Questo protocollo descrive l'impianto di stent coronari umani nell'aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli murini portano i vantaggi di alta produttività, riproducibilità, facilità di movimentazione e alloggiamento e un'ampia disponibilità di marcatori molecolari.
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Articolo metodologico
Impianto di stent coronari di dimensioni umane nell'aorta addominale del ratto utilizzando un accesso trans-femorale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l'impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica. La restenosi in-stent (ISR) è determinata da un'eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all'interno dello stent e limita il successo a lungo termine degli stent. Una varietà di modelli animali sono stati utilizzati per chiarire i processi fisiopatologici alla base della restenosi in-stent (ISR), con i modelli coronarica suina e l'arteria iliaca del coniglio che sono i più frequentemente utilizzati. I modelli murini offrono i vantaggi di un'elevata produttività, facilità di movimentazione e alloggiamento, riproducibilità e un'ampia disponibilità di marcatori molecolari. Il modello di topo carente di apolipoproteina E (apoE-/- ) è stato ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari. Tuttavia, gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, comportando importanti cambiamenti delle loro proprietà meccaniche e (potenzialmente) biologiche. L'uso di ratti apoE-/- può superare queste carenze in quanto i ratti apoE-/- consentono la valutazione degli stent coronari delle dimensioni dell'uomo e allo stesso tempo forniscono un fenotipo aterogenico. Questo li rende un modello eccellente e affidabile per indagare ISR dopo l'impianto stent. Qui descriviamo, in dettaglio, l'impianto di stent coronari umani disponibili in commercio nell'aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale.
Introduzione
L'intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l'impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica1. Il successo a lungo termine degli stent, tuttavia, può essere limitato dal verificarsi di restenosi in-stent (ISR) determinata da un'eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all'interno dello stent2,3. L'ISR può richiedere un nuovo intervento con bypass coronarica o re-PCI. Per lo studio dell'ISR sono stati suggeriti diversi modelli animali, ognuno dei quali presenta vantaggi e carenze. I principali inconvenienti dei modelli di arteria iliaca suina più comunemente usati e del coniglio iliaca, sebbene sviluppino lesioni marcatamente simili all'uomo dopo l'impianto di stent4,5, sono grandi costi animali e abitativi che sollevano difficoltà logistiche soprattutto negli studi a lungo termine, nonché limitazioni nella manipolazione e nelle attrezzature. Inoltre, la disponibilità di anticorpi contro le proteine cellulari di suini e conigli è limitata. D'altra parte, i modelli murini offrono i principali vantaggi di elevata produttività e riproducibilità, nonché facilità di movimentazione, alloggiamento e quindi economicità. Inoltre, è disponibile un numero maggiore di anticorpi. Tuttavia, mentre i topi apolipoproteina E-carenti (apoE-/-) sono stati ampiamente utilizzati per lo studio dell'aterosclerosi6,7,8, non sono adatti allo studio dell'ISR poiché gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, potenzialmente cambiando le proprietà meccaniche degli stent. Inoltre, la parete aortica dei topi misura tra 50 μm nei giovani topi e 85 μm nei vecchitopi 9e gli stent devono essere utilizzati utilizzando livelli di pressione fino a 2 atm, che potrebbero portare alla malapposizione dello stent10. I ratti, tuttavia, consentono l'impianto di stent coronari umani disponibili in commercio e dimostrano un corso di guarigione vascolare simile agli animali più grandi dopo l'impianto di stent aortico, riportato per la prima volta da Langeveld etal. Questa tecnica originariamente richiedeva un accesso trans-addominale, che richiedeva una costrizione fisica dell'aorta per ottenere un'interruzione temporanea del flusso sanguigno. Per evitare la lesione del vaso potenzialmente associata e le reazioni infiammatorie, la tecnica è stata successivamente perfezionata con l'introduzione di un accesso trans-iliaca, che ha inoltre portato a un più alto tasso di sopravvivenza degli animali12.
Poiché i ratti di tipo selvatico non sviluppano lesioni aterosclerotiche13, i ratti apoE-/- sono stati generati utilizzando tecniche di nucleasi come transcription activator-like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15e Zinc Finger (ZF)16. I ratti ApoE-/- sono disponibili in commercio dal 2011. Fornendo uno sfondo aterogenico, i ratti apoE-/- consentono una valutazione più realistica degli stent coronari a misura d'uomo, in particolare per quanto riguarda l'ISR.
