Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Summary

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Abstract

Gli organoidi testicolari forniscono uno strumento per studiare lo sviluppo testicolare, la spermatogenesi e l'endocrinologia in vitro. Sono stati sviluppati diversi metodi per creare organoidi testicolari. Molti di questi metodi si basano sulla matrice extracellulare (ECM) per promuovere l'assemblaggio dei tessuti de novo, tuttavia, ci sono differenze tra i metodi in termini di morfologia biomimetica e funzione dei tessuti. Inoltre, vi sono pochi confronti diretti dei metodi pubblicati. Qui, viene effettuato un confronto diretto studiando le differenze nei protocolli di generazione organoide, con i risultati forniti. Vengono descritti quattro metodi di generazione archetipica: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free e (4) 3D ECM culture. Tre parametri di riferimento primari sono stati utilizzati per valutare la generazione organoide testicolare. Questi sono l'auto-assemblaggio cellulare, l'inclusione dei principali tipi di cellule (Sertoli, Leydig, germe e cellule peritubulari) e l'architettura dei tessuti opportunamente compartimentata. Dei quattro ambienti testati, le colture 2D ECM e 3D ECM-free hanno generato organoidi con morfologie interne più simili ai tester nativi, tra cui la compartimentazione de novo dei tipi di cellule tubolari rispetto a quelle interstiziali, lo sviluppo di strutture simili a tubuli e una funzione endocrina consolidata a lungo termine. Tutti i metodi studiati utilizzavano sospensioni cellulari testicolari murine primarie nonsortite e usavano risorse di coltura comunemente accessibili. Queste tecniche di generazione organoide testicolare forniscono un toolkit altamente accessibile e riproducibile per iniziative di ricerca sull'organogenesi testicolare e la fisiologia in vitro.

Introduction

Gli organoidi testicolari sono una tecnica pionieristica per lo studio dello sviluppo testicolare, della spermatogenesi e della fisiologia in vitro^1,,2,,3,,4. Diversi metodi sono stati esplorati per la generazione organoide; questi includono una varietà di sistemi di coltura extracellulari (ECM) e senza ECM, sia negli orientamenti bidimensionali (2D) che tridimensionali (3D). Diversi metodi di generazione possono promuovere strategie di assemblaggio cellulare distinte; ciò si traduce in un alto livello di variabilità morfologica e funzionale....

Protocol

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University, e tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla IACUC.

1. Preparazione di soluzioni enzimatiche di dissociazione tissutale

1. Utilizzare due diverse soluzioni enzimatiche (Soluzione 1 e Soluzione 2), entrambe realizzate utilizzando una soluzione media di coltura basale (BM).
2. Per preparare il BM, aggiungere siero e penicillina-streptomicina a concentrazioni minime essenziali medio-finali rispettivamente del 10% e dell'1% (vedi Tabella dei materiali

Results

La generazione organoide è stata considerata non riuscita se le cellule testicolari non si sono auto-assemblate entro 72 ore dalla coltura, tuttavia, tutti i metodi qui presentati si assemblano entro 24 ore quando si utilizzano cellule murine giovanili (5 dpp). Fallimento della generazione di costrutti biologici presentato come una continuazione di cellule liberamente sospese (colonna 0 h nella figura 1) anche dopo una coltura estesa (72 h). In assenza di auto-assemblaggio dei tessuti, tutti.......

Discussion

Con il completamento di questo protocollo di generazione organoide, l'utente avrà a disposizione quattro diverse tecniche di coltura per assemblare costrutti testicolari e organoidi in ambienti privi di ECM o ECM. È importante sottolineare che tutti e quattro i metodi consentono al ricercatore di osservare in modo non invasivo l'auto-assemblaggio organoide nel tempo attraverso l'imaging time-lapse o la registrazione video, e di raccogliere in modo non invasivo mezzi condizionati per l'analisi di ormoni e citochine secret.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtri Sterili per Terreni da 0,22 um	Millipore Sigma	scgpu05re	Per Media Filtranti Sterili
3β Anticorpo primario HSD	Cosmo Bio Co	K0607	Marcatore cellulare di Leydig, diluizione 1:500
AlexaFluor 568 α-Mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Anticorpo secondario marcato con fluorescenza
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Anticorpo secondario marcato con fluorescenza
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Base del terreno di coltura
Collagenasi I	Worthington Bio	LS004197	Per soluzione di dissociazione 1
Matrice di membrana Corning Matrigel, priva di LDEV	Corning	354234	Matrice extracellulare utilizzata per la colata di gel di coltura ECM 2D e 3D
Countess Contatore di cellule	Thermo Fisher Scientific	C10227	Contatore di cellule automate (macchina ematometrica)
Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228	Vetrino per ematocitometro da utilizzare con il contatore automatico Countess
DDX4 anticorpo primario	Abcam	138540	Marcatore di spermatogonia, diluizione 1:500
Desossiribonucleasi I (2.280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	Per soluzione di dissociazione 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	Per la ricostituzione della soluzione
salina tamponata con fosfato della ialuronidasi di Dulbecco +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Per la ricostituzione del siero fetale bovino Collagenasi I e Dnase I
	Thermo Fisher Scientific	16000044	Per il quencing di soluzioni di dislocazione enzimatica
Follicolo ormone stimolante	Abcam	ab51888	Per colture di organoidi a lungo termine
Gonadotropina corionica umana	Millipore Sigma	C1063	Per colture di organoidi a lungo termine
Ialuronidasi, da testicoli bovini	Millipore Sigma	H4272	Per soluzione di dissociazione 2
Inibina B Saggio di immunoassorbimento enzimatico	Ansh Labs	AL-107	Kit ELISA
per inibina BSiero sostitutivo KnockOut	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Fonte di siero per terreni basali
MicroTessuti 3D Piastra di Petri 3D Sferoidi per microstampi (24-35, array 5x7)	Millipore Sigma	Z764051	Per la fabbricazione di organoidi 3D senza ECM
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	Per colture ECM 2D senza ECM e 2D, coltura ECM 3D
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antibiotico per terreni
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel per la lavorazione dei campioni	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Per favorire l'inclusione della paraffina
Anticorpo primario SOX9	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, diluizione 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)	Teklad Global	2920	Cibo per topi senza fitoestrogeni
Tedklad Global Mouse Chow (Manutenzione)	Teklad Global	2916	Cibo per topi senza fitoestrogeni
Saggio di immunoassorbimento enzimatico del testosterone	Calbiotech	TE373S	Kit ELISA di testosterone
Soluzione blu di tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific 15250061		Per la conta cellulare
&alfa;Anticorpo primario SMA	Millipore Sigma	A2547	Marker peritubulare, diluizione 1:500
β Anticorpo primario di catenina	BD Biosciences	610154	Sertoli Citoplasma marcatore, diluizione 1:100