Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Sommario

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Abstract

Le cellule dei mammiferi sono costantemente esposte a sostanze chimiche, radiazioni e sotto-prodotti metabolici naturali, che creano tipi specifici di insulti al DNA. Gli agenti genotossici possono danneggiare la spina dorsale del DNA, romperla o modificare la natura chimica delle singole basi. In seguito all'insulto al DNA, vengono attivati percorsi di risposta al danno del DNA (DDR) e vengono reclutate proteine coinvolte nella riparazione. Una pletora di fattori sono coinvolti nel rilevamento del tipo di danno e nell'attivazione della risposta di riparazione appropriata. La mancata attivazione e reclutamento dei fattori DDR può portare all'instabilità genomica, che sta alla base di molte patologie umane, tra cui il cancro. Studi sulle proteine DDR possono fornire informazioni sulla risposta ai farmaci genotossici e sui meccanismi cellulari della resistenza ai farmaci.

Ci sono due modi principali per visualizzare le proteine in vivo:l'osservazione diretta, etichettando la proteina di interesse con una proteina fluorescente e seguendola mediante imaging dal vivo, o immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Mentre la visualizzazione delle proteine con tag fluorescenti consente un monitoraggio preciso nel tempo, l'etichettatura diretta in N- o C-terminus può interferire con la localizzazione o la funzione delle proteine. L'osservazione delle proteine nella loro versione non modificata ed endogena è preferita. Quando le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell'insulto del DNA, la loro concentrazione aumenta localmente e formano gruppi, o "foci", che possono essere visualizzati dall'immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici.

Anche se il rilevamento di proteine foci non fornisce una prova definitiva di interazione diretta, la co-localizzazione delle proteine nelle cellule indica che si raggruppano al sito del danno e possono informare della sequenza degli eventi necessari per la formazione complessa. Un'attenta analisi della sovrapposizione spaziale dei foci nelle cellule che esprimono versioni di tipo selvaggio o mutante di una proteina può fornire preziosi indizi su domini funzionali importanti per la funzione di riparazione del DNA. Infine, la co-localizzazione delle proteine indica possibili interazioni dirette che possono essere verificate dalla co-immunoprecipizione nelle cellule o dal pulldown diretto utilizzando proteine purificate.

Introduzione

Le cellule umane sono costantemente esposte a una varietà di agenti dannosi per il DNA di varie origini. Le fonti esogene sono per lo più costituite da esposizione a radiazioni, sostanze chimiche (compresi agenti chemioterapici e alcuni antibiotici), e virus, mentre le principali fonti endogene includono errori nella replicazione del DNA e nello stress ossidativo. Gli effetti diretti dell'esposizione genotossica possono variare da una base modificata a una rottura del doppio filamento del DNA potenzialmente letale (DSB), a seconda dello stress e della dose di esposizione. In definitiva, danni al DNA non riparati o riparati in modo improprio possono portare all'accumul....

Protocollo

1. Coltura cellulare HeLa

1. Il vetro rotondo pre-trattamento copre le coperture con 1 M HCl a 50 gradi centigradi per 16-18 ore. Risciacquare con ddH₂O e conservare al 100% EtOH.
2. Preparare il supporto di coltura cellulare: aggiungere il 10% (v/v) FBS al supporto DMEM.
3. Crescere 4,0 x 10⁴ celle/bene in una piastra sterile a 12 possidetti con un coperture rotonde da 18 mm a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂ in un'incubatrice umida. Coltivare le cellule fino all'80% di confluenza (circa 24 ore).

2. Trattamento cellulare con radiazioni (IR)

1. Per indurre la formazione di ro....

Risultati

Il giorno 2, o 24 h dopo le cellule di semina su coverslips, le cellule hanno subito una divisione e sono 80% confluente. Specifici abbattimenti o mutazioni nelle proteine di riparazione del DNA possono aumentare il tempo di raddoppio, o sensibilizzare le cellule al trattamento genotossico, e la densità di semina e le dosi di trattamento devono essere regolate di conseguenza. Per determinare le migliori condizioni di lavoro, la tempistica della risposta al danno del DNA può essere stabilita dal gonfiore occidentale di γH.......

Discussione

L'analisi dei tempi e dell'efficienza della riparazione dei danni al DNA tramite microscopia si è dimostrata essenziale per capire come funziona il macchinario per la riparazione del DNA, nelle cellule normali e nelle patologie umane come il cancro.

Lo sviluppo di anticorpi specifici che consentono il rilevamento di proteine attivate nella loro versione fosforicolata (come γH2AX, pRPA, pRAD50 e altri^{10,,23,.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione acquosa di paraformaldeide (PFA) al 16% (v/v)	Microscopia elettronica Scienze	15710	La qualità della microscopia del PFA garantisce le migliori immagini. Se si utilizza "PFA fatto in casa", filtrare prima dell'uso.
l'albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A3059	Frazione di shock termico, per evitare precipitazioni/fondo.
Coverglass #1, rotondo da 18 mm (vetrini)	Neuvitro	NC0308920	I vetrini coprioggetti devono essere puliti e sterilizzati prima dell'uso, con HCl o etanolo.
DMEM, Alto glucosio [(+) 4,5 g/L D-glucosio, (+) L-glutammina, (-) Piruvato di sodio]	Gibco	11965118	Adattare i terreni di coltura alle esigenze della linea cellulare utilizzata.
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144	PBS per la coltura dei tessuti.
Glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N′,acido n′-tetraacetico (EGTA)	Research Products International	E57060	Tampone di estrazione nucleare.
Siero fetale bovino (FBS)	Life Technologies	104370028	La qualità dell'FBS può essere valutata testando la formazione di focolai di gH2AX. Se nel lotto sono presenti tracce di endotossina genotossica, gH2AX sarà positivo in assenza di stress.
Cloruro di magnesio (MgCl2)Research	Products International	M24000	Tampone di estrazione nucleare.
Piperazina-N,N′-bis(acido 2-etansolfonico) (PIPES)	Research Products International	P40150	Tampone di estrazione nucleare.
supporto SlowFade Diamond Antifade con DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI con mezzo di montaggio VECTASHIELD Antifade.
Cloruro di sodio (NaCl)	Research Products International	S23020 Tampone	di estrazione nucleare.
Sucrose	Research Products International	S24060 Tampone	di estrazione nucleare.
i vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015	vetrini in polisina.
Piastre a pozzetti multipli trattate con TC, dimensione 12 pozzetti Costar		3513	La semina sui vetrini coprioggetti avviene in una piastra a 12 pozzetti.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Tampone di estrazione nucleare.
l'enzima TrypLE Express (1X), senza fenolo rosso	Gibco	12604021	tripsina-EDTA.
Tripsina-EDTA (0,5%), senza Gibco rosso fenolo		15400054	TrypLE possono essere utilizzati.

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