Nel presente documento, descriviamo il metodo attraverso la via di accesso transfemorale e utilizzando uno stent di eluizione del farmaco cobalto-cromo (DES) a punto sottile disponibile in commercio, tuttavia, può anche essere applicato per lo studio di altri tipi di stent, come stt bare metal (BMS) o stent biodegradabili.
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge tedesca sul benessere degli animali (TSchG) e la direttiva 2010/63/UE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. L'approvazione ufficiale di questo studio è stata concessa dal Governmental Animal Care and Use Committee (Protocollo n.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania). Il protocollo di studio è conforme alla Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio. Il trattamento postoperatorio del dolore si basa sulle raccomandazioni della Società tedesca per le scienze animali di laboratorio (GV-SOLAS) e dell'Iniziativa veterinaria per la terapia del dolore.
1. Tecniche di base e procedure comuni
- Utilizzare ratti omozigoti apoE-/- Sprague-Dawley. Identificare il genotipo di ciascun animale utilizzando metodi standard17.
- Mantenere gli animali in condizioni identiche (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% di umidità e un ciclo chiaro / scuro di 12 ore) e garantire il libero accesso all'acqua e al cibo.
- Eseguire tutte le procedure in condizioni pulite ma nonsterili.
- Una volta che il topo è anestetizzato, eseguire tutte le procedure al microscopio chirurgico con un ingrandimento di 16x.
- Utilizzare tamponi di cotone per l'emostasi di compressione. I tamponi di garza (5 cm x 5 cm) imbevuti di soluzione ringer allattata sono utili per mantenere l'inguine umido.
- Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per smaltire i materiali usati.
2. Preparativi prima dell'intervento chirurgico
- Preparare i farmaci veterinari prima di iniziare l'operazione. Conservare tutte le soluzioni a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
- Trenta minuti prima della procedura, somministrare 0,03-0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea.
- Anestetizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di peso corporeo (BW) (S)-chetamina e 8 mg/kg di xilazina BW.
- Valutare il peso del topo utilizzando una bilancia.
- Posizionare il topo su una pastiglia riscaldante e fissare gli arti superiore e inferiore utilizzando del nastro medico. Posizionare il topo con l'arto posteriore sinistro completamente esteso e il più in linea possibile con la colonna vertebrale in modo da creare una linea retta tra arteria femorale e aorta. Ciò faciliterà l'avanzamento dello stent montato su palloncino attraverso la biforcazione aortica.
- Mantenere l'anestesia con inalazione di isoflurane 1,5 vol% nel 97,5% di ossigeno ad una portata di 2 L/min.
NOTA: Lasciare respirare spontaneamente il topo, senza intubazione. - Applicare un unguento per gli occhi per prevenire danni agli occhi durante l'incoscienza.
- Radere la pelliccia dall'inguine e dall'area inferiore dell'addome del ratto e sterilizzare la pelle corrispondente con una soluzione di povidone-iodio.
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, verificare un'adeguata profondità dell'anestesia pizzicando la punta della coda e il tessuto interdidigitale.
3. Chirurgia
- Effettuare un'incisione mediale di ~ 0,5 \u20121 cm nell'inguine sinistro per aprire la pelle e la fascia sottostante.
- Sezionare e sondare senza mezzi termini nelle profondità fino a quando non è possibile identificare l'arteria femorale sinistra pulsante.
- Usando forcep molto fini, preparare l'arteria femorale rimuovendo delicatamente il tessuto connettivo circostante. Fai attenzione a danneggiare né il nervo femorale né la vena femorale, che è mediale per l'arteria.
- Preparare circa 1 cm dell'arteria femorale. Mettere con cura la punta delle forcep sotto il vaso per sollevarla delicatamente.
- Filettare pezzi di sutura di seta 4-0 sotto le parti distale e prossimale dell'arteria e formare io. Bloccare le estremità di ciascuna delle due irse del filo tra i rami di un morsetto chirurgico. Utilizzare i morsetti chirurgici per controllare l'arteria. Allungare delicatamente e sollevare le indovamenti per interrompere temporaneamente il flusso sanguigno.
