vetrini per camera di conteggio cellulare CountessThermo Fisher ScientificC10228Vetrino per ematocitometro da utilizzare con il contatore automatico Countess
DDX4 anticorpo primarioAbcam138540Marcatore di spermatogonia, diluizione 1:500
Desossiribonucleasi I (2.280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Per soluzione di dissociazione 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Per la ricostituzione della soluzione
salina tamponata con fosfato della ialuronidasi di Dulbecco +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Per la ricostituzione del siero fetale bovino Collagenasi I e Dnase I
Thermo Fisher Scientific16000044Per il quencing di soluzioni di dislocazione enzimatica
Follicolo ormone stimolanteAbcamab51888Per colture di organoidi a lungo termine
Gonadotropina corionica umanaMillipore SigmaC1063Per colture di organoidi a lungo termine
Ialuronidasi, da testicoli boviniMillipore SigmaH4272Per soluzione di dissociazione 2
Inibina B Saggio di immunoassorbimento enzimaticoAnsh LabsAL-107Kit ELISA
per inibina BSiero sostitutivo KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028Fonte di siero per terreni basali
MicroTessuti 3D Piastra di Petri 3D Sferoidi per microstampi (24-35, array 5x7)Millipore SigmaZ764051Per la fabbricazione di organoidi 3D senza ECM
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4 pozzettiThermo Fisher Scientific12-565-7Per colture ECM 2D senza ECM e 2D, coltura ECM 3D
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific15-140-122Antibiotico per terreni
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel per la lavorazione dei campioniThermo Fisher ScientificHG-4000-012Per favorire l'inclusione della paraffina
Anticorpo primario SOX9Millipore SigmaAB5535Sertoli Marker, diluizione 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920Cibo per topi senza fitoestrogeni
Tedklad Global Mouse Chow (Manutenzione)Teklad Global2916Cibo per topi senza fitoestrogeni
Saggio di immunoassorbimento enzimatico del testosteroneCalbiotechTE373SKit ELISA di testosterone
Soluzione blu di tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific 15250061Per la conta cellulare
&alfa;Anticorpo primario SMAMillipore SigmaA2547Marker peritubulare, diluizione 1:500
β Anticorpo primario di cateninaBD Biosciences610154Sertoli Citoplasma marcatore, diluizione 1:100

Riferimenti

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

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