Articolo metodologico

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 maggio 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi4. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.

Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultura mESC

  1. Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.
  2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
  3. Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.
  4. Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
  5. Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
  6. Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.
  7. Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
  8. Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 105 cellule in una piastra di coltura di 10 cm.
  9. Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza.
    NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.

2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni

  1. Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).
  2. Metodo di goccia sospesa (giorno 0)
    1. Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 104 cellule in cui 5,0 x 102 cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.
    2. Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
    3. Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 102 cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 104 cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).
    4. Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi.
      NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito.
    5. Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C.
      NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.
  3. Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.
  4. Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante.
    NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.
  5. Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.
  6. Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.
  7. Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra.
    NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo.
  8. Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante.
    NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina.
  9. Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.
  10. Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x10 5/cm2 in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.
  11. Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.
  12. Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).
  13. Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.

3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate

  1. Saggio della fosfatasi alcalina (AP)
    1. Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.
    3. Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti.
      NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa.
    4. Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra.
      NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP.
    5. Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.
    6. Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.
    7. Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.
    8. Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.
    9. Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.
    10. Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio.
      NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.
  2. RT-qPCR
    1. Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.
    2. Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).
    3. Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.
  3. Fissazione e incorporamento
    1. Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.
    3. Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione.
      NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento.
    4. Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso.
      NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta.
    5. Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.
    6. Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.
    7. Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco.
      NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.
  4. Criosezione
    1. Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.
    2. Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.
    3. Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.
    4. Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.
    5. Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.
  5. Immunofluorescenza (IF)
    1. Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
    2. Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.
    3. Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.
    4. Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
    5. Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.
    6. Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.
    7. Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.
  6. Analisi RNA-seq
    1. Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).
    2. Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.8.
    3. Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.
  7. Citometria a flusso
    1. Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.
    2. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.
    3. Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. Le c...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre d...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Vorremmo ringraziare il Dr. Ryan Hobbs per l'assistenza nel sezionamento. Ringraziamo le strutture principali del Penn State College of Medicine, tra cui le scienze del genoma e la bioinformatica, l'Advanced Light Microscopy Imaging e la citometria a flusso. Ringraziamo anche il Dr. Yuka Imamura per l'assistenza nell'analisi RNA-seq.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0,1% GelatinaSigmaG1890-100GPreparato in acqua deionizzata
16% ParaformaldeideThermo Scientific28908Diluito in 1X PBS
40-μ filtro cellulare mFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)InvitrogenA11001Antibody è stato diluito a 1:500 per IF
Alkaline Phosphatasi Staining Kit IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
Integratore B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
CloroformioC298-500Fisher Chimico
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320033
EB tamponeQiagen19086
Etanolo111000200PharmcoDiluito in acqua deionizzata
Siero fetale bovinoAtlanta BiologicalsS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 Sistema di sequenziamentoIlluminaSY-401-2501
IsopropanoloBDH1133-4LGBDH VWRAnalitico Diluito in acqua deionizzata
L-glutamminaThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/ARaccolto dal surnatante MEF
m18srRNA primerIDTDNAN/A5'-GCAATTCCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
Aminoacidi non essenzialiCorning25-025-Cl
mNanog primersIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primersIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTGTTG-3'mNeuroD1
primersIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
primersIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
primerIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGAGAGAGAGAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
integratoreThermo Fisher Scientific17502048
Nestin anticorpo primarioMilliporeMAB5326è stato diluito a 1:200 per IF
Neural basalThermo Fisher Scientific
Anticorpo primario del neurofilamentoDSHB2H3
NEXTflex Illumina Kit di preparazione della libreria RNA-Seq direzionale rapidoBioOScientific NOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicillina/streptomicinaCorning30-002-Cl
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)N/AN/APreparato in acqua deionizzata
- Cloruro di potassioP217-500GVWR
- Fosfato di potassio monobasico anidro0781-500GVWR
- Cloruro di sodioBP358-10Fisher Bioreagents
- Fosfato di sodio, bibasico, eptaidratoSX0715-1Milipore
Primer per esameri casualiThermo ScientificSO142
Acido retinoicoSigmaR2625Preparato in DMSO
Piruvato di sodioCorning25-000-Cl
SaccarosioSigma84097Diluito in 1X PBS
SuperScript III Trascrittasi inversaInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. compostoSakura4583
Reagente di isolamento TriPureSigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-mercaptoetanoloFisher BioReagentsBP176-100
21103049

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule progenitrici neuralimetodo della goccia sospesadifferenziamento con acido retinoicoformazione di corpi embrioidianalisi RT qPCRcolorazione in immunofluorescenzaanalisi tramite citometria a flussosequenziamento dell RNAreporter GFP per Sox1

Articoli correlati