NOTA: Lavorare velocemente per evitare un laccio emostatico prolungato che può causare danni ai tessuti. - Usando micro forbici affilate, eseguire un'arteriotomia nel mezzo dell'arteria femorale.
- Introdurre un filo guida attraverso l'arteriotomia. Quando si raggiunge l'io del filo prossimale, rilasciare la tensione del filo spostando il morsetto chirurgico e far avanzare ulteriormente il filo guida verso l'aorta addominale.
NOTA: Tagliare il filo guida utilizzando una fresa a filo per facilitare la movimentazione. - Posizionare l'estremità prossimale del filo guida tra il diaframma e le arterie renali.
NOTA: L'avanzamento troppo lontano del filo guida comporta il rischio di lesioni aortiche o cardiache. Si consiglia di aprire l'addome per garantire un adeguato posizionamento del filo guida e dello stent almeno per i primi diversi animali. - Introdurre uno stent coronare crimpato e montato su palloncino che misura 2,25 mm x 8 mm (max. 2,5 mm x 8 mm) sul filo guida nell'arteria femorale e avanzare verso l'aorta addominale.
- Posizionare lo stent appena sopra la biforcazione aortica ma sotto le arterie renali. Distribuire lo stent gonfiando il catetere a palloncino a 12 atm per 15 s utilizzando un sistema di siringhe di gonfiaggio.
- Sgonfiare il catetere a palloncino e mantenere una pressione negativa secondo le raccomandazioni del produttore per lo stent in uso.
- Ritirare lentamente il catetere sgonfio lasciando lo stent in posizione.
- Poco prima di esettare il catetere, creare tensione sul ciclo del filo sopra l'incisione con il morsetto chirurgico per interrompere nuovamente il flusso sanguigno. Quindi rimuovere il catetere a palloncino e ligare direttamente il vaso prossimamente.
- Legare i cicli prossimali e distale del filo per legare l'arteria femorale e confermare un'adeguata emostasi dell'arteriotomia. Le arterie collaterali garantiranno un'ulteriore perfusione all'arto.
- Chiudi il muscolo sovrascrivere l'arteria e l'incisione cutanea usando 10-0 suture non riassorbibili.
4. Cura degli animali dopo l'impianto di stent
- Subito dopo l'operazione, lasciare recuperare il ratto per 60 minuti in una speciale gabbia per unità di terapia intensiva con aria riscaldata (30\u201235 °C) e un apporto di ossigeno.
- Guarda attentamente gli animali fino a completo recupero. Successivamente, spostare i ratti in una gabbia normale. Fornire accesso ad libitum all'acqua e al cibo.
- Somministrare analgesia postoperatoria ogni 6-12 ore con 0,03-0,05 mg/kg di buprenorfina (s.c., in NaCl da 500μl) per un totale di 72 ore in fase di valutazione clinica.
- Far miscelare il cibo con clopidogrel (15 mg/kg) per evitare la trombosi dello stent impiantato.
- Per migliorare le condizioni ipercolesterolemiche e la formazione della placca, iniziare l'alimentazione della dieta occidentale a 6\u20128 settimane dopo la nascita e continuare fino all'eutanasia. Se lo si desidera, una coorte di animali alimentati con normale chow di ratto può servire da controllo.
5. Raccolta e lavorazione dei tessuti
- Prima di iniziare l'espianto del tessuto nel punto di tempo designato, eutanasiare l'animale secondo le linee guida della IACUC. Raccogliere l'aorta stenta per l'analisi istologica alla fine del periodo di osservazione.
- Aprire l'addome con un'incisione della linea mediana e rimuovere il segmento stentato dell'aorta e le parti adiacenti non stente dell'aorta, misurando 0,5 cm ciascuna.
- Mettere il tessuto in una soluzione di formalina tamponata al 4% per 24 ore per la fissazione.
- Incorporare il tessuto arterioso stentato nella plastica ed eseguire colorazioni istologiche e immunoistochimiche secondo i protocolli standard18,19.
6. Analisi istomorfometrica
- Eseguire l'analisi istomorfometrica delle sezioni sequenziali della parte prossimale, centrale e distale dell'aorta stentata per mezzo di un microscopio collegato a un computer con un software di analisi delle immagini appropriato.
- Traccia i contorni della lamina elastica esterna (EEL, tra adventitia e media), lamina elastica interna (IEL, tra media e neointima) e lume con una tavoletta grafica da disegno. Da questi valori, calcolare l'area EEL, l'area IEL e l'area lume con il software.
- Calcolare la percentuale di restenosi intersezionale in-stent (ISR):
- Calcolare l'area neointimica totale (Ai):
- Misurare lo spessore neointimico (NIT) su ogni puntone stent come distanza tra puntone e lume. Misurare le NTI tra i montanti stent come distanza tra IEL e lume.
NOTA: In alternativa, calcolare le NTI come
dove PL e PIEL sono il perimetro di lume e lamina elastica interna, rispettivamente20. - Eseguire analisi aggiuntive in base alle esigenze dello studio.
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Risultati
Questo protocollo descrive l'impianto di stent nell'aorta addominale dei ratti utilizzando una via di accesso trans-femorale (Figura 1). Il primo punto centrale di questo modello animale è che consente il dispiegamento di stent coronari a misura d'uomo. Uno stent coronare crimpato e montato su palloncino disponibile in commercio può essere posizionato nell'aorta addominale dei ratti. Così, inoltre, può essere applicato lo stesso principio di distribuzione dello stent come negli esseri umani....
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Discussione
Questo protocollo descrive l'impianto di stent coronari a misura d'uomo nell'aorta addominale dei ratti apoE-/- . Vale la pena sottolineare diversi punti tecnici. In primo luogo, si dovrebbe evitare una mancata corrispondenza tra la dimensione dello stent e la dimensione dell'aorta. Posizionare uno stent troppo piccolo può portare a malapposition stent, mentre l'impianto di uno stent troppo grande per l'aorta può causare sovraccarico, strappo e lesioni del vaso. Pertanto, si consiglia di utilizzare stent tra 2...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la signora Angela Freund per la sua preziosa assistenza tecnica nella produzione di incorporamenti e diapositive. Ringraziamo anche Tadeusz Stopinski presso l'Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery per il suo perspicoso aiuto nel lavoro veterinario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Diet | |||
| SNIFF Dieta ricca di grassi + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiä ten GmbH, Soest | preparato su misura | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporizzatore | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Soluzione isotonica (0,9%) di NaCl | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Soluzione di lattato di Ringer | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamina | CEVA Germania | ||
| Xilazina | Medistar Germania | ||
| Forniture di consumo | |||
| Siringhe da 10 mL BD | Plastipak | 4606108V | |
| Siringhe da 2 mL | BD Plastipak | 4606027V | |
| Sutura in prolene 6-0 | ETHICON | N-2719K | |
| Sutura in seta 4-0 | Seraflex | IC 158000 | |
| Unguento per occhi e naso Bepanthen | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Tamponi di garza di cotone | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Nastro di seta Durapore | 3M | 1538-1 | |
| Soluzione di disinfezione della pelle polialcolica | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Ago Sterican 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Ago Sterican 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Carta velina | disponibile | in commercio | |
| Strumenti chirurgici | |||
| Graefe pinze curve x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Pinze Graefe diritte Fine | Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Porta aghi Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Forbici | Strumenti di Fine Science Inc. | 14074-11 | |
| Pinza Semken | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Piccole forbici chirurgiche curve Fine | Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Piccole forbici chirurgiche dritte Fine | Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Pinze modello standard | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Forbici a molla Vannas | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Attrezzatura | |||
| Microscopio da dissezione | Leica MZ9 | ||
| Termoforo a temperatura controllata | Sygonix | 26857617 | |
| Attrezzatura per l'impianto di stent | |||
| Stent a rilascio di farmaco Xience 2,25 mm x 8 mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Filo guida Fielder XT PTCA Filo guida: 0,014" x 300 cm | ASAHI INTECC CO., LTD Giappone | AGP140302 | |
| Sistema di siringhe di gonfiaggio | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Processamento e analisi dei tessuti | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Istologia |
| Etanolo | Roth | K928.1 | Istologia |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Istologia |
| Tavoletta grafica | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldeide tamponata 4% | Roth | P087 | Istologia |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Istologia |